血庫實驗指導

1、廣州華興康復醫(yī)院醫(yī)院血庫實驗指導實驗一 ABO血型鑒定 一、正定型法 【目的】通過用標準血型抗體鑒定紅細胞膜上ABO血型系統(tǒng)抗原，掌握鹽水介質法進行ABO血型系統(tǒng)正定型的基本操作方法和結果判斷。 【原理】根據(jù)IgM類特異性血型抗體與紅細胞膜上特異性抗原結合能夠出現(xiàn)凝集反應的原理，用已知IgM類特異性標準抗血清與被檢紅細胞在鹽水介質中反應（室溫），若出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，表明被檢紅細胞膜上有與血型抗體相對應的抗原，從而判斷和鑒定被檢者的血型。 【器材】小試管、尖滴管、載玻片（或有凹槽的玻璃板）或白瓷板、離心機、記號筆、蠟筆、顯微鏡。 【試劑】標準抗A、抗B血清，生理鹽水。 【標本】外周血或靜脈血。 【操

2、作】5被檢紅細胞生理鹽水懸液制備：抗凝血離心或紅細胞自然沉降后取下層紅細胞2滴于小試管中，加人生理鹽水2 ml，用尖滴管將紅細胞與生理鹽水充分混勻，2 500r/min離心3min后棄去上清液，重復洗滌3次后自管底吸取1滴壓積紅細胞加入19滴生理鹽水中，此即為5的紅細胞生理鹽水懸液。 （一）玻片法 1標記玻片或白瓷板 取潔凈的載玻片或白瓷板1塊，用蠟筆畫出小格，做好編號分別標記抗A、抗B。 2加標準抗血清 在玻片或白瓷板已標記的區(qū)域內(nèi)分別滴加抗A,抗B標準抗血清各1滴。 3加被檢紅細胞懸液 在滴加抗A,抗B標準抗血清的小格中分別加被檢者5紅細胞生理鹽水懸液各1滴，不斷搖動玻片或白瓷板，使血清與

3、紅細胞充分混勻，室溫放置1530min。 4觀察結果 先輕輕搖動玻片，肉眼觀察有無顆粒狀凝集及凝集程度，再用低倍鏡觀察，判定陰性、陽性和陽性程度。 5判斷結果 (1)凝集結果判斷標準：凝集判斷標準：紅細胞呈均勻分布，無凝集顆粒，顯微鏡下紅細胞分散存在，無凝集靠攏現(xiàn)象為陰性；紅細胞出現(xiàn)凝集為陽性。凝集強弱程度判斷標準：有助于A、B亞型，類B抗原的發(fā)現(xiàn)，在低倍鏡下凝集程度強弱判斷標準如下。 1)呈一片或幾片凝塊，僅有少數(shù)單個游離紅細胞為（4+）。 2)呈數(shù)個大顆粒狀凝塊，有少數(shù)單個游離紅細胞為（3+）。 3)數(shù)個小凝集顆粒和一部分微細凝集顆粒，游離紅細胞約占1/2為（2+）。 4)肉眼可見無數(shù)細沙

4、狀小凝集顆粒，周圍有較多的游離紅細胞，于鏡下觀察，每個凝集團中有5-8個以上紅細胞凝集為（1）。 5)可見數(shù)個紅細胞凝集在一起，周圍有很多的游離紅細胞（士）。 6)可見極少數(shù)紅細胞凝集，而大多數(shù)紅細胞仍呈分散分布為混合凝集外觀（mixed field，MF)。 7)鏡下未見細胞凝集，紅細胞均勻分布為（一）。 (2)血型結果判定標準：見表1。 表1 ABO血型正反定型結果判定 正定型 被檢者血型 反定型抗A 抗B A型紅細胞 B型紅細胞 O型紅細胞十 一 A 一 一一 十 B 十 一 一一 一 O 十 一十 十 AB 一 一 一 （二）試管法 1標記試管 取小試管2支，分別標記抗A、抗Bo 2加

