真菌檢測方法

1、分離培養(yǎng)：無菌采取病料接種馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中，置37恒溫箱中培養(yǎng)24小時，長成絨毛樣菌絲，未見其它細菌生長。經48小時培養(yǎng)長成白色菌落。72小時菌落呈紐扣狀，由中心向外周逐漸變深，轉變成灰白色、灰綠色。取培養(yǎng)物鏡檢可見大量球形的分生孢子。通常人們把真菌和霉菌認為是一種病原的兩種說法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是眾多真菌中的一種。真菌是由單細胞或多細胞組成，按有性或無性方式進行繁殖的真核細胞類微生物。根據其侵犯人體的部位分為前部真菌和深部通常人們把真菌和霉菌認為是一種病原的兩種說法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是眾多真菌中的一種。真菌是由單細胞或多細胞組成，按有性或無性方式進行繁殖的真核細胞類微生物。

2、根據其侵犯人體的部位分為前部真菌和深部真菌，包括皮膚癬菌、孢子絲菌、念珠菌、曲霉菌、隱球菌、組織胞漿菌等。而霉菌多為細胞真菌的一種，也為深部感染真菌，包括煙曲菌、黃曲菌、黑曲菌、土曲菌等，常發(fā)生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影響預后。培養(yǎng)基的選擇應根據實驗材料和檢驗目的來確定。目前國標方法中使用的培養(yǎng)基有:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA),孟加拉培養(yǎng)基(RBC)、高鹽察氏培養(yǎng)基(CAO),其中PDA和RBC適合于一般的霉菌和酵母菌生長,而CAO則適合于高滲性霉菌生長,酵母菌幾乎不長。在日常檢測中我們發(fā)現,有些常見的耐高滲性霉菌,如局限曲霉、謝瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RB

3、C上生長非常緩慢或不長,而這些菌在高滲培養(yǎng)基如M40Y、DG18(M40Y瓊脂配方:蔗糖400g,麥芽提取汁20g,酵母提取汁5g,瓊脂20g,氯霉素50mg,蒸餾水1000ml;DG18瓊脂配方:葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5g,氯霉素0.1g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,PH6.5)上則正常生長,孢子、形態(tài)特征發(fā)育良好,而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生長,因此,若能同時采用PDA和M40Y(或DG18)分離培養(yǎng)各類樣品中的霉菌,將能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特別是對干燥食品、高糖食品、淹漬食品

4、等,更有必要同時采用M40Y或DG18。由于霉菌中很多種類不會產生有毒的霉菌毒素,危害較小,而有的菌株即使污染數量不多,但其產生的霉菌毒素卻危害較大,因此僅作霉菌計數并不能全面反映其危害程度,重要的是要知道污染菌的菌相,才能更好地判斷被污染食品的安全程度。為此,國外有些研究者設計出各類選擇性培養(yǎng)基,可以識別產毒的霉菌。如AFPA培養(yǎng)基(配方:酵母提取汁20g,蛋白胨10g,檸檬酸鐵銨0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,PH5.6)用于分離黃曲霉毒素產生菌高污染率的食品。產黃曲霉毒素的菌株黃曲霉和寄生曲霉在AFPA上30培養(yǎng)23天就形成背面有亮橙黃色的特征性

5、菌落,非常容易識別。有人利用該培養(yǎng)基分離黃曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了滿意的結果。因此,針對不同樣品,有目的地設計出相應的選擇性培養(yǎng)基,以篩選污染菌中的危險菌群,將是一個值得探索的方向。2接種方式接種方式主要有傾注法和涂布法兩種。目前國際方法中采用傾注法,但近來國際上有不少學者認為霉菌計數采用涂布法更合適。Beuchat和Matsuda等人分別對這兩種方法作了大量比較試驗后發(fā)現,對霉菌計數來說,涂抹法有以下幾方面優(yōu)越于傾注法:培養(yǎng)出的霉菌菌落數較多;培養(yǎng)所需的時間較短;霉菌孢子、菌落形態(tài)特征發(fā)育完全,便于鑒定。這是因為絕大多數霉菌是好氧的,在培養(yǎng)基表面生長快,發(fā)育好,而混在培養(yǎng)基中發(fā)育就

