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認證類型：個人認證

認證主體：徐**（實名認證）

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IP屬地：湖北 上傳時間：2021-11-15 格式：PPT 頁數(shù)：33 大?。?.40MB 積分：30 舉報 版權(quán)申訴

1、如何構(gòu)建質(zhì)?？寺∪绾螛?gòu)建質(zhì)?？寺≈茗櫻阒茗櫻?011.06.152011.06.15目的基因目的基因目的載體目的載體BaxpCMV-Sport 6EcoRBgl連接連接BaxBax基因至基因至EGFPEGFP載體載體 思路思路加入加入 EcoREcoR酶切位點酶切位點加入加入 BglBgl 酶切位點酶切位點連接連接酶切酶切目的基因目的基因兩側(cè)加入兩側(cè)加入酶切位點酶切位點MCS多克隆位點多克隆位點 BaxpCMV-Sport 6: Flag、 HA、 MycpCMVSPORT6 MCSGene： BAX MGC: 20956, IMAGE:4578562Insert site：EcoRI, Xh

2、oI 構(gòu)建過程構(gòu)建過程 設(shè)計引物設(shè)計引物 ( (增加酶切位點增加酶切位點, Bgl, EcoR, Bgl, EcoR) 目的基因目的基因PCRPCR 雙酶切載體雙酶切載體 (Bgl, EcoR(Bgl, EcoR) 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 DNA DNA 膠回收膠回收 ( ( 基因基因 , ,載體載體) ) 雙酶切目的基因雙酶切目的基因 (Bgl, EcoR(Bgl, EcoR) 目的基因與載體相連目的基因與載體相連 DH5DH5轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 鑒定鑒定第一步：第一步：設(shè)計目的基因設(shè)計目的基因PCRPCR引物引物目的：目的：1 1）通過）通過PCRPCR方法擴增目的基因方法擴增目的基因2 2）

3、在目的基因片斷兩端增加酶加位點）在目的基因片斷兩端增加酶加位點設(shè)計引物前需解決的問題設(shè)計引物前需解決的問題 1 1、選擇酶切位點、選擇酶切位點 2 2、選擇保護堿基、選擇保護堿基 3 3、終止密碼子、終止密碼子PEGFP MCS選擇酶切插入位點：選擇酶切插入位點：1、兩個酶切位點間隔、兩個酶切位點間隔遠遠2、目的基因序列中無、目的基因序列中無相應(yīng)酶切位點相應(yīng)酶切位點3、酶切緩沖液一致、酶切緩沖液一致BAX insert sequence atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgc

4、ttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt gccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccctgtgc

5、accaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctgaenzymeenzymeBAXBAXbufferbufferSal Sal 0 0XhoXho1 12,3,42,3,4EcoREcoR 0 01,2,3,41,2,3,4BamHBamH1 1Bg

6、lBgl 0 03 3PstPst0 0BclBcl0 0*DNAStar軟件軟件 - MapDraw功能功能AGATCT - Bgl buffer 3 GAATTC -EcoR I buffer 3AGATCT AGATCT 目的基因目的基因 CTTAAG CTTAAG PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物酶切位點保護堿基酶切位點保護堿基protection seqence: GGAAGATCTTCC 2h=25%, 20h90% CCGGAATTCCGG 2h90%, 20h90%切割率切割率保護堿基保護堿基: : 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶識別特定的識別特定的DNADNA序列，除此之外，酶蛋白還序列，除此

7、之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點兩邊的若干個堿基，這些堿基對內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到要占據(jù)識別位點兩邊的若干個堿基，這些堿基對內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNADNA雙鏈并發(fā)揮切割雙鏈并發(fā)揮切割DNADNA作用是有很大影響作用是有很大影響設(shè)計引物原則設(shè)計引物原則1. 1. 引物的長度一般為引物的長度一般為15-30 bp15-30 bp，常用的是，常用的是18-27 bp18-27 bp，引物序列的引物序列的GCGC含量一般為含量一般為40-60%40-60%2. 2. 引物所對應(yīng)模板位置序列的引物所對應(yīng)模板位置序列的TmTm值在值在7272左右可使復(fù)左右可使復(fù)性條件最佳性條件最佳3. 3. 避免引物二聚體及發(fā)夾

