細胞生物學技術(shù)

1、細胞生物學技術(shù)細胞生物學技術(shù)呂冬霞呂冬霞基礎(chǔ)醫(yī)學院生物學教研室基礎(chǔ)醫(yī)學院生物學教研室20112011年年1010月月2011諾貝爾生理學或醫(yī)學獎??？諾貝爾生理學或醫(yī)學獎?。?011年年10月月3日?。咳眨?？加拿大加拿大- 1973拉爾夫拉爾夫斯坦曼斯坦曼法國法國- 1996朱爾斯朱爾斯霍夫曼霍夫曼美國美國- 1998布魯斯布魯斯博伊特勒博伊特勒諾貝爾生理學或醫(yī)學獎評審委員會諾貝爾生理學或醫(yī)學獎評審委員會3日認定，本年度日認定，本年度3名獲獎者名獲獎者“發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)激活的關(guān)鍵原理，革命性發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)激活的關(guān)鍵原理，革命性地改變我們大家對免疫系統(tǒng)的理解地改變我們大家對免疫系統(tǒng)的理解”“先天性免疫系

2、統(tǒng)的先天性免疫系統(tǒng)的活性作用方面的發(fā)現(xiàn)活性作用方面的發(fā)現(xiàn)”樹狀細胞及其在適應性樹狀細胞及其在適應性免疫系統(tǒng)方面作用的發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)方面作用的發(fā)現(xiàn)”v 傳統(tǒng)意義上，傳統(tǒng)意義上，疫苗的作用，在疫苗的作用，在于預防于預防。而以。而以3 3人所獲研究成果為基人所獲研究成果為基礎(chǔ)，新型疫苗著眼于以新穎手段治礎(chǔ)，新型疫苗著眼于以新穎手段治療癌癥，獲稱療癌癥，獲稱“治療性疫苗治療性疫苗”，旨旨在調(diào)動人體免疫系統(tǒng)對腫瘤發(fā)起在調(diào)動人體免疫系統(tǒng)對腫瘤發(fā)起“攻擊攻擊”。另外，他們的成果有助。另外，他們的成果有助于治療一些炎癥類疾病，如風濕性于治療一些炎癥類疾病，如風濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)炎。 拉爾夫拉爾夫斯坦曼斯坦曼 諾貝爾

3、生理學或醫(yī)學獎評審委員會諾貝爾生理學或醫(yī)學獎評審委員會3日日確認，確認，2011年度諾貝爾醫(yī)學獎得主之一、斯年度諾貝爾醫(yī)學獎得主之一、斯坦曼坦曼9月月30日日因胰腺癌因胰腺癌去世去世，終年，終年68歲。歲。 v細胞是生物體的結(jié)構(gòu)和功能單位。細胞是生物體的結(jié)構(gòu)和功能單位。v一切生命的關(guān)鍵問題都要在細胞里面尋找一切生命的關(guān)鍵問題都要在細胞里面尋找(1925, wilson)。 細胞生物學細胞生物學 (cell biology)是從是從細胞整體、超微和分細胞整體、超微和分子水平上研究細胞的子水平上研究細胞的結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)功能和生命活動和生命活動規(guī)律的科學。規(guī)律的科學。結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)功能細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)細胞

4、的形態(tài)結(jié)構(gòu)普通光學普通光學倒置倒置熒光熒光激光掃描共聚焦激光掃描共聚焦電鏡電鏡免疫組織化學技術(shù)免疫組織化學技術(shù)放射自顯影術(shù)放射自顯影術(shù)流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)細胞器組分的分析、分離技術(shù)細胞器組分的分析、分離技術(shù)細胞內(nèi)化學組分測定分析細胞內(nèi)化學組分測定分析 細胞生物學細胞生物學 (cell biology)是從是從細胞整體、超微和分細胞整體、超微和分子水平上研究細胞的子水平上研究細胞的結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)功能和生命活動和生命活動規(guī)律的科學。規(guī)律的科學。結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)功能第五章第五章 細胞生命現(xiàn)象的研究技術(shù)細胞生命現(xiàn)象的研究技術(shù) 細胞生長增殖研究技術(shù)細胞生長增殖研究技術(shù) 細胞凋亡研究技術(shù)細胞凋亡研究技術(shù) 細胞遺