5、標準抗血清 分別加人抗A、抗B標準血清各1滴于相應標記的試管中。 3加入紅細胞懸液 分別加人被檢者5紅細胞生理鹽水懸液1滴于各試管中，混勻，立即以1 OOOr/min離心lmino 4觀察結果 先觀察上層液有無溶血現(xiàn)象，再斜持試管輕輕搖動或輕輕彈動，使管底的紅細胞慢慢浮起，肉眼觀察有無凝集、再用低倍鏡觀察凝集強弱程度，如輕微凝集或不見凝集，必須將反應物倒于玻片上，再以低倍鏡觀察。 5判斷結果 (1)判斷標準：凝集判斷標準：完全凝集的管，上層液體清亮、無色，底部有紅細胞凝塊，管底細胞呈花邊狀，輕彈試管凝塊不散開。完全不凝的管，上層液體清亮、無色，血細胞均勻地沉到管底，邊緣整齊，用手指輕彈試管，紅

6、細胞像一縷煙似的立即上升，隨即成為均勻的懸液。凝集強弱程度：判斷標準與玻片法一致。 (2)血型結果判定標準：見表1。 【注意事項】 1嚴格標記，搖動玻片動作要輕。 2所用器材必須干燥清潔、防止溶血；為避免交叉污染，試管、尖滴管均一次性使用。 3標準血清的質量、性能要符合要求。標準血清從冰箱取出待其平衡至室溫后再用，用畢后應盡快放回冰箱保存，減少細菌污染機會。 4操作應按規(guī)定的程序進行，一般先加血清，然后再加紅細胞懸液，以便核實是否漏加血清。 5玻片法定型時，注意防止懸液干涸，否則易將玻片邊緣干涸引起的紅細胞凝集誤認為抗原抗體反應凝集。 6理論上IgM抗A和抗B與相應紅細胞的反應溫度以4最強，但

7、為了防止冷凝集現(xiàn)象的干擾，一般在室溫（20-24）內(nèi)進行試驗，37可使反應減弱。 7觀察結果時應注意紅細胞呈特異性凝集、繼發(fā)性凝集以及緡錢狀形成的區(qū)別，明確凝集和溶血的意義是一樣的。 8登記結果及發(fā)報告時應仔細記錄、嚴格核對、避免筆誤。 9幼兒紅細胞抗原未發(fā)育完全、老年體弱者抗原性較弱，最好采用試管法鑒定血型。白血病、惡性腫瘤等嚴重疾病時，紅細胞上的抗原可能減弱甚至消失，要結合反定型綜合判斷血型。亞型紅細胞（如A3型）的抗原性較弱，有時會出現(xiàn)混合外觀現(xiàn)象（即凝集與不凝集細胞相混合的現(xiàn)象），甚至與較低效價的抗體血清不出現(xiàn)凝集反應（如Ax, Am），要加用抗AB標準血清進行鑒定。 10有些疾病可能

8、使紅細胞定型困難。嚴重的腸道細菌感染，其代謝產(chǎn)物可使紅細胞出現(xiàn)類B現(xiàn)象，與抗B標準血清出現(xiàn)凝集假象。嚴重的細菌感染，可激活正常存在于紅細胞上的T抗原，與各型血清中正常存在的抗T反應，使紅細胞出現(xiàn)全凝集現(xiàn)象。血清中存在病理性冷凝集素與紅細胞上抗原結合，干擾紅細胞ABO系統(tǒng)的血型鑒定。部分高球蛋白和異常高球蛋白血癥患者（如慢性肝病、多發(fā)性骨髓瘤），紅細胞血型鑒定可出現(xiàn)困難。在血型鑒定過程中如遇上述情況，必須加做自身血清、紅細胞對照，自身紅細胞、生理鹽水懸液對照，以及通過反定血型、抗體吸收、放散試驗和血型物質型別的鑒定，甚至親屬的血型鑒定等家系調(diào)查分析來進行綜合判斷。 11輸入異型血或做過與受血者血