6、受影響,而且在培養(yǎng)基傾注時霉菌孢子易受熱損傷。我們在自己的實驗室也做了類似的比較試驗,通過對30種常見霉菌的試驗證實了上述的結論。因此,我們認為,霉菌計數采用涂布法既準確又省時,值得推廣。3培養(yǎng)溫度經對多種常見霉菌的最適生長溫度作了調查發(fā)現,大部分菌種的最適溫度為2530。但一些產曲霉毒素的菌株或動物致病菌則需要更高的溫度,如黃曲霉35、構巢曲霉33、煙曲霉37、小孢子菌35。因此,培養(yǎng)溫度也應根據培養(yǎng)目的而定,一般情況下都采用2528培養(yǎng),若有特殊培養(yǎng)目的,則應適當調節(jié)培養(yǎng)溫度。4培養(yǎng)時間我們對30種常見霉菌的生長速度作了調查,正常培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)34天的菌落數與57天的基本相同,但菌種的特

7、征不明顯,因此,如果只要作霉菌計數,培養(yǎng)34天已基本達到目的,但如果還要進一步分類鑒定,則需要培養(yǎng)更長的時間(714天)。必須特別注意的是,有幾類生長特別快、菌絲很多的菌,則必需在48小時以內計數,否則菌絲就會覆蓋整個平皿,無法準確計數。這類菌主要有:毛霉、根霉、犁頭霉、共頭霉、木霉等濕度較大的樣品,這類菌污染較多,檢測這類樣品,應提早觀察記錄。5最適計數范圍霉菌菌落由孢子和菌絲組成,相當擴散,在直徑9cm的平皿里,菌落數稍多就相互交叉重疊,影響計數,但數量太少又會產生較大的誤差,因此選擇適當的稀釋度計數是保證結果準確的關鍵環(huán)節(jié)之一。我們對這方面作了一些觀察研究,首先是將實驗菌株的斜面培養(yǎng)物制

8、成含有約106個/ml的孢子懸液,并用血球計數器在顯微鏡下準確計數,然后將飽子懸液作10-110-6倍稀釋,吸取不同稀釋度的稀釋液接種于PDA,25培養(yǎng)5天后計數。30種常見霉菌的兩種不同計數方法所得結果比較顯示,大部分菌株每平板含有1050個菌落的稀釋度時的計數與顯微鏡計數結果最接近;有近一半的菌株,每個平板含50100個菌落已較難計數,而大部分菌株,超過100個/平皿或小于10個/平皿的計數結果就與顯微計數結果存在較大差別,因此,應盡量選擇1050個/平皿的稀釋度進行霉菌計數。而對上述提及的菌絲很豐富、菌落特別擴散的毛霉、根霉、犁頭霉等菌株,則應在更少的范圍內計數(30個/平皿以內)。為控

9、制霉菌的生長速度和菌落的生長范圍,可在培養(yǎng)基中添加少量抗生素,如氯霉素(50100mg/L),金霉素(20100mg/L),慶大霉素(50mg/L),土霉素(100mg/L)等。6霉菌檢測過程中應特別注意的事項6.1由于霉菌檢測所需的時間較長,中間又需要多次觀察,因此實驗前一定要作好實驗計劃,明確觀察記錄的時間。6.2霉菌孢子通過空氣傳播,所以實驗時應保持實驗室平靜,減少空氣流通;操作時手腳要快,動作要輕,特別是培養(yǎng)過程中,如果觀察時動作過大,早期生長出的霉菌孢子就會在培養(yǎng)基內擴散,形成新的菌落,導致結果不準確。6.3實驗前應認真做好全面的消毒工作,包括操作人員手指、實驗室空間、實驗臺等,實驗