5、傳學研究技術(shù)細胞遺傳學研究技術(shù) 腫瘤細胞學研究技術(shù)腫瘤細胞學研究技術(shù) 藥物測試的細胞模型藥物測試的細胞模型 膜片鉗術(shù)膜片鉗術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 細胞生長增殖研究技術(shù)細胞生長增殖研究技術(shù)二、細胞周期分析技術(shù)二、細胞周期分析技術(shù) 細胞同步化實驗細胞同步化實驗 流式細胞儀檢測細胞周期流式細胞儀檢測細胞周期 通過分析通過分析cdk的活性檢測細胞周期的活性檢測細胞周期一、細胞增殖生長力（判定細胞活力）一、細胞增殖生長力（判定細胞活力） 細胞計數(shù)細胞計數(shù) 細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù) 細胞集落形成實驗細胞集落形成實驗 3h-tdr滲入法滲入法(氚標記胸腺嘧啶核苷氚標記胸腺嘧啶核苷) mtt檢測細胞生長狀況檢測細胞

6、生長狀況一、細胞增殖生長力一、細胞增殖生長力（一）細胞計數(shù)（一）細胞計數(shù)細胞生長曲線的繪制細胞生長曲線的繪制 意義：意義：了解培養(yǎng)細胞增殖詳細過程和了解培養(yǎng)細胞增殖詳細過程和 細胞生長基本規(guī)律細胞生長基本規(guī)律分時間段分時間段連續(xù)取材連續(xù)取材計數(shù)計數(shù)生長曲線生長曲線細胞生長是否穩(wěn)定細胞生長是否穩(wěn)定細胞增殖速度變化的進程細胞增殖速度變化的進程增殖高峰出現(xiàn)的時間增殖高峰出現(xiàn)的時間 細胞傳代細胞傳代確定確定 細胞凍存細胞凍存 最佳時間最佳時間 實驗研究實驗研究細胞生長曲線繪制細胞生長曲線繪制-實驗范例實驗范例實驗用品實驗用品材料材料 貼壁培養(yǎng)的細胞。貼壁培養(yǎng)的細胞。 器材器材 24孔培養(yǎng)板、吸管、膠帽

7、、離心管、孔培養(yǎng)板、吸管、膠帽、離心管、培養(yǎng)皿、半對數(shù)坐標紙、蓋玻片、細胞計數(shù)板、培養(yǎng)皿、半對數(shù)坐標紙、蓋玻片、細胞計數(shù)板、酒精棉球、酒精燈、離心機、倒置顯微鏡、普通酒精棉球、酒精燈、離心機、倒置顯微鏡、普通光學顯微鏡、超凈工作臺、光學顯微鏡、超凈工作臺、co2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)箱。 試劑試劑 hanks液、液、dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)基 (含含10%小牛小牛血清血清)、0.25%胰蛋白酶消化液、吉姆薩染液。胰蛋白酶消化液、吉姆薩染液。v實驗步驟實驗步驟 消化消化棄上清棄上清離心離心制懸液制懸液計數(shù)計數(shù)接種接種（21045l04個個/ml ） （96孔板，平行孔板，平行3孔孔）消化消化計數(shù)計數(shù)（細胞數(shù)（細

8、胞數(shù)/ml）培養(yǎng)時間為橫坐標培養(yǎng)時間為橫坐標細胞數(shù)為縱坐標細胞數(shù)為縱坐標繪制細胞生長曲線繪制細胞生長曲線培養(yǎng)細培養(yǎng)細胞胞 24h 48h 72h 96h-7d/孔孔平均值平均值/孔孔s細胞無增殖細胞無增殖少見分裂相少見分裂相細胞增殖最旺盛細胞增殖最旺盛活力最好活力最好實驗最佳階段實驗最佳階段細胞增殖飽和細胞增殖飽和細胞停止增殖細胞停止增殖（停滯期）（停滯期）104105106有限、無限細胞系一代生長曲線比較有限、無限細胞系一代生長曲線比較無接觸抑制無接觸抑制接觸抑制接觸抑制1、在進行生長曲線測定時，接種到培養(yǎng)板孔中在進行生長曲線測定時，接種到培養(yǎng)板孔中 的的細胞數(shù)量細胞數(shù)量應保持應保持每孔一致