9、型不同的異體骨髓、器官移植的患者，在血型鑒定時可能出現(xiàn)混合凝集外觀現(xiàn)象。 【方法學評價】 1玻片法定型簡便，不需要離心，適用于大規(guī)模血型普查。該法僅靠抗原抗體的力量凝集紅細胞而無離心加速反應，故反應時間較長，不適用于急診定型。此外，亞型紅細胞抗原和抗體的凝集反應凝集強度較弱，有時容易被忽略而導致定型有誤。另外，該法不適用于反定型和交叉配血。 2試管法定型反應快，所需時間短，適用于急診定型；通過離心作用增強凝集，可發(fā)現(xiàn)亞型和較弱的抗原抗體反應，結果準確可靠，為正定型常規(guī)使用方法。 【質量控制】 1更換抗血清批號或對實驗結果有懷疑時可設陽性、陰性對照。 2應嚴格按操作規(guī)程進行實驗。 3紅細胞懸液濃

10、度過高或過低，抗原抗體比例不適當，使反應不明顯，容易誤判為陰性反應。 4玻片法反應時間不能少于10min,否則較弱凝集不能出現(xiàn)，造成假陰性。 5離心時間和速度應準確，以防止出現(xiàn)假陽性和假陰性結果。 6分型血清效價太低、親和力不強。如抗A血清效價不高，可將A亞型誤定為O型，AB型誤定為B型。 7正反定型結果一致才可發(fā)報告。 8標記、操作、結果判斷、結果記錄與報告應仔細核對。 二、反定型法 【目的】通過用標準紅細胞與被檢血清反應，掌握用鹽水介質法進行ABO系統(tǒng)反定型的基本操作方法及結果判斷，并驗證正定型結果的準確性。 【原理】用已知標準A、B、O型紅細胞與被檢血清反應，若被檢血清與已知型別的標準紅

11、細胞出現(xiàn)凝集，則證明被檢血清中存在與該紅細胞抗原相對應的抗體。反之，若被檢血清與已知型別的標準紅細胞不出現(xiàn)凝集，證明被檢血清中不存在與紅細胞抗原相對應的血型抗體，以此反證被檢者紅細胞上抗原的型別。 【器材】小試管、尖滴管、離心機、顯微鏡、記號筆。 【試劑】5A、B、O型標準紅細胞生理鹽水懸液。 【標本】靜脈血。 【操作】 1分離血清 將待檢血液以2 500r/min離心3min,分離血清。 2標記并加被檢者血清 取小試管3支，分別標記A、B、O字樣，于各管加人被檢者血清2滴。 3加標準紅細胞 按標記分別加入5的A、B、O型標準紅細胞生理鹽水懸液1滴，混勻，立即以1 OOOr/min離心lmin

12、。 4觀察結果 先觀察上層液有無溶血現(xiàn)象，再斜持試管輕輕搖動或輕輕彈動，肉眼觀察有無凝集，再用低倍鏡觀察。 5判斷結果 (1)凝集結果判斷標準：同正定型法。 (2）血型結果判定標準：見表1。 【注意事項】 1標準紅細胞用3名健康人同型新鮮紅細胞混合，用生理鹽水洗滌3次，以除去存在于血清中的抗體及可溶性抗原。 2觀察結果時若試管中出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，表明存在抗原抗體反應并有補體激活，應視為凝集。 3先天性免疫球蛋白缺陷，長期大量應用免疫抑制劑，血型抗體可減弱或消失，造成反定型困難。 4血清中存在自身免疫性抗體、冷凝集素效價增高、多發(fā)性骨髓瘤、免疫球蛋白異常均可造成反定型困難。 5由于新生兒體內(nèi)可存在母

