免疫組化知識

1、免疫組織化免疫組織化學(xué)        免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）又稱免疫細胞化學(xué)。它 是組織化學(xué)的分支，它是用標記的特異性抗體（或抗原）對組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進行組織和細胞原位檢測技術(shù)。1發(fā)展簡史1941年coons 首先用熒光素標記抗體檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲得成功。60年代nakane建立酶標抗體技術(shù)鐵蛋白標記ab技術(shù)。70年代stemberger 改良上述技術(shù)，建立辣根過氧化物酶抗體過氧化物酶（pap）技術(shù)，使免疫細胞化學(xué)得到廣泛應(yīng)用。 80年代 hsu 等建立了抗生物素

2、生素（abc）法之后，免疫金銀染色法、半抗原標記法、免疫電鏡技術(shù)相繼問世。 90年代  分子雜交技術(shù)、原位雜交技術(shù)、免疫細胞化學(xué)分類方法迅速發(fā)展。2000年  各種免疫組化技術(shù)更加成熟，使免疫組化技術(shù)成為當今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項有力工具。其應(yīng)用范圍深達醫(yī)學(xué)各個學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之一。2免疫組織化學(xué)的技術(shù)分類（1）根據(jù)染色方式分成：貼片染色；漂浮染色。（2）根據(jù)agab結(jié)合方式分成：直接法；間接法；多層法。（3）按標記物的性質(zhì)分成：免疫熒光技術(shù)（免疫熒光法）；免疫酶技術(shù)（酶標抗體法、橋法、pad法、abc法）；免

3、疫金屬技術(shù)（免疫鐵蛋白法、免疫金染色法、蛋白a金法）。3標記物（1）必要性：組織細胞內(nèi)agab結(jié)合反應(yīng)一般是不可見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標記物。（2）常用標記物          熒光素：最常用的是異硫一氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，fitc） 熒光顯微鏡下呈綠色熒光四乙基羅達明（rhodamine rb200）熒光顯微鏡下發(fā)橙紅色熒光；         &#

4、160;酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶。          生物素：（biotin）          鐵蛋白金等：主要應(yīng)用于免疫電鏡。       其他：如同位素（因涉及污染和防護難一般不用）4應(yīng)用        凡是組織細胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì)，如

5、肽類、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子、受體、表面抗原等等均可用免疫組織化學(xué)方法顯示，因而目前在基礎(chǔ)與臨床科研中被廣泛應(yīng)用。最近幾年，分子生物學(xué)研究異常活躍，但最終還要歸到形態(tài)上來。用免疫組織化學(xué)方法對所研究的大分子分子進行定位，進而深入研究其功能。 一、免疫組織化學(xué)技術(shù)（一）染色方法1直接法       熒光素直接標記特異性抗體（抗）上，標記抗體與抗原結(jié)合（在切片上）熒光顯微鏡下觀察檢測抗原。   酶標抗體要顯示后鏡檢。      

6、直接法優(yōu)點：簡單，時間短，特異性強。缺點：靈敏度低，所需抗體量大（不經(jīng)濟）。應(yīng)用：基本不用了！2間接法        熒光素標記在二抗上（二抗：抗產(chǎn)生一抗動物的 igg抗體）。顯色后鏡檢        特點：較直接法靈敏，可標記一種抗體鑒定多種抗原。      3非標記ab橋法：       “橋法”是酶標記

7、抗體的改進，經(jīng)過三次抗體，其二抗為未標記橋抗體。（1）單橋法                (2)雙橋法       在三抗之后，將二抗和三抗再重復(fù)一次，可增大染色強度。特別提示：注意動物種屬關(guān)系4pap法（過氧化物酶抗過氧化物酶法        peroxidase antiperoxi

8、dase method， pap法） 是橋法的改良，既先形成pap復(fù)合物抗原抗體抗igg抗體pap復(fù)合物。         該法簡化了操作步驟，提高了靈敏度，所染標本可長期保存。 5abc法（親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物法，avidinbiotinperoxidase complex   method，abc法）   avidin：  親和素，一種糖蛋白，其上有4個與生物素相結(jié)合的位點。  

9、60;biotin ： 生物素維生素h，兩者親和力巨大，牢不可破。abc法與pap法的區(qū)別是：以abc復(fù)合物代替pap復(fù)合物。（1）abc復(fù)合物的制備：      （2）abc法反應(yīng)原理         6sp或sap法（過氧化物酶標記的鏈霉卵白素或過氧化物酶標記的堿性磷酸酶染色）streptavidin/peroxidase or strepta-vidin/alkaline phosphatase）   