9、每孔一致 （21045l04個個/ml） 。2、接種量應適當接種量應適當，不能過少或過多，過少將使，不能過少或過多，過少將使 細胞生長周期延長，過多將導致細胞在實驗細胞生長周期延長，過多將導致細胞在實驗 未完成前即需傳代，這兩種情況下所得到的未完成前即需傳代，這兩種情況下所得到的 生長曲線均不能較準確地反應細胞的生長狀生長曲線均不能較準確地反應細胞的生長狀 況。況。v不足：不足：活細胞和死細胞同時被計數(shù)，誤差較大。活細胞和死細胞同時被計數(shù)，誤差較大。 注意事項注意事項（二）細胞分裂指數(shù)（二）細胞分裂指數(shù)（mitotic index ,mi）：）：繪制細胞分裂指數(shù)曲線繪制細胞分裂指數(shù)曲線意義：意

10、義：表示細胞增殖旺盛程度表示細胞增殖旺盛程度 phases of the cell cycle interphase: g1 s g2 division phase (mitosis phase- m phase ) nuclear division (karyokinesis) cytoplasmic division ( cytokinesis) v實驗步驟實驗步驟 消化消化離心離心制懸液制懸液計數(shù)計數(shù)接種接種（2104-5l04個個/ml 有蓋玻片的培養(yǎng)皿中有蓋玻片的培養(yǎng)皿中）固定固定染色染色沖洗沖洗培養(yǎng)細胞培養(yǎng)細胞 每每24h 取蓋玻片取蓋玻片（95%乙醇）乙醇）（吉姆薩）（吉姆薩）鏡

11、檢鏡檢晾干晾干 蓋玻片反扣在載玻片上蓋玻片反扣在載玻片上（對光觀察，細胞面發(fā)亮）（對光觀察，細胞面發(fā)亮）（選高、中、低（選高、中、低3個不同個不同 區(qū)域區(qū)域 各各1000個細胞）個細胞）計分裂細胞數(shù)計分裂細胞數(shù)平均值平均值細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù) 細胞核紫紅色，胞漿藍、灰藍、細胞核紫紅色，胞漿藍、灰藍、紅或多色性，核仁染深藍色紅或多色性，核仁染深藍色觀察結(jié)構(gòu)，判定是否為觀察結(jié)構(gòu)，判定是否為分裂相分裂相p130改錯改錯：（1） （2） （3） （4） （5）按）按21045104/ml的密度將細胞接種于置有蓋玻片的培養(yǎng)皿中。的密度將細胞接種于置有蓋玻片的培養(yǎng)皿中。（5）每）每24h取出取出1張蓋

12、玻片，經(jīng)張蓋玻片，經(jīng)95%乙醇固定乙醇固定5min.。（6）用吉姆薩染液對蓋玻片的細胞染色）用吉姆薩染液對蓋玻片的細胞染色10min。（7）高倍鏡下觀察細胞結(jié)構(gòu)，對分裂期細胞及非分裂期細胞加以識別。）高倍鏡下觀察細胞結(jié)構(gòu)，對分裂期細胞及非分裂期細胞加以識別。（8） 選出細胞密度高、中、低選出細胞密度高、中、低3個不同的區(qū)域，每一區(qū)域觀察個不同的區(qū)域，每一區(qū)域觀察1000個細個細胞，統(tǒng)計并記錄其中的分裂細胞數(shù)。胞，統(tǒng)計并記錄其中的分裂細胞數(shù)。（9） 計算上述計算上述3個區(qū)域的分裂細胞數(shù)平均值。個區(qū)域的分裂細胞數(shù)平均值。（10）求出分裂細胞在）求出分裂細胞在1000個細胞中所占的比例，即可得培養(yǎng)細