13、親輸送的血型抗體，而且自身血型抗體效價又低，因而出生6個月以內(nèi)的嬰兒不宜做反定型。 6其他與正定型相同。 【方法學評價】試管離心法的靈敏度明顯高于玻片法，易于檢測出較弱的凝集，故反定型通常用試管離心法。 【質量控制】 1每批測定用標準的抗、抗B及抗A抗B血清作對照。 2老年人血清中抗體水平大幅度下降或被檢者血清中缺乏抗A及（或）抗B抗體，可引起假陰性或血型鑒定錯誤。 3正、反定型血型結果不一致時不能報告結果。 4其他與正定型相同。 實驗二 Rh(D)定型【器材】小試管、尖滴管、載玻片（或有凹槽的玻璃板）或白瓷板、離心機、記號筆、蠟筆、顯微鏡。 【試劑】IgM/IgG混合型抗D血清，生理鹽水。

14、【標本】外周血或靜脈血。 【操作】5被檢紅細胞生理鹽水懸液制備：抗凝血離心或紅細胞自然沉降后取下層紅細胞2滴于小試管中，加人生理鹽水2 ml，用尖滴管將紅細胞與生理鹽水充分混勻，2 500r/min離心3min后棄去上清液，重復洗滌3次后自管底吸取1滴壓積紅細胞加入19滴生理鹽水中，此即為5的紅細胞生理鹽水懸液。（一） 玻片法1快速試驗該試驗最好在表面溫度為2037的觀察箱上進行。（1） 在一塊玻片上滴1滴試劑。（2） 加1滴等體積全血，混勻。（3） 輕搖玻片，觀察凝集結果，判讀結果應在2分鐘內(nèi)進行，否則會因為樣本干固而引起假陽性。（二） 試管法（1） 用等滲鹽水配制3%-5%待檢紅細胞懸液。

15、（2） 在一塊玻片上滴1滴試劑，加1滴全血或紅細胞懸液。（3） 1000rpm（150g）離心2分鐘或3000 rpm（1000g）離心20秒。（4） 輕輕振蕩，懸浮沉積細胞，觀察凝集結果。（5） 若反應為陰性、弱陽性或可疑，20孵育15分鐘。（6） 1000rpm（150g）離心2分鐘或3000 rpm（1000g）離心20秒。（7） 輕輕振蕩，懸浮沉積細胞，觀察結果。最后，如果使用血清克隆抗-D經(jīng)20孵育后，反應仍為陰性，那么就需要檢測弱D抗原或不完全D抗原的存在。使用血清克隆抗-D（混合型）重復上面操作，然后按下述方法繼續(xù)試驗。弱D抗原（Dweak）試驗：（8） 37孵育15-30分鐘。

16、（9） 用等滲鹽水洗紅細胞至少3次，最后一次洗滌后，完全倒掉鹽水上清。（10） 用2滴抗人球蛋白試劑于細胞中。（11） 3000 rpm（1000g）離心20秒。（12） 輕輕振蕩，懸浮沉積細胞，觀察凝集結果。如果反應為陽性，說明存在弱D抗原或不完全D抗原。該試驗應同時做陽性，陰性對照試驗。（13）判斷結果 如陽性對照管出現(xiàn)凝聚，陰性對照管不凝集，再看被檢管，若被檢管出現(xiàn)凝集，為Rh陽性，若被檢管不凝集，則為Rh陰性?！举|量控制】 1每批測定一定要做陰性和陽性對照，只有在陽性對照管出現(xiàn)凝集而陰性對照管不凝集的情況下，才能說明被檢管的結果是可靠的。 2如結果為陰性，說明被檢紅細胞上無相應抗原，但

17、由于Du抗原性弱，如被檢者無凝集，還應進一步檢查以排除Du的可能。實驗三 交叉配血試驗 一、鹽水介質配血法 【目的】掌握鹽水介質交叉配血的基本原理、方法和注意事項。 【原理】天然IgM類血型抗體與對應紅細胞抗原相互作用，在室溫下的鹽水介質中出現(xiàn)凝集反應。通過離心，觀察受血者血清與供血者紅細胞以及受血者紅細胞與供血者血清之間有無凝集現(xiàn)象，判斷供血、受血者之間有無ABO血型不合的情況。 【器材】小試管、尖滴管、離心機、顯微鏡、記號筆。 【試劑】生理鹽水。 【標本】靜脈血。 【操作】 1患者標本準備 （1）分離血清，標記為PS(patient serum)。 (2) 配制5患者紅細胞生理鹽水懸液，標