10、后應第一時間將有霉菌的培養(yǎng)物高壓滅菌,防止進一步擴散。6.4對使用的菌株的生理、生態(tài)、形態(tài)、毒理、致病性必需有充分的了解,并作好相應的防擴措施,防止污染其它物品。3.2.1 涂片鏡檢分別取l5 羽雞肺部或氣囊有結節(jié)的病料，將結節(jié)用2 片載玻片壓碎后分開，再用鑷子調勻，革蘭氏染色后蓋上蓋玻片，置高倍鏡下觀察。結果在暗視野下可見到大量的分隔菌絲， 氣囊上的結節(jié)除可見到菌絲外， 還可以見到散在的藍色球狀孢子。3.2.2 分離培養(yǎng)挑取典型病變結節(jié)接種于血液瓊脂平板培養(yǎng)基上，置于37 溫箱中培養(yǎng)。24 h 后可見到小米粒大小的白色絨毛狀菌落，48 h 后菌落增大，60 h 后轉為淡綠色，72 h 后菌落

11、轉為暗綠色，一個星期后呈黑褐色4。用接種環(huán)挑取菌落涂片鏡檢，可見到曲霉菌的形態(tài)結構（菌絲有隔，末端膨大成球狀，球上有小梗，有的梗上有孢子存在，狀如花冠），符合曲霉菌的特點。根據實驗室檢查結果再結合病史調查、現場觀察、臨床癥狀及剖檢變化，可確診為禽曲霉菌病。（一）直接檢查 是最簡單而重要方法，淺部感染真菌的病變標本如毛發(fā)、皮屑、甲屑置玻片上，滴加10%KOH，覆蓋玻片微熱熔化角質層，再將玻片壓緊，用吸水紙吸去周圍多余堿液，在顯微鏡下觀察，見皮屑甲屑中有菌絲，或毛發(fā)內部或外部有成串孢子，即可初步診斷為癬菌感染，但不能確定菌種。深部感染真菌標本如痰，腦脊液亦可做涂片用革蘭氏染色（白色念珠菌）或愚汁負

12、染色（隱球菌）觀察形態(tài)特征。 （二）培養(yǎng)檢查 本法可確定菌種，輔助直接檢查不足，通常用沙保氏培養(yǎng)基（2228），深部真菌可用血瓊脂或腦心葡萄糖血瓊脂37培養(yǎng)，或根據不同菌種運用不同培養(yǎng)基，如孢子絲菌可用胱氨酸血液葡萄糖瓊脂，必要時運用鑒別培養(yǎng)基和生化反應，同化試驗等進行鑒定。 （三）免疫學試驗 近年來有許多方法用于檢測深部感染真菌的抗體，作輔助診斷莢膜組織胞漿菌、念珠菌、曲霉菌。但系統(tǒng)性感染患者常因免疫功能降低不出現抗體；而且許多真菌間抗原性有交叉反應；有的產生抗體后維護時間較長，正常人群中有一定比例的陽性率，則必須結合臨床情況分析結果才能作出恰當的診斷。 由于上述檢測抗體受到許多因素的限制，

13、及深部真菌感染時，早期培養(yǎng)陽性率甚低，晚期則多于失去治療時機，因此用免疫學方法從血清或其他部位檢測真菌抗原，對早期診斷具有重要意義。如乳膠凝集法檢測新型隱球菌病患者的莢膜多糖抗原，ELISA法檢測白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原及免疫熒光法檢測孢子絲菌病患者的可溶性抗原等，均為早期，快速、特異的診斷方法。 （四）動物試驗 其些真菌對實驗動物有致病性，如皮炎芽生菌，球孢子菌可在小白鼠，豚鼠體內生長，白色念珠接種家兔小白鼠可發(fā)生腎臟膿腫致死。 四、防治原則 真菌感染尚無特異預防，主要注意公共衛(wèi)生和個人衛(wèi)生，碘化物治療孢子絲菌病、毛霉菌病有一定療效。制霉素、灰黃霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或內服過

