肝細胞死亡的基礎(chǔ)與臨床研究

1、肝細胞死亡的基礎(chǔ)與臨床研究肝細胞死亡的基礎(chǔ)與臨床研究同濟醫(yī)院感染性疾病研究所同濟醫(yī)院感染性疾病研究所同濟醫(yī)院感染科同濟醫(yī)院感染科寧琴寧琴 教授教授 內(nèi)容內(nèi)容肝細胞死亡的模式肝細胞死亡的模式肝細胞死亡與肝臟疾病肝細胞死亡與肝臟疾病 肝細胞死亡的調(diào)控肝細胞死亡的調(diào)控 結(jié)論結(jié)論1234 凋亡凋亡啟動原因啟動原因 死亡受體死亡受體/配體配體 dna損傷損傷 生長因子缺乏生長因子缺乏主動過程主動過程程序性細胞死亡程序性細胞死亡 壞死壞死繼發(fā)于繼發(fā)于 重型病毒性肝炎重型病毒性肝炎 缺血缺血/再灌注損傷再灌注損傷 急性藥物性肝炎急性藥物性肝炎被動過程被動過程 顯著的炎癥反應(yīng)顯著的炎癥反應(yīng) 肝細胞死亡的模式肝

2、細胞死亡的模式 肝細胞死亡肝細胞死亡 細胞壞死與凋亡的形態(tài)區(qū)別細胞壞死與凋亡的形態(tài)區(qū)別 舊觀點舊觀點n凋亡與壞死被認為是兩種截然不同的現(xiàn)象凋亡與壞死被認為是兩種截然不同的現(xiàn)象 新觀點新觀點n凋亡與壞死是源于相同啟動因素和信號轉(zhuǎn)導途凋亡與壞死是源于相同啟動因素和信號轉(zhuǎn)導途徑的不同的細胞死亡方式，而徑的不同的細胞死亡方式，而線粒體功能損傷線粒體功能損傷在這一過程中起到關(guān)鍵的連接作用。在這一過程中起到關(guān)鍵的連接作用。 線粒體是細胞生命活動的控制中心線粒體是細胞生命活動的控制中心 氧化磷酸化中心 細胞凋亡調(diào)控中心 細胞呼吸鏈中心線粒體線粒體凋亡存在兩條不同的信號傳導途徑凋亡存在兩條不同的信號傳導途徑一

3、類細胞中含有足夠的一類細胞中含有足夠的caspase8可被經(jīng)典的死亡受體可被經(jīng)典的死亡受體活化，直接激活效應(yīng)活化，直接激活效應(yīng)caspase；另一類細胞其死亡受體介導的另一類細胞其死亡受體介導的caspase8活化不能達到活化不能達到很高的水平，凋亡信號需要借助線粒體途徑來放大，很高的水平，凋亡信號需要借助線粒體途徑來放大，而而細胞色素細胞色素c的釋放的釋放是這一途徑的關(guān)鍵步驟。是這一途徑的關(guān)鍵步驟。 線粒體在凋亡中的作用線粒體在凋亡中的作用 缺血再灌注，肝細胞毒素（缺血再灌注，肝細胞毒素（n-乙乙酰苯醌亞胺酰苯醌亞胺 napqi ，膽酸，死亡受，膽酸，死亡受體活化等）體活化等） 集中作用于線

4、粒體，導集中作用于線粒體，導致其膜透化。致其膜透化。 bcl2家族成員包括家族成員包括caspase 8 活活化形成的化形成的tbid,導致外膜透化。其透導致外膜透化。其透化可能包括外膜通道的形成或是線化可能包括外膜通道的形成或是線粒體腫脹破裂后誘導粒體腫脹破裂后誘導mpt。 其他應(yīng)激因素可直接導致其他應(yīng)激因素可直接導致mpt.膜膜透化后，細胞色素透化后，細胞色素c釋放相繼激活釋放相繼激活caspase 9 和和caspase 3，從而誘導從而誘導細胞凋亡細胞凋亡 。而由于線粒體功能的嚴。而由于線粒體功能的嚴重異常，重異常，atp減少，減少，caspase 活化活化被阻斷則會發(fā)生壞死被阻斷則會