18、記為PC(patient cell)。 2獻血員標本準備 （1）分離血清，標記為DS(donor serum)。 (2)配制5獻血員紅細胞生理鹽水懸液，標記為DC(donor cell)。 3交叉配血（按1個供血者為例）取小試管2支，分別標明主、次，即主側配血管和次側配血管。在主側配血管中分別加PS2滴，DC 1滴，在次側配血管分別加DS2滴，PC 1滴，混勻，1 OOOr/min離心lmin。 4觀察結果 先觀察試管上層液有無溶血，再斜持試管輕輕搖動或輕輕彈動，觀察管底反應物有無凝集（必要時用顯微鏡觀察）。 5判斷結果 (1)凝集結果判斷：凝集結果判斷標準同正定型試管法。凝集強弱程度判斷標準

19、同正定型玻片法。 (2)配血是否相合判斷標準：ABO同型配血，主側、次側均無溶血及凝集，配血相合；主、次側任何一管發(fā)生溶血或凝集，暫不可輸血，需查明原因。異型配血時（指O型血輸人給A、B、AB型，或A、B型輸給AB型），主側無凝集無溶血，次側有凝集但無溶血，可以輸人少量血。如主側、次側均無凝集或主側凝集，需查找原因，暫不能輸血。 【注意事項】 1嚴格三查三對，確保標本、姓名、血型準確無誤。 2觀察到試管內(nèi)溶血現(xiàn)象表示配血不合，表明有抗原抗體反應，同時還有補體參與，必須高度重視。 3如主側配血管凝集，應禁止輸血，必須查找原因，另選血源。 4室溫控制在（22士2），以防止冷抗體引起凝集反應，影響配

20、血結果的判斷。 5鹽水配血相合但有反復輸血史或妊娠史的受血者，應加用聚凝胺介質、酶介質或抗球蛋白介質配血。 6為確保輸血安全，應輸同型血，特殊情況下無同型血又必須輸血時，可選擇O型血輸給AB、 A及B型血的患者，或A、B型輸給AB型的患者，但主側管必須無凝集和溶血現(xiàn)象，次側有凝集但無溶血，方允許少量輸入（不超過200m1），但供血者血清中抗A(B)效價要小于1：64。 二、聚凝胺介質配血法 【目的】掌握聚凝胺介質交叉配血的基本原理、方法和注意事項。 【原理】聚凝胺（polybrene），一種高價陽離子季胺鹽多聚物，溶解后能產(chǎn)生很多正電荷，可中和紅細胞表面的負電荷，使紅細胞之間距離減少，能引起正

21、常紅細胞可逆性的非特異性凝集。如果是抗體致敏的紅細胞被聚凝胺凝集，則凝集不可逆。在檢測抗體活性的聚凝胺試驗中紅細胞和血清首先在低離子介質中孵育，促進抗體與紅細胞結合，然后加入聚凝胺使細胞聚集。離心后，聚集的細胞不再懸浮，加入重新懸浮液，聚凝胺的聚集作用可通過加入枸櫞酸鈉而中和，使正常紅細胞的聚集解散，而抗體引起的凝集仍存在。 【器材】小試管、尖滴管、離心機、記號筆、顯微鏡。 【試劑】聚凝胺試劑盒由三部分組成：低離子強度溶液(low ion strength solu-tion, LISS液）。聚凝胺液(polybrene)。解聚液即重新懸浮液(resupension solution)。 【標