14、癬癥和白色念珠菌病等有較好療效。近年服道5-氟胞嘧啶（5-FC）治療單細胞真菌感染療效顯著。二性霉素B可用于深部全身真菌感染。玻片培養(yǎng)又稱小培養(yǎng)，小培養(yǎng)法可以隨時觀察真菌的生長形態(tài)（如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等），還可以隨時觀察其生長發(fā)育的全部情況，有利于菌種的鑒定。 1、鋼環(huán)法 （1）材料：白假絲酵母菌、沙保弱培養(yǎng)基、玻片培養(yǎng)又稱小培養(yǎng)，小培養(yǎng)法可以隨時觀察真菌的生長形態(tài)（如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等），還可以隨時觀察其生長發(fā)育的全部情況，有利于菌種的鑒定。 1、鋼環(huán)法 （1）材料：白假絲酵母菌、沙保弱培養(yǎng)基、無菌玻片、蓋玻片、鋼環(huán)（帶有缺

15、 口）、石蠟。 （2）方法 用無菌鑷子取無菌小培養(yǎng)鋼環(huán)，環(huán)的兩面分別蘸取熔化的固體石蠟，平置于無菌載玻片上，另取一無菌蓋玻片，在酒精燈火焰上加熱后覆蓋于鋼環(huán)上，待冷后，小培養(yǎng)鋼圈即被固定于載玻片與蓋玻片之間。 用毛細滴管吸取融化的培養(yǎng)基，從鋼環(huán)上端孔注入，注入量占容積的1/2即可。 培養(yǎng)基冷卻凝固后，用接種針挑取材料，由上端孔接種于環(huán)內培養(yǎng)基上。 置濕盒內，室溫或37下培養(yǎng)23d后，逐日觀察，鏡下可連續(xù)看到真菌生長過程及菌絲、孢子等特征，一般7d左右即可長好。 也可不用小培養(yǎng)鋼環(huán)，直接將融化的培養(yǎng)基滴于無菌玻片上，待冷凝后從周邊接種材

16、料，用蓋玻片覆蓋后培養(yǎng)，在顯微鏡下連續(xù)觀察生長情況。 （3）結果：鏡下觀察可見到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌絲。 2、小塊瓊脂玻片培養(yǎng)法 用無菌操作法將制好的待用瓊脂平板用無菌接種針或接種環(huán)切成大約1cm2的方塊，將其放置于滅菌的載玻片上。將標本或待檢菌接種于瓊脂塊四周邊緣靠上方部位，然后用無菌鑷子取一無菌的蓋玻片蓋在瓊脂上。在無菌平皿內放入少量無菌水和一個無菌U形（或V形）玻璃棒。將此載玻片置于玻璃棒上，蓋上平皿蓋培養(yǎng)。每日用肉眼和顯微鏡觀察孢子和菌絲的特點。涂片找真菌標準操作規(guī)程 1檢驗目的：用革蘭染色找酵母樣菌，為臨床感染的初步診斷和用藥提供依據。2

17、適用范圍：各種涂片標本（主要如白帶等）3檢驗原理3.1真菌的染色結構如革蘭陽性菌細胞壁。3.2經過革蘭染色后變成紫色，體形較細菌大容1檢驗目的：用革蘭染色找酵母樣菌，為臨床感染的初步診斷和用藥提供依據。2適用范圍：各種涂片標本（主要如白帶等）3檢驗原理3.1真菌的染色結構如革蘭陽性菌細胞壁。3.2經過革蘭染色后變成紫色，體形較細菌大容易辨認。4試劑：4.1試劑廠家：珠海貝索生物科技公司4.2包裝規(guī)格：250ml×44.3試劑盒組成4.3.1龍膽紫（龍膽紫、乙醇）4.3.2碘溶液（碘、碘化鉀）4.3.3脫色液（丙酮、乙醇）4.3.4沙黃溶液（沙黃、乙醇）5儀器設備：奧林巴斯雙目顯微鏡6