5、發(fā)生壞死。壞死和凋亡是線粒體透化的不同結(jié)果壞死和凋亡是線粒體透化的不同結(jié)果肝細胞死亡與肝臟疾病肝細胞死亡與肝臟疾病死亡受體死亡受體/配體誘導的肝細胞損傷配體誘導的肝細胞損傷1穿孔素穿孔素/顆粒酶誘導的肝細胞損傷顆粒酶誘導的肝細胞損傷2缺血缺血/缺氧誘導的肝細胞損傷缺氧誘導的肝細胞損傷3膽酸誘導的肝細胞損傷膽酸誘導的肝細胞損傷4藥物誘導的肝細胞損傷藥物誘導的肝細胞損傷51.死亡受體死亡受體/配體誘導的肝細胞損傷配體誘導的肝細胞損傷目前認為在肝臟中發(fā)揮重要作用的死亡受體主要包括目前認為在肝臟中發(fā)揮重要作用的死亡受體主要包括fas、tnfr1及及trail-r1/r2，后者與它們相應(yīng)的配體，后者與它

6、們相應(yīng)的配體fasl、tnf和和trail結(jié)合后可誘導受體發(fā)生寡聚化并活結(jié)合后可誘導受體發(fā)生寡聚化并活化其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域，與相應(yīng)的連接蛋白相互作用進化其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域，與相應(yīng)的連接蛋白相互作用進而觸發(fā)凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。而觸發(fā)凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。1.死亡受體死亡受體/配體誘導的肝細胞損傷配體誘導的肝細胞損傷fas/fasl誘導的肝細胞損誘導的肝細胞損傷傷trailr/trail誘導的肝誘導的肝細胞損傷細胞損傷tnfr1/tnf誘導的肝細誘導的肝細胞損傷胞損傷1）fas/fasl誘導的肝細胞損傷誘導的肝細胞損傷fas在肝實質(zhì)細胞、血竇內(nèi)皮細胞、星狀細胞及枯否氏在肝實質(zhì)細胞、血竇內(nèi)皮細胞、星狀細胞及枯

7、否氏細胞上具有廣泛的表達。細胞上具有廣泛的表達。 自然殺傷細（自然殺傷細（nk）和細胞毒性）和細胞毒性t淋巴細胞（淋巴細胞（ctl）可通）可通過分泌過分泌fasl啟動凋亡程序來清除病毒感染啟動凋亡程序來清除病毒感染 的肝細胞或的肝細胞或腫瘤細胞。腫瘤細胞。nk細胞殺傷自身肝細胞的機制細胞殺傷自身肝細胞的機制hepatology. 2004j exp med. 2007hepatology. 2007ctl細胞對肝細胞的殺傷作用細胞對肝細胞的殺傷作用1）fas/fasl誘導的肝細胞損傷誘導的肝細胞損傷 研究發(fā)現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn) 乙型、丙型病毒性肝炎患者乙型、丙型病毒性肝炎患者體內(nèi)可溶性體內(nèi)可溶性fas的

8、表達有所增加，且表達水的表達有所增加，且表達水平與疾病活動度及治療應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。平與疾病活動度及治療應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。 當當hcv特異性的特異性的fasl表達的表達的ctl被動移植至穩(wěn)定表達被動移植至穩(wěn)定表達hcv結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白的小鼠體內(nèi)后，小鼠肝細胞出現(xiàn)損傷，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（小鼠體內(nèi)后，小鼠肝細胞出現(xiàn)損傷，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alt）水平升高。）水平升高。在在hbv轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因小鼠中，中，hbv特異性特異性ctl也能導致急性肝損傷甚至肝衰竭也能導致急性肝損傷甚至肝衰竭 酒精性肝炎患者酒精性肝炎患者的血清中可以發(fā)現(xiàn)其可溶性的血清中可以發(fā)現(xiàn)其可溶性fas的表達也是上調(diào)的的表達也是上調(diào)的 酒精和酒