10、0;    該法是abc法基礎(chǔ)上的進一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結(jié)合，而后再結(jié)合po 。它有4個亞基可與生物素結(jié)合，靈敏特異，背景低，成本低。        現(xiàn)在還有plus盒。優(yōu)點是：更簡便，放大倍數(shù)，等電點中性更適合組織。分子量小，穿透力，原理保密。 7蛋白a金法（proteina gold method）      多用于電鏡8雙重組化染色法    &

11、#160;   應(yīng)用雙重免疫組織化學(xué)激素可在同一張切片，同一細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)同時顯示兩種不同的抗原。9免疫金銀染色法（immunogoldsilver staining  igss） （二）固定注意事項：1固定劑的選擇：因組織而不同，注意質(zhì)量和性能。2固定方式的選擇：  浸漬固定                    

12、;                  灌注固定                               &

13、#160;      蒸汽固定 （三）免疫組化染色步驟（以abc法為例）1切片脫蠟入水，入pas 洗三次/15分鐘。2封閉內(nèi)源性過氧化物酶。   用新配置的0.3h2o2 （在pas或0.05tris-hcl緩沖液ph7.6中或甲醇中）室溫，30 min。3水洗，入pbs，洗三次，每次5分鐘。4減少非特異性著色。用稀釋20倍的正常血清（產(chǎn)生二次抗體動物血清?。?，室溫，30分鐘。5滴加第一抗體，4過液或室溫51 hour。60.1mpbs，洗三次，每次5分鐘。7滴加第二抗體，室溫15 &

14、#160;60。80.1mpbs 洗凈，洗三次，每次5分鐘。9滴加abc復(fù)合物，室溫1560分鐘。100.1mpbs 洗三次，每次5分鐘。110.05m tris hcl 510分鐘，此步可省略。12dabh2o2 顯色：用0.01h2o2的dab溶液，室溫530分鐘，隨時鏡檢（dab用時新配）13自來水洗凈。14用mayer 蘇木精或0.5甲基綠，復(fù)染胞核（可不染）。15常規(guī)脫水、透明、封固、鏡檢。 結(jié)果：棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物代表抗原x的定位。 （四）免疫組化染色基本技術(shù)及注意事項1實驗計劃 根據(jù)課題的內(nèi)容選用動物，選用配套的ab。如abi鼠抗人的抗體，與其他種屬間無交叉，則不

15、能用其他動物，而且ab-必須是羊抗鼠，若pap法ab-必須來源于鼠，否則不能連接成復(fù)合物。 若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面最好貼于同一張載片上，否則無可比性。 選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。 2ab稀釋度  （如系購買的藥盒有工作液和原液）（1）工作液：無須稀釋（2）原液：   應(yīng)參照其提供的工作液濃度進行預(yù)試驗驗。        如：工作液濃度為11000， 可選1500，11000，11500試驗；  &

16、#160;     若: 1500有背景，11000陽性反應(yīng)稍淺，可選1750進行試驗。原液的保存（20）凍存應(yīng)選最佳稀度凍存。若工作濃度大于1500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10l/瓶凍存（-20 ）于冰箱備用。關(guān)于ab保存應(yīng)參照說明書。（3）ab濃度的選擇        ab濃度不可太高或太低，因為ag-ab結(jié)合需在一定濃度范圍內(nèi)進行，若一方過剩則形成復(fù)合物小且少；極過剩時已形成的復(fù)合物亦會解體而呈現(xiàn)假陰性。并非ab濃度越高越好。 3ab滴片技術(shù)&

17、#160; 所滴的抗體應(yīng)與切片上的組織剛好吻合。注意滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。  要領(lǐng)：甩凈組織周圍的水。 4pbs洗滌技術(shù)（1）洗滌的目的     保證離子濃度和ph值。     減少非特異反應(yīng)（平時ab不可靠很純）ab滴片圖示：     （2）方法：洗三次，每次5分鐘。 5ab孵育技術(shù)（1）必須在濕盒內(nèi)進行，以防抗體的蒸發(fā)和干片。（2）溫度與時間  4：過液，