13、胞在不個細胞中所占的比例，即可得培養(yǎng)細胞在不同時相點的分裂指數(shù)。同時相點的分裂指數(shù)。 （11） 以各時相點為橫坐標，各時相點時細胞的分裂指數(shù)為縱坐標，繪以各時相點為橫坐標，各時相點時細胞的分裂指數(shù)為縱坐標，繪制培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)曲線。制培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)曲線。細胞分裂指數(shù)曲線細胞分裂指數(shù)曲線細胞分裂指數(shù)和細胞數(shù)量關(guān)系細胞分裂指數(shù)和細胞數(shù)量關(guān)系細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù)注意事項注意事項v掌握好掌握好確定分裂相標準確定分裂相標準，其中主要是確定好，其中主要是確定好劃分劃分間期和前期間期和前期、末期和間期末期和間期等的界限，當?shù)鹊慕缦蓿攦扇艘陨线M行觀察時更須如此，并始終一致，兩人以上進行觀察時更須如此，

14、并始終一致，否則會發(fā)生人為誤差。否則會發(fā)生人為誤差。v細胞分裂指數(shù)曲線與生長曲線趨勢基本一致，細胞分裂指數(shù)曲線與生長曲線趨勢基本一致，但不完全相同，如當細胞增長達飽合密度并但不完全相同，如當細胞增長達飽合密度并進入停止期后，細胞數(shù)值很大，而分裂相可進入停止期后，細胞數(shù)值很大，而分裂相可完全消失。完全消失。v操作時動作要輕，以免使蓋片上的細胞脫落。操作時動作要輕，以免使蓋片上的細胞脫落。（三）細胞集落形成實驗（三）細胞集落形成實驗v意義意義：檢驗活細胞的增殖能力，避免了：檢驗活細胞的增殖能力，避免了在生長曲線繪制時將在生長曲線繪制時將死細胞或不能分裂死細胞或不能分裂細胞細胞計數(shù)在內(nèi)而導致的實驗結(jié)

15、果誤差。計數(shù)在內(nèi)而導致的實驗結(jié)果誤差。v原理原理：單個細胞在體外持續(xù)增殖：單個細胞在體外持續(xù)增殖6代以上，代以上，其后代形成一個細胞群體，稱為集落或克其后代形成一個細胞群體，稱為集落或克隆。每個克隆均包含隆。每個克隆均包含50個細胞以上，大小個細胞以上，大小在在0.31.0mm之間。通過計算克隆形成率，之間。通過計算克隆形成率，來測定測試細胞的增殖能力。來測定測試細胞的增殖能力。影響集落形成率的因素：影響集落形成率的因素：v培養(yǎng)液培養(yǎng)液v血清質(zhì)量、濃度血清質(zhì)量、濃度v溫度溫度v酸堿度酸堿度v細胞密度細胞密度 一般情況下：一般情況下： 初代培養(yǎng)細胞集落形成率低，傳代細胞較高；初代培養(yǎng)細胞集落形成

16、率低，傳代細胞較高； 正常細胞較低，轉(zhuǎn)化細胞較高。正常細胞較低，轉(zhuǎn)化細胞較高。應用：應用：v干細胞研究干細胞研究v腫瘤研究：腫瘤研究： 腫瘤是由不同增殖及分化能力的瘤腫瘤是由不同增殖及分化能力的瘤細胞群構(gòu)成，其中僅有部分具有自我更細胞群構(gòu)成，其中僅有部分具有自我更新能力，即腫瘤干細胞。新能力，即腫瘤干細胞。 目前認為，只有腫瘤干細胞具有形成目前認為，只有腫瘤干細胞具有形成集落的能力。集落的能力。 細胞集落形成實驗細胞集落形成實驗可以作為抗腫瘤可以作為抗腫瘤藥物或致癌物質(zhì)檢測的有效手段。藥物或致癌物質(zhì)檢測的有效手段。 以集落抑制率與藥物劑量對數(shù)作圖，以集落抑制率與藥物劑量對數(shù)作圖， 可以得到一條

17、可以得到一條s形曲線，作出藥物的形曲線，作出藥物的ic50（半數(shù)抑制率（半數(shù)抑制率 細胞生長抑制率為細胞生長抑制率為50% 時的藥物濃度值）。時的藥物濃度值）。對于抗癌藥物而言，集落抑制率或?qū)τ诳拱┧幬锒?，集落抑制率或集落存活分?shù)是重要的指標集落存活分數(shù)是重要的指標集落抑制率與藥物劑量間的關(guān)系集落抑制率與藥物劑量間的關(guān)系 細胞集落形成細胞集落形成實驗范例實驗范例（平板克隆形成實驗、軟瓊脂集落形成實驗）（平板克隆形成實驗、軟瓊脂集落形成實驗）實驗用品：實驗用品：（平板克隆形成實驗）（平板克隆形成實驗）v材料：材料：hela細胞細胞v試劑：試劑：1640培養(yǎng)液、胎牛血清、培養(yǎng)液、胎牛血清、0.2