9、精和hcv病毒可在病毒可在fas信號轉(zhuǎn)導途徑誘導的肝臟損傷中發(fā)揮協(xié)同作用信號轉(zhuǎn)導途徑誘導的肝臟損傷中發(fā)揮協(xié)同作用 非酒精性脂肪肝患者非酒精性脂肪肝患者中，其中，其fas的表達和肝細胞凋亡的發(fā)生也是增加的。的表達和肝細胞凋亡的發(fā)生也是增加的。 fas誘導的凋亡在誘導的凋亡在暴發(fā)性肝衰竭暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展中也占有一席之地的發(fā)生發(fā)展中也占有一席之地 2）trailr/trail誘導的肝細胞損傷誘導的肝細胞損傷 研究發(fā)現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)病毒性肝炎患者病毒性肝炎患者中其血清中其血清trail的表達水平顯著增高；的表達水平顯著增高；小鼠肝細胞在病毒感染小鼠肝細胞在病毒感染后也能誘導上調(diào)后也能誘導上調(diào)trail

10、的表達，的表達，通過通過trailr/trail途徑誘導感染肝細胞的凋亡。途徑誘導感染肝細胞的凋亡。fas 和和 trail 受體信號受體信號fas 和和trail 的死亡誘導信號復的死亡誘導信號復合物合物 (disc) 類似類似. trailr1/trail-r2或或fas 與其與其配體配體 trail或或fasl結(jié)合后，通結(jié)合后，通過與死亡結(jié)構(gòu)域過與死亡結(jié)構(gòu)域(dd)的同型反應(yīng)的同型反應(yīng)招募調(diào)節(jié)蛋白招募調(diào)節(jié)蛋白fadd。fadd 包含死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域包含死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(ded)，可招募并分裂，可招募并分裂procaspase 8 和和10, 使其活化。使其活化。caspase 8 將將bid

11、分裂為分裂為tbid，致使線粒體透化，功能失常和凋致使線粒體透化，功能失常和凋亡。亡。3）tnfr1/tnf誘導的肝細胞損傷誘導的肝細胞損傷正常肝細胞中正常肝細胞中tnfr1的表達水平很低，但的表達水平很低，但各種急慢性肝各種急慢性肝臟疾病中臟疾病中，tnfr1會在肝實質(zhì)細胞、血竇內(nèi)皮細胞和炎會在肝實質(zhì)細胞、血竇內(nèi)皮細胞和炎性浸潤細胞中性浸潤細胞中大量表達大量表達。除了誘導凋亡途徑，除了誘導凋亡途徑，tnf還能通過還能通過nfb依賴的基因表依賴的基因表達途徑達途徑促進肝細胞的增殖促進肝細胞的增殖，在部分肝切除后肝細胞的再，在部分肝切除后肝細胞的再生中起重要作用。生中起重要作用。 tnfr表達過

12、量時會導致肝細胞損傷加劇而肝臟再生失敗。表達過量時會導致肝細胞損傷加劇而肝臟再生失敗。 3）tnfr1/tnf誘導的肝細胞損傷誘導的肝細胞損傷在在肝臟移植肝臟移植中，供體與受體的中，供體與受體的tnfr1發(fā)揮相反的效應(yīng)，發(fā)揮相反的效應(yīng)，表現(xiàn)為供體表現(xiàn)為供體tnfr1的缺陷可加劇移植物的損傷，而受的缺陷可加劇移植物的損傷，而受體體tnfr1缺陷時肝損傷有所緩和且炎性細胞浸潤減少。缺陷時肝損傷有所緩和且炎性細胞浸潤減少。在在酒精性肝炎患者酒精性肝炎患者中，其血清中，其血清tnf和和tnfr1的水平的水平均上升并與死亡率相關(guān)。均上升并與死亡率相關(guān)。病毒性肝炎患者病毒性肝炎患者中，其中，其tnf的水平

13、與治療應(yīng)答反應(yīng)呈的水平與治療應(yīng)答反應(yīng)呈負相關(guān)。負相關(guān)。 tnfa a受體介導的信號受體介導的信號tnf與與tnfr結(jié)合后，與結(jié)合后，與tradd, rip, traf-2共同形成共同形成complex i，激活，激活 nfkb 和和jnk. nfkb 激活某些激活某些survival gene(包括抗凋亡蛋白包括抗凋亡蛋白c-flip, iaps, bcl-xl和和 a1)的轉(zhuǎn)錄。的轉(zhuǎn)錄。 complex i 經(jīng)過修飾和內(nèi)化形成經(jīng)過修飾和內(nèi)化形成complex ii (disc) ,后通過與后通過與dd的相互作用及激活的相互作用及激活procaspase 8來招募來招募fadd（fas相關(guān)死亡

