丁醇生物合成

1、報(bào)告人：報(bào)告人：silla silla 異源重構(gòu)丁醇生物合成途徑提高其產(chǎn)量異源重構(gòu)丁醇生物合成途徑提高其產(chǎn)量提綱：提綱：背景背景三種丁醇生物合成途徑的異源重構(gòu)三種丁醇生物合成途徑的異源重構(gòu)總結(jié)與展望總結(jié)與展望1 14 42 2合成生物學(xué)的應(yīng)用研究合成生物學(xué)的應(yīng)用研究 3 3丁醇耐受性研究丁醇耐受性研究背景背景 隨著石化資源的枯竭，石油價(jià)格的不斷攀升，微生物發(fā)酵隨著石化資源的枯竭，石油價(jià)格的不斷攀升，微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇受到了人們的普遍關(guān)注。生產(chǎn)丁醇受到了人們的普遍關(guān)注。 丁醇的分子式：丁醇的分子式： 丁醇主要應(yīng)用丁醇主要應(yīng)用：溶劑、抗氧劑、增塑劑、合成藥物、精細(xì)溶劑、抗氧劑、增塑劑、合成藥物、精

2、細(xì)化工等化工等 國內(nèi)生產(chǎn)生物丁醇主要是以玉米為原料，利用丙酮丁醇梭國內(nèi)生產(chǎn)生物丁醇主要是以玉米為原料，利用丙酮丁醇梭菌菌(Clostridium acetobutylicum)發(fā)酵，其主要產(chǎn)物是丁醇、發(fā)酵，其主要產(chǎn)物是丁醇、丙酮和乙醇，含量比例約為丙酮和乙醇，含量比例約為 6：3：1，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱ABE發(fā)酵發(fā)酵 。背景背景傳統(tǒng)傳統(tǒng)ABEABE發(fā)酵丁醇生產(chǎn)的缺點(diǎn)發(fā)酵丁醇生產(chǎn)的缺點(diǎn) 成本過高，價(jià)格上對(duì)石油燃料沒有競(jìng)爭(zhēng)性成本過高，價(jià)格上對(duì)石油燃料沒有競(jìng)爭(zhēng)性 發(fā)酵菌株產(chǎn)總?cè)軇┹^低發(fā)酵菌株產(chǎn)總?cè)軇┹^低 發(fā)酵產(chǎn)物中丁醇比不高發(fā)酵產(chǎn)物中丁醇比不高 丁醇耐受性差丁醇耐受性差提高丁醇生產(chǎn)效率的有效技術(shù)手段提高丁醇

3、生產(chǎn)效率的有效技術(shù)手段分離篩選性能優(yōu)良的新菌種分離篩選性能優(yōu)良的新菌種過量表達(dá)菌株代謝網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)蛋白過量表達(dá)菌株代謝網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)蛋白敲除合成代謝副產(chǎn)物基因或轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白的基因敲除合成代謝副產(chǎn)物基因或轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白的基因利用利用合成生物學(xué)合成生物學(xué)的方法重建丁醇生物合成途徑的方法重建丁醇生物合成途徑應(yīng)用合成生物學(xué)應(yīng)用合成生物學(xué)異源重構(gòu)異源重構(gòu)丁醇合成途徑丁醇合成途徑在釀酒酵母中重構(gòu)在釀酒酵母中重構(gòu)在大腸桿菌中重構(gòu)在大腸桿菌中重構(gòu)在乳酸菌中重構(gòu)在乳酸菌中重構(gòu) Enzymes in black are from other organisms: AtoB, Escherichia coli; Erg10

4、, S. cerevisiae; PhaA, Ralstonia eutropha; PhaB, Ralstonia eutropha; Ccr,Streptomycescollinus.The red ones are from Clostridium beijerinckii.ThlHbdCrtBcdEtfAB AdhE2AdhE2lSteen E J, Chan R, Prasad N, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial C

5、ell Factoris, 2008, 7:36-43.1、Plasmids contain the 2 origin of replication, LEU2D or HIS3 genes for selection, the GAL1 or GAL10 promoters, and the CYC1, ADH1,or PGK1 transcription terminators. 2、The first three genes of the 1-butanol pathway were placed on the pESC-LEU2D plasmid and the last two or

6、 four (in the case of the etfAB, bcd bearing strain) genes were placed on the pESC-HIS3 plasmid.resultERG10，hbd phaA,phaBetfAB,bcd應(yīng)用合成生物學(xué)異源重構(gòu)丁醇合成途徑應(yīng)用合成生物學(xué)異源重構(gòu)丁醇合成途徑在釀酒酵母中重構(gòu)在釀酒酵母中重構(gòu)在大腸桿菌中重構(gòu)在大腸桿菌中重構(gòu)在乳酸菌中重構(gòu)在乳酸菌中重構(gòu)Reconstructing 1-butanol metabolic pathway in Escherichia coli lAtsumi S, Cann A F, Connor

7、M R, et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production. Metabolic Engeering, 2008, 10:305311.C. acetobutylicum thiolase, coded by thl, acetyl-CoA acetyltranserase from E. coli, coded by atoBAnzyme genes selectionbcd and etfAB, from M. elsdenii ccr, from S. coelicolorCCRbcd and