22、本】靜脈血。 【操作】 1患者標本準備（1） 分離血清，標記為PS。 (2) 配制5患者紅細胞生理鹽水懸液，標記為PC。 2獻血員標本準備 (1) 分離血清，標記為DS。 (2) 配制5獻血員紅細胞生理鹽水懸液，標記為DC。 3交叉配血（以1個供血者為例）取小試管2支，分別標明主、次，即主側配血管和次側配血管。在主側配血管中分別加PS和DC各1滴，在次側配血管中分別加DS和PC各1滴，混勻，1 OOOr/min離心lmin。 4加LISS液和聚凝胺液 在上述已加好反應物的試管中各加人LISS液0. 6m1(約12滴），混勻后再加聚凝胺2滴，混勻,15s后以1 OOOr/min離心lmin,棄上

23、清液，觀察管底紅細胞凝集情況，若各試管中的反應物全部出現(xiàn)凝集，說明試劑有效。 5加解聚液 向各管中分別加人解聚液2滴，混勻lmin后以1 OOOr/min離心lmin。 6觀察結果 先看上層液有無溶血現(xiàn)象，再斜持試管輕搖或輕輕彈動，先用肉眼觀察后，在低倍鏡下觀察有無凝集。 7判斷結果 (1)凝集結果判斷：凝集結果判斷標準同正定型試管法。凝集強弱判斷標準同正定型玻片法。 (2) 配血相合判斷標準：同鹽水介質交叉配血法。 【方法學評價】 1交叉配血有自動化儀器法及手工配血法，成批量配血（如中心血站）多使用自動化儀器，多數(shù)醫(yī)院輸血科或血庫仍用手工法配血。另外，卡式配血血型鑒定檢測法已成為國際安全輸血

24、檢查的推薦方法?？ㄊ綑z測法（微柱凝胺試驗）是利用葡聚糖凝膠具有分子篩效應或親和效應，將紅細胞和血清加在凝膠的上部反應，離心后，凝集紅細胞將受到凝膠的阻礙而停留在凝膠微柱的上部或凝膠中，則證明發(fā)生凝集反應，可判為凝集反應陽性；反之，所有紅細胞停留在凝膠柱底部，證明未發(fā)生凝集反應，則可判斷凝集反應陰性。該法具有：檢測項目齊全、應用廣（包括常規(guī)血型檢查，特殊血型檢查、交叉配血、抗體篩檢，直接抗球蛋白及間接抗球蛋白試驗等）。靈敏度高，特別在交叉配血時，能捕捉到十分微弱的抗原抗體反應。特異性強，許多試驗中都加人了抗人球蛋白，以促進紅細胞的特異性凝集。重復性好，采用標準化定量操作，最大限度減少操作人員的隨

25、意性?？陀^性好，由于采用了凝膠分子篩技術，將凝集紅細胞和游離紅細胞分離開，使結果一目了然，避免了顯微鏡下的主觀判斷影響?？晒?jié)省樣品紅細胞、血清和試劑，檢測結果可以較長時間保存。操作方式可以采用手工、半自動及全自動模式，靈活方便。尤其是自動化操作，可減少人為誤差，保障安全翰血，并可實現(xiàn)計算機管理。不足之處是成本較昂貴。 2鹽水介質配血法是常用的方法，其操作簡單，反應快速，如有血型不合，可立即顯示出來?？梢园l(fā)現(xiàn)臨床上最重要的ABO血型不合，但該法只能發(fā)現(xiàn)完全抗體，若要檢測不完全抗體，則需采用其他方法。故該法只適用于初次受血患者的交叉配血。對有異體輸血史、妊娠史和器官移植史的患者不宜采用本法。 3聚凝胺介質配血法可加快凝集反應速度，使原來在鹽水介質中不能凝集紅細胞的抗體發(fā)生凝集，提高反應靈敏度，能檢測IgM, IgG等引起溶血性輸血反應的幾乎所有規(guī)則與不規(guī)則抗體，適用于各類輸血患者的配血。故該法具有快速、靈敏、結果可靠、能檢出完全抗體及不完全抗體等優(yōu)點，目前被