18、操作程序6.1涂片：用無菌接種環(huán)取一環(huán)無菌生理鹽水于玻片上，再用無菌接種環(huán)挑取所需菌落，在玻片的生理鹽水上均勻涂抹，自然晾干。6.2固定：6.3將龍膽紫液（Crystal Violet）滴加在已固定的涂片上，染10秒鐘后，水洗并甩干。6.4滴加碘溶液（Iodine Solution），10秒鐘后水洗并甩干6.5再滴加脫色液（Decolorizer），脫色1020秒（或搖動玻片至紫色不再脫落為止，根據涂片之厚薄之需要），水洗并甩干。6.6加沙黃溶液(Safranin Solution)復染10秒之后水洗。6.7以濾紙吸干或在空氣中自然干后，油鏡鏡檢。7結果觀察7.1有真菌孢子及菌絲出現報告：找到

19、真菌。7.2無真菌孢子及菌絲出現報告：未找到真菌。8質量控制：大腸埃希菌呈G桿菌；金黃色葡萄球菌呈G球菌。9注意事項9.1涂片不能太厚，并且要均勻，否則菌體堆積或分散不勻，會影響染色結果。9.2脫色要至無藍色脫落為止。9.3火焰固定時，應避免菌體過分受熱而皺縮變形，影響結果的判斷。9.4每次染色時應用大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌作陰陽性質控對照。10臨床意義：輔助臨床判斷是否是藥物引起的菌群失調或真菌感染。11支持文件：全國臨床檢驗操作規(guī)程（第三版）表3鼻咽喉標本 標本類型采集時間和溫度重復采樣限制說明原則裝置和最小量轉運儲存   鼻  

20、;用預先被無菌鹽水濕潤的拭子插入鼻孔約2cm，對著鼻粘膜用力旋轉，蘸取粘膜上分泌物，緩慢抽出，將拭子直接送檢。拭子轉運      2h,常溫     24h,常溫     1/d               喉 用壓舌板壓舌，用無菌拭子從咽后、扁桃體和發(fā)炎區(qū)域采樣，不要碰觸舌頭和

21、面頰。 拭子轉運 2h,常溫 24h,常溫 1/d 喉拭子培養(yǎng)不能用于會厭發(fā)炎的患者。  主要病原菌：A群溶血鏈球菌可選擇性報告：溶血隱秘桿菌 表6糞便 標本類型采集時間和溫度重復采樣限制說明原則裝置和最小量轉運儲存   常規(guī)培養(yǎng)   直接置入一清潔、廣口的無菌容器  無菌容器2g或者1.5ml   1h,常溫       &#

22、160;    1/d     住院時間超過3 d或入院診斷不是胃腸炎的患者不做常規(guī)糞便培養(yǎng)。對這些患者應進行梭狀芽孢桿菌的培養(yǎng)或毒素檢測。  梭狀芽孢桿菌將液體或軟大便直接送入清潔、廣口無菌容器內。無菌容器：2g或者1.5ml 1h,常溫1-2h,424h,-20  培養(yǎng)：2 d，4，3 d， 4或-70更長用于毒素檢測1/2d     患者應該是每24h排瀉液體或軟大便5次的患者。-20冷凍易于使細胞毒素快速丟失。 EcoliO157:H  將液體或血便放入一清潔、干燥的容器 無菌容器2g或2ml 1h,常溫  24h, 4   1/d   有腹部痙攣的患者在發(fā)病6小時內采集到的血或液狀便效果更好    直腸拭子1.小心插入無菌拭子超越肛門括約肌約2-4cm2.輕輕旋轉拭子，在肛