14、結(jié)構(gòu)域）。活化的相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域）。活化的 caspase 8 將將bid （促凋亡蛋白）分裂為（促凋亡蛋白）分裂為 tbid, 轉(zhuǎn)移至線粒體后導致其透化，功轉(zhuǎn)移至線粒體后導致其透化，功能障礙及凋亡。能障礙及凋亡。2.穿孔素穿孔素/顆粒酶誘導的肝細胞損傷顆粒酶誘導的肝細胞損傷 穿孔素穿孔素(perforin)主要存在于主要存在于ctl和和nk細胞的細胞的胞漿中胞漿中,是是ctl和和nk細胞發(fā)揮細胞毒效應(yīng)的另一細胞發(fā)揮細胞毒效應(yīng)的另一重重要途徑。要途徑。 2.穿孔素穿孔素/顆粒酶誘導的肝細胞損顆粒酶誘導的肝細胞損傷傷穿孔素可在靶細胞膜上形穿孔素可在靶細胞膜上形成跨膜孔道成跨膜孔道 1）引起細胞滲透

15、性改）引起細胞滲透性改 變、鈣離子內(nèi)流和能變、鈣離子內(nèi)流和能 量的耗竭，導致靶細量的耗竭，導致靶細 胞融解和細胞死亡。胞融解和細胞死亡。 2）穿孔素形成的跨膜通）穿孔素形成的跨膜通 道可以使顆粒酶道可以使顆粒酶 （granzyme）進入靶）進入靶 細胞，顆粒酶進一步細胞，顆粒酶進一步 通過蛋白水解激活通過蛋白水解激活 caspase家族的某些家族的某些 成員觸發(fā)成員觸發(fā)caspase級級 聯(lián)反應(yīng)，導致靶細胞聯(lián)反應(yīng)，導致靶細胞 凋亡。凋亡。 2.穿孔素穿孔素/顆粒酶誘導的肝細胞損傷顆粒酶誘導的肝細胞損傷 研究發(fā)現(xiàn)，穿孔素在慢性乙肝肝細胞損傷中研究發(fā)現(xiàn)，穿孔素在慢性乙肝肝細胞損傷中發(fā)發(fā)揮了重要的作

16、用，也是慢性丙肝患者肝細胞損傷揮了重要的作用，也是慢性丙肝患者肝細胞損傷的主要效應(yīng)分子。的主要效應(yīng)分子。 3.缺血缺血/缺氧誘導的肝細胞損傷缺氧誘導的肝細胞損傷 1.1.缺血缺血- -再灌注損傷再灌注損傷 2.2.免疫凝血途徑誘導的肝細胞壞死免疫凝血途徑誘導的肝細胞壞死1）缺血）缺血-再灌注損傷再灌注損傷發(fā)生于肝臟的缺血發(fā)生于肝臟的缺血-再灌注損傷可分為兩個階段再灌注損傷可分為兩個階段:第一階段第一階段 反映了直接的肝細胞損傷。反映了直接的肝細胞損傷。第二階段第二階段 涉及到天然免疫系統(tǒng)的激活，特別是缺血后肝涉及到天然免疫系統(tǒng)的激活，特別是缺血后肝 臟枯否氏細胞的活化，以及中性粒細胞、淋巴臟枯

17、否氏細胞的活化，以及中性粒細胞、淋巴 細胞的炎性浸潤。細胞的炎性浸潤。缺血缺血-再灌注損傷再灌注損傷在肝細胞的體外熱缺血在肝細胞的體外熱缺血-再灌注損傷模型中再灌注損傷模型中 ，肝細胞急劇腫脹壞死。肝細胞急劇腫脹壞死。 體內(nèi)肝臟發(fā)生缺血體內(nèi)肝臟發(fā)生缺血-再灌注損傷后，其急性階再灌注損傷后，其急性階段也主要表現(xiàn)為肝細胞的壞死段也主要表現(xiàn)為肝細胞的壞死。 缺血缺血-再灌注損傷再灌注損傷其他觀點其他觀點 缺血缺血-再灌注損傷后，肝細胞的凋亡和壞死是再灌注損傷后，肝細胞的凋亡和壞死是并存的，損傷的強度和持續(xù)時間決定了細胞的并存的，損傷的強度和持續(xù)時間決定了細胞的死亡方式，即嚴重的損傷會導致早期發(fā)生的肝