18、5%胰蛋白胰蛋白 酶、吉姆薩染液。酶、吉姆薩染液。v設(shè)備：細胞計數(shù)板、設(shè)備：細胞計數(shù)板、60mm培養(yǎng)皿、培養(yǎng)皿、10ml移移 液管、小燒杯、液管、小燒杯、10ml吸管橡皮頭、超凈吸管橡皮頭、超凈 工作臺、培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、離心機、工作臺、培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、離心機、 水浴鍋。水浴鍋。 實驗步驟：實驗步驟：200個個/ ml，接種于，接種于24孔板，孔板，4個平行孔，每孔加入個平行孔，每孔加入1 ml（950l細胞懸液細胞懸液50l藥液）藥液）培養(yǎng)培養(yǎng)（23周，周，肉眼可見克?。┤庋劭梢娍寺。状迹罕姿幔状迹罕姿?3：1）計算計算 第一節(jié)第一節(jié) 細胞生長增殖研究技術(shù)細胞生長增殖研究技術(shù)

19、二、細胞周期分析技術(shù)二、細胞周期分析技術(shù) 細胞同步化實驗細胞同步化實驗 流式細胞儀檢測細胞周期流式細胞儀檢測細胞周期 通過分析通過分析cdk的活性檢測細胞周期的活性檢測細胞周期一、細胞增殖生長力（判定細胞活力）一、細胞增殖生長力（判定細胞活力） 細胞計數(shù)細胞計數(shù) 細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù) 細胞集落形成實驗細胞集落形成實驗 3h-tdr滲入法滲入法(氚標記胸腺嘧啶核苷氚標記胸腺嘧啶核苷) mtt檢測細胞生長狀況檢測細胞生長狀況（四）（四）3h-tdr滲入法（氚標記胸腺嘧啶核苷）滲入法（氚標記胸腺嘧啶核苷） dna合成速度合成速度 意義：反映細胞增殖水平意義：反映細胞增殖水平 動態(tài)觀察細胞復制分裂

20、情況，動態(tài)觀察細胞復制分裂情況， 確定細胞周期各期時間確定細胞周期各期時間原理：原理：3h-tdr 能特異摻入能特異摻入dna 合成（合成（s 期），使新合成的期），使新合成的dna 帶核放射性，帶核放射性， 摻入量和合成摻入量和合成dna 的速度正相關(guān)。的速度正相關(guān)。 interphase2n dna4n dna4n dna2n dna3 3h-tdrh-tdr滲入法滲入法實驗用品實驗用品v 材料材料 貼壁培養(yǎng)的細胞貼壁培養(yǎng)的細胞v 器材器材 液閃計數(shù)器（液體閃爍計數(shù)器液閃計數(shù)器（液體閃爍計數(shù)器 ）。）。v 試劑試劑 標記物標記物 5cimethyl-3h-tdr/ml（5微居里甲基氚標記胸

21、腺嘧啶核苷微居里甲基氚標記胸腺嘧啶核苷/毫升），用毫升），用培養(yǎng)液配成、培養(yǎng)液配成、pbs、0.25%胰蛋白酶和胰蛋白酶和0.02%edta混合消化液?；旌舷?。v 實驗步驟實驗步驟24h48h12h12h24h24h加含加含 培養(yǎng)液培養(yǎng)液棄原培養(yǎng)液棄原培養(yǎng)液3h-tdr清洗清洗pbs消化消化收集細胞收集細胞提取提取dna濾出濾出dna放射性脈沖數(shù)放射性脈沖數(shù)/min 烘干烘干結(jié)果分析結(jié)果分析被標記的為被標記的為s期細胞期細胞3h-tdr滲入量反映滲入量反映dna含量含量（2104-5l04個個/ml 24孔培養(yǎng)板孔培養(yǎng)板）（液閃計數(shù)器）（液閃計數(shù)器）腫瘤研究上有重要意義：腫瘤研究上有重要意