8、 etfAB, from C. acetobutylicum Anzyme genes selection磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶( PTA, pta)Corresponding genes knockout580mg/LResults應(yīng)用合成生物學(xué)異源重構(gòu)丁醇合成途徑應(yīng)用合成生物學(xué)異源重構(gòu)丁醇合成途徑在釀酒酵母中重構(gòu)在釀酒酵母中重構(gòu)在大腸桿菌中重構(gòu)在大腸桿菌中重構(gòu)在乳酸菌中重構(gòu)在乳酸菌中重構(gòu)Reconstructing n-butanol metabolic pathway in Lactobacillus brevisBerezina O V, Zakharova N V, Brand

9、 A t, et al. Reconstructing the clostridial n-butanol metabolic pathway in Lactobacillus brevis. Appllied Microbiol Biotechnol, 2010, 87:635646ThlHbdAdh丁醇耐受性研究丁醇耐受性研究Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coliGlobal transcription machinery engineering (gTME)is a novel method of directed evolut

10、ion for improving cellular phenotype.全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程 (gTME）技術(shù)正是通過基因工程方法技術(shù)正是通過基因工程方法改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子使整改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子使整個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程發(fā)生變化從個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程發(fā)生變化從而改變或提高目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)而改變或提高目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。錄及表達(dá)。Artificial transcription factors(ATFs)通常由通常由 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)結(jié)構(gòu)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域兩部分組成域兩部分組成, 研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以各自獨(dú)立發(fā)生作用?；谵D(zhuǎn)域可以各自獨(dú)立發(fā)生作用?；谵D(zhuǎn)錄因子

11、的這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)錄因子的這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 可以人為地可以人為地選擇針對(duì)特定序列的選擇針對(duì)特定序列的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與具有特定作用的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域構(gòu)域與具有特定作用的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域構(gòu)建人工轉(zhuǎn)錄因子。建人工轉(zhuǎn)錄因子。人工轉(zhuǎn)錄因子的人工轉(zhuǎn)錄因子的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域多為結(jié)合結(jié)構(gòu)域多為 C2H2 型鋅指結(jié)構(gòu)型鋅指結(jié)構(gòu)Developed novel artificial transcription factors (ATFs) composed of zinc finger (ZF) DNA-binding proteins, with distinct specificities, fused to

12、an E. coli cyclic AMP receptor protein (CRP)Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coliLee J Y, Yang K S, Jang S A, et al. Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coli With Artificial Transcription Factor Libraries. Biotechenology and Bioengeering, 2011, 108 (4): 742-749.Artificial transc

13、ription Factor LibrariesEliciting a Butanol-Tolerant PhenotypeSummary & Future work Using native enzymes/Heterologous expression of expression of the corr-esponding genesDeleting corresponding genes開發(fā)利用廉價(jià)開發(fā)利用廉價(jià)Feedstocks的工程的工程菌菌丁醇生物合成途徑已丁醇生物合成途徑已成功在多類細(xì)胞中重成功在多類細(xì)胞中重建建提高丁醇耐受性的提高丁醇耐受性的研究研究基因的優(yōu)化合基因的優(yōu)

14、化合提高丁醇產(chǎn)量提高丁醇產(chǎn)量已發(fā)現(xiàn)與丁醇耐已發(fā)現(xiàn)與丁醇耐受相關(guān)的基因受相關(guān)的基因利用利用CO2，纖維素水解糖纖維素水解糖參考其他耐受性研參考其他耐受性研究成果進(jìn)行更具體，究成果進(jìn)行更具體，深層研究深層研究尋找優(yōu)勢(shì)酶，尋找優(yōu)勢(shì)酶，酶基因序列人酶基因序列人工優(yōu)化工優(yōu)化細(xì)微調(diào)節(jié)細(xì)微調(diào)節(jié)尋找潛在宿主，尋找潛在宿主，構(gòu)建工程構(gòu)建工程Clostridium用合成生物學(xué)的用合成生物學(xué)的方法構(gòu)建利用廉方法構(gòu)建利用廉價(jià)價(jià)/寬泛原料工寬泛原料工程菌菌程菌菌Escherichia coli Saccharomyces cerevisiaeLactobacillus brevis Pseudomonas putida

15、Bacillus subtilis cyanobacteria主要參考文獻(xiàn)主要參考文獻(xiàn)lGreen E M. Fermentative production of butanolthe industrial perspective.Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22:337-343.lLee J Y, Yang K S, Jang S A, et al. Engineering Butanol-Tolerance in Escherichia coli With Artificial Transcription Factor Libraries

16、. Biotechenology and Bioengeering, 2011, 108 (4): 742-749.lBerezina O V, Zakharova N V, Brand A t, et al. Reconstructing the clostridial n-butanol metabolic pathway in Lactobacillus brevis. Appllied Microbiol Biotechnol, 2010, 87:635646.lAtsumi S, Cann A F, ConnorM R, et al.Metabolic engineering of Escherichia