18、死亡方式，即嚴重的損傷會導致早期發(fā)生的肝細胞壞死，而輕度的損傷則發(fā)生延遲的凋亡反細胞壞死，而輕度的損傷則發(fā)生延遲的凋亡反應(yīng)應(yīng)。 serine 89fgl2凝血酶原酶凝血酶原酶 屬于纖維蛋白原超屬于纖維蛋白原超家族，由活化巨噬家族，由活化巨噬細胞或內(nèi)皮細胞產(chǎn)細胞或內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，可直接催化凝生，可直接催化凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钛冈D(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘哪福瑥亩缘哪?，從而快速啟動凝血過程，快速啟動凝血過程，促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，促化為纖維蛋白，促進血栓形成。進血栓形成。domain1 n-terminal linear procoagulantdomain 2 c-termi

19、nal globular fred免疫凝血途徑誘導的肝細胞壞死免疫凝血途徑誘導的肝細胞壞死 免疫凝血途徑誘導的肝細胞壞死免疫凝血途徑誘導的肝細胞壞死 系列研究發(fā)現(xiàn)，活化巨噬細胞（內(nèi)皮細胞）系列研究發(fā)現(xiàn)，活化巨噬細胞（內(nèi)皮細胞）/fgl2凝血酶原酶介導的免疫凝血途徑可通過凝血酶原酶介導的免疫凝血途徑可通過促進肝臟纖維素沉積和微血栓形成引發(fā)肝臟的促進肝臟纖維素沉積和微血栓形成引發(fā)肝臟的微循環(huán)障礙，最終肝細胞微循環(huán)障礙，最終肝細胞 缺血缺氧，缺血缺氧，atp合成合成障礙而觸發(fā)肝細胞壞死的發(fā)生。障礙而觸發(fā)肝細胞壞死的發(fā)生。 j virol, 1997, j immunol 1998, j clin i

20、nvest 2003, 中華醫(yī)學雜志 w j g 2006, human gene therapy 2006，中化肝臟病雜志，j biol chem. 1999, and j biol chem 2003 kupffer cells/macrophagesfulminant viral hepatitisapoptosisnecrosiscoagulatoin activationfgl2 prothrombinaseifn hcfaslcaspase cascadeinflammation cytokinesfas ctlvirusvagtcr肝內(nèi)枯否氏細胞、內(nèi)皮細胞肝內(nèi)枯否氏細胞、內(nèi)皮細胞

21、fgl2高表達，高表達，是暴發(fā)性肝炎肝細胞壞死的重要機制是暴發(fā)性肝炎肝細胞壞死的重要機制膽酸誘導的肝細胞損傷膽酸誘導的肝細胞損傷體外細胞培養(yǎng)體系中，毒性膽鹽可以通過體外細胞培養(yǎng)體系中，毒性膽鹽可以通過fas或或trail依賴的途徑引起依賴的途徑引起肝細胞凋亡肝細胞凋亡。 在急性膽汁淤積的發(fā)生中，在急性膽汁淤積的發(fā)生中，fas及其他信號途及其他信號途徑也能導致嚴重的線粒體功能障礙及徑也能導致嚴重的線粒體功能障礙及atp的耗的耗竭，促進竭，促進細胞壞死細胞壞死的發(fā)生。的發(fā)生。 藥物誘導的肝細胞損傷藥物誘導的肝細胞損傷在美國對乙酰氨基酚的過量使用是造成急性藥物性肝在美國對乙酰氨基酚的過量使用是造成急性藥物性肝損傷的主要原因損傷的主要原因 肝細胞凋亡與壞死共存于對乙酰氨基酚誘導的肝損傷：肝細胞凋亡與壞死共存于對乙酰氨基酚誘導的肝損傷： 1）當藥物造成了）當藥物造成了atp的完全耗竭，肝細胞壞死發(fā)的完全耗竭，肝細胞壞死發(fā)生；生； 2）當）當d-果糖與甘氨酸的運用減緩了果糖與甘氨酸的運