瓊脂糖凝膠電泳PPT課件

1、 不同大小和構象的核酸分子電荷密度大致相同，在自由泳動時，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開。但采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，發(fā)揮分子篩的功能，使得分子大小和構象不同的核 酸分子泳動率產生較大的差別，則可達到分離的目的。 DNA片段在凝膠上移動的距離在一定范圍內是分子質量的函數，分子質量越大，移動越緩慢。因此，利用瓊脂糖凝膠電泳相對于標準DNA的移動度，可測定DNA片段的相對分子質量。第1頁/共12頁瓊脂糖凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍膠濃度（） 線性DNA分子大?。╧b）0.3 5600.6 1200.7 0.8100.9 0.571.2 0.461.5 0.242.0 0.1

2、3第2頁/共12頁二、儀器設備及材料1、電泳裝置：包括電泳槽（多采用水平方式）、 膠床和梳子三部分組成。2、穩(wěn)壓電泳儀：電壓可變范圍0300600V， 電流可變范圍0250500mA。3、紫外線檢測儀：可產生254、302、366nm 3個 波段紫外線，并配備防護眼鏡和5mm厚的黑色 有機玻璃防護板。4、照相機：5、微波爐：6、其它：三角燒瓶、量筒、膠帶紙、一次性手套等。第3頁/共12頁三、主要試劑1、瓊脂糖：根據需要用電泳緩沖液配成不同濃度。 本實驗配制 2 Agrose： 2g Agrose 100ml 0.5TBE EB少許（終濃度0.5g/ml）2、電泳緩沖液： 常用的緩沖液有TBE、

3、TAE和TPE三種。本實驗選用TBE，先配制5TBE 貯存液：54g Tris堿27.5g 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)（或4.65g EDTA）加dd H2O至1000ml。用時稀釋為0.5TBE。調pH至8.2第4頁/共12頁3、6上樣緩沖液： 4貯存 0.25% 溴酚藍 0.25% 二甲苯青FF 30 甘油水溶液4、10mg/ml 溴化乙錠（EB）：貯存液 在100ml水中加入1g 溴化乙錠，磁力攪拌數小時確保其完全溶解，棕色瓶室溫保存。第5頁/共12頁v 溴化乙錠（EB）染色原理： 溴化乙錠是一種熒光染料，其分子可以嵌入到核酸的堿基對之間，在紫外線的激發(fā)下

4、，發(fā)出橙色熒光。這是因為：在紫外線照射時，核酸吸收波長為254nm的紫外線并將能量傳遞給溴化乙錠；同時嵌入在核酸堿基間的溴化乙錠吸收302nm和366nm波長的紫外線，來自兩方面的能量最終激發(fā)出波長為590nm的紅橙色可見熒光。第6頁/共12頁v 溴化乙錠用于核酸染色的優(yōu)點：染色操作簡單，一般在凝膠中加入終濃度0.5g/ml的EB即可，在電泳過程中隨時可以觀察核酸的泳動。也可在電泳結束后，將凝膠浸泡在EB里30分鐘即可。EB染色不會引起核酸的斷裂，其它染料做不到這 一點。EB染色靈敏度較高，可以檢測出10ng的DNA樣品。v 溴化乙錠缺點： EB是一種強誘變劑，并有中度毒性。注意：操作中務必帶

5、上防護用手套。如不慎皮膚與溶液接觸，應立即用清水徹底沖洗。含溴化乙錠的溶液使用后應進行凈化處理，使其 致誘變活性下降為原來的1/200左右，方可丟棄。第7頁/共12頁四、電泳操作步驟2、膠床準備：取出洗凈并曬干的膠床和梳子，在膠床未封閉的兩端貼上膠布或膠帶紙，形成約58mm的擋墻。將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內，梳齒底端和床面有1mm的間隙。將膠床放在調整好的水平臺上。1、凝膠準備：用0.5TBE配制2瓊脂糖凝膠。 稱2g瓊脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5TBE； 微波爐加熱大約1分鐘，熔化瓊脂糖；熔化的瓊脂糖自然冷卻到6070時，加入EB 0.5g/ml，并輕輕混勻。第8頁/共12頁3、

6、鋪膠：將冷卻致60的凝膠倒入準備好的膠床內，凝膠厚度35mm。4、室溫下靜置1小時左右，凝膠固化。撕去膠床兩端的膠帶紙，將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場負極。5、向電泳槽中加入0.5TBE電泳緩沖液，以越過凝膠表面12mm為宜。6、輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。 原梳齒處 (樣品孔) 即被緩沖液充滿，如發(fā)現有氣泡，應設法去除。7、樣品準備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻。第9頁/共12頁8、上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中。加樣量一般1030l。9、蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳。開始電泳前，再次確認凝膠樣品孔處于電場的負極。電泳條件：電壓15v/cm；時間1小時左右。10、電泳結束后，切斷電源，取出凝膠。11、電泳結果分析：紫外檢測儀直接觀察電源條帶；攝影記錄；凝膠成像分析系統處理。第10頁/共12頁五、注意事項：1、凝膠濃度選擇根據樣品DNA分子大小而定，所以電泳前應對DNA片段大小有粗略的估計。2、用膠帶紙封閉膠床兩端時，要確保嚴密，以免灌膠時有膠液漏出。3、用微波爐熔化瓊脂糖時，應控制好時間，以免突然產生氣泡，使瓊脂糖溢出來。4、凝膠冷卻至60左右，立即鋪膠，以防凝固。5、上樣前檢查樣品孔內是否有氣泡，并設法排除。6、上樣時，