8、結(jié)構(gòu)避免引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)4. 4. 引物的特異性引物的特異性5. 5. 堿基隨機分布堿基隨機分布 cggcgg tgatggacgg gtccggggag cagcccagag gcggggggcc Primer1 ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG (length -21, GC%-71.8%, Tm-71.4) ggag tgctcaccgc ctcactcacc atctggaaga agatgggctg aggcccccag Primer2 TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG (length -25, GC%-52%, Tm-68.4)設(shè)計引物設(shè)計引物 Pr

9、imer 5Primer 5軟件軟件 引物中是否應(yīng)包含終止密碼子？引物中是否應(yīng)包含終止密碼子？加入保護堿基及酶切位點加入保護堿基及酶切位點 Primer 1 GGAAGATCT ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer 2 CCGGAATTC TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG MCSMCS與熒光相連的地方應(yīng)特別注意有無移碼與熒光相連的地方應(yīng)特別注意有無移碼調(diào)整開放閱讀框（調(diào)整開放閱讀框（ORF）熒光表達在前時熒光表達在前時(EGFP) Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCCC

10、ATCTTCTTCCAGATGGTG 因因TGA為終止密碼子，所以之后的移碼不需理會為終止密碼子，所以之后的移碼不需理會熒光表達在后時熒光表達在后時 (DsRed) Primer1 CCGGAATTCatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg熒光表達在后時需加熒光表達在后時需加KOZAKKOZAK 序列序列 Primer1 CCGGAATTCgccaccatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg KOZAK KOZAK 序列序列: : gc

11、cacc, 加在起始密碼子之前加在起始密碼子之前Primer final Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG33.5 uL dH2O10 uL phusion HF buffer1 uL dNTP(10mM)2.5uL primer forward/ reward 1uL BAX 1.5ul DMSO0.5uL phusion polymerase 50 uL 1. 98(1min)2. 98 (5s)3. 65(20s) 4. 72(20s)5. back to s

12、tep 2 for 25 times6. 72 (10min)7. 18 for ever第二步：第二步：PCRPCR目的基因目的基因PhusionPhusion超保真超保真PCRPCR試劑盒試劑盒Buffer3 : 2ulvector: 4ul100%BSA: 0.2ulEcoR : 1ulBgl: 2ulddH2O: 10.8ul37 4hEcoRBgl第三步：雙酶切載體第三步：雙酶切載體20ul第四步：瓊脂糖凝膠電泳、第四步：瓊脂糖凝膠電泳、凝膠回收凝膠回收 0.6% gel 6* loading buffer 50ul sample 80V 目的基因5kb2.5kb載體瓊脂糖濃度%DN

13、A分離范圍0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.23Buffer3 : 2ulBAX: 15ul100%BSA: 0.2ulEcoR : 0.5ulBgl: 1ulddH2O: 1.3ul37 4h第五步：雙酶切及回收目的基因第五步：雙酶切及回收目的基因20ulTAKARATAKARA片斷回收試劑盒片斷回收試劑盒第六步：回收效率驗證第六步：回收效率驗證5kb2.5kbLoading volume: 5ulFrom left to right:Marker: 15000bpEGFPBAX restrictionBAX PCRMarker:100bpT4 l

14、igase buffer : 2ulT4 ligase: 1ulBax: 3ul vector: 1ulddH2O: 13ulT4 ligase buffer : 2ulT4 ligase: 1ulBax : 6ul vector : 1ulddH2O: 10ulT4 ligase buffer : 2ulT4 ligase: 1ulBax : 10ul vector : 1ulddH2O: 6ul(1) (2) (3)16 過夜過夜第六步：連接第六步：連接載體載體100ng:100ng:100 x100 x目的基因分子量目的基因分子量載體分子量載體分子量X 4/110/1X 4/110/1目的基因的量為目的基因的量為: :第七步：轉(zhuǎn)化第七步：轉(zhuǎn)化 100ul DH5 + 20ul 連接產(chǎn)物第八步：驗證第八步：驗證 (1)(1) PCR1-1213-24Positive: 2,7,9,105.4 uL dH2O2 uL phusion HF buffer0.2 uL dNTP(10mM)0.5uL primer forward0.5 uL primer reward1uL 菌液稀釋液 0.3ul DMSO0.1uL phusion polymerase 10 uL 第八步：驗