18、16h；37：1 h  or  參考說明書 6光鏡控制顯色方法（1）室內(nèi)操作：注意溫度與時間的關(guān)系，室溫最宜5分鐘。（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。 （五）對照組和染色結(jié)果的評價免疫組化染色實驗組與對照組結(jié)果分析表例號陽性對照陰性對照替代對照實驗組結(jié)論1操作錯誤2非特異性反應(yīng)3±陰性對照含定位ag4陰性對照不含定位ag5受檢組織非特異性染色6受檢組織不含定位ag7受檢組織含定位ag        從表上可以看出，只有6，7實驗結(jié)果

19、有意義。15均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定ab的特異性or因ihc技術(shù)操作存在錯誤等而使實驗結(jié)果失去意義，必須重復(fù)實驗or換用ab。除上述對照結(jié)果分析之外，還必須從以下幾個方面綜合評價：1陽性染色特點  ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。（非特異性細胞與組織無區(qū)別）  染色強度不同：顏色深淺不一（非特異性染色彌散性均勻）2組織切片制作過程的影響  固定不良非特異性染色，顯示不均。  邊緣干燥非特異性染色（常見），加抗體時勿干片。3人工假象與特異性結(jié)果顯示不在同一平面上。陽性對照：   

20、;    用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學(xué)染色。對照切片呈陽性結(jié)果，標為陽性對照。陰性對照：        用確證不含已知抗原的標本作對照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對照。其實這只是陰性對照中的一種，陰性對照還應(yīng)包括空白、替代、吸收和抑制實驗。  染色失敗的幾種原因：（1）所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽性對照在內(nèi)。全部（）原因可能：     染色未完全嚴格按照操作步驟進行； 

21、60;   漏加一種抗體，或抗體失效；     緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉，抑制了酶的活性；     底物中所加h2o2 量少或失效；     復(fù)染或脫水劑使用不當（2）所有切片均呈陽性反應(yīng)，原因可能是：    切片在染色過程中抗體過濃，或干燥了。    緩沖液配置中未加氯化鈉和ph值不準確，洗滌不徹底。   

22、60;使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應(yīng)時間過長。    抗體溫育的時間過長。   h2o2 濃度過高，呈色速度過快。粘附劑太厚。（3）所有切片背景過深，原因可能是：    未加酶消化處理切片。    切片或涂片過厚。    漂洗不夠。    底物呈色反應(yīng)過久。    蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血。   &

23、#160;使用全血清抗體稀釋不夠。（4）陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應(yīng)。   最常見的原因是：標本的固定和處理不當。二、免疫電鏡技術(shù)        免疫電鏡技術(shù)又稱電子顯微鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)。是免疫細胞化學(xué)與電鏡技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，即在電鏡下對細胞內(nèi)抗原做定性或定量的研究。其中免疫鐵蛋白技術(shù)，免疫膠體金技術(shù)，免疫酶細胞化學(xué)技術(shù)等，皆為常用技術(shù)免疫細胞化學(xué)技術(shù)細胞水平（光鏡分辨率）電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)超微結(jié)構(gòu)水平（電鏡分辨率）（一）組織固定與取材要求：即要求保持良好的超微結(jié)構(gòu)

24、，又要求保持組織的ag性，固定的選擇不宜過強。常用：14多聚甲醛+1戊二醛           2過碘酸賴氨酸多聚甲醛液（plp）液（二）免疫染色1. 包埋前染色：即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應(yīng)陽性部位取出，修整成小塊，按常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定、脫水、包埋。優(yōu)點： 抗原不易被破壞，易于獲得良好的免疫反應(yīng)。             可在免疫反應(yīng)

25、陽性部位定位做超薄切片，檢出率。缺點：經(jīng)過一系列染色步驟，易損傷結(jié)構(gòu)。應(yīng)用：特別適用于含抗原量較少的組織。2.包埋后染色：        組織標本經(jīng)過固定脫水及樹脂包埋、制成超薄切片后，再進行免疫組化染色。由于是以貼在網(wǎng)上的超薄切片進行免疫染色，故又稱載網(wǎng)染色（on grid staining ）。優(yōu)點：   ultrastructure 保存良好。           

26、60;    超薄切片易穿透，可標記細胞任何部位。               方法簡便，（+）結(jié)果高度可重復(fù)性。               同一張切片上可進行多重免疫染色。缺點：  抗原活性可能減弱或消失。               樹脂中的組織不易進行免疫反應(yīng)。 3超薄冰凍切片：