22、義：v篩選抗腫瘤藥物種類篩選抗腫瘤藥物種類v確定劑量，用藥時間確定劑量，用藥時間v制定化療方案制定化療方案v判定療效預后判定療效預后v研究干預因素研究干預因素 3h-tdr滲入法（氚標記胸腺嘧啶核苷）滲入法（氚標記胸腺嘧啶核苷）v直接計數(shù)法直接計數(shù)法工作量大工作量大v3h-tdr滲入法滲入法具有放射性具有放射性限制應用限制應用1983年年mosmann提出：提出： mtt檢測細胞生長狀況檢測細胞生長狀況優(yōu)點：優(yōu)點：v靈敏性高靈敏性高v重復性好重復性好v操作簡便操作簡便v經(jīng)濟安全經(jīng)濟安全廣泛應用廣泛應用mtt法（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比法（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法）。色法）。vmtt是一

23、種噻唑鹽，化學名是一種噻唑鹽，化學名3-（4，5-二甲基二甲基-2-噻唑）噻唑）-2，5-二苯基四氮唑二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑鹽。水溶液為黃溴鹽，商品名為噻唑鹽。水溶液為黃橙色。橙色。（五）（五）mtt檢測細胞生長狀況檢測細胞生長狀況v原理：原理：+活細胞活細胞死細胞死細胞mtt線粒體線粒體琥珀酸琥珀酸脫氫酶脫氫酶難溶性的難溶性的藍紫色結(jié)晶物藍紫色結(jié)晶物-甲臜甲臜(沉積細胞中沉積細胞中)外源的外源的+二甲基亞砜二甲基亞砜（dmso）甲臜溶解甲臜溶解+酶標儀酶標儀光吸收值光吸收值（od值）值） 490nm 此酶消失此酶消失不形成甲臜不形成甲臜可間接反應活細胞數(shù)量：在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，可間接

24、反應活細胞數(shù)量：在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，mtt結(jié)晶物形成與活細胞數(shù)成正比，結(jié)晶物形成與活細胞數(shù)成正比，od值與活值與活細胞數(shù)目成正比。細胞數(shù)目成正比。 mtt法法實驗范例實驗范例實驗用品：實驗用品：v材料：材料：hela細胞細胞v試劑：試劑：1640培養(yǎng)液、胎牛血清、培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25胰蛋白胰蛋白 酶、二甲基亞砜、酶、二甲基亞砜、mtt溶液。溶液。v設(shè)備：設(shè)備：96孔板、孔板、10ml移液管、小燒杯、移液管、小燒杯、10ml吸吸 管橡皮頭、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、倒置管橡皮頭、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、倒置 顯微鏡、離心機、水浴鍋、混合振蕩器、顯微鏡、離心機、水浴鍋、混合振蕩器、 酶聯(lián)免疫檢測儀。酶

25、聯(lián)免疫檢測儀。 （96孔板，孔板，200l/孔孔 100010000個個/孔）孔） 培養(yǎng)培養(yǎng)（35d）mtt20l孵育孵育4h棄上清棄上清150l dmso 振蕩振蕩10min od普通普通mtt法實驗步驟法實驗步驟（4000較好）較好） 以時間為橫坐標，以細胞數(shù)目或以時間為橫坐標，以細胞數(shù)目或od值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。注意事項：注意事項：v血清會干擾血清會干擾od值，所以在顯色后盡可值，所以在顯色后盡可能將孔內(nèi)殘余培養(yǎng)基吸凈。能將孔內(nèi)殘余培養(yǎng)基吸凈。v設(shè)空白對照：不加細胞僅加培養(yǎng)基的空設(shè)空白對照：不加細胞僅加培養(yǎng)基的空白對照孔，其他實驗步驟保持一致。比白

26、對照孔，其他實驗步驟保持一致。比色時，以空白孔調(diào)零。色時，以空白孔調(diào)零。應用：應用： 抗癌藥物研究抗癌藥物研究通過比較對照與通過比較對照與處理組間細胞的存活率，可以判斷處理組間細胞的存活率，可以判斷抗癌藥物的作用強度。抗癌藥物的作用強度。細胞增殖抑制率細胞增殖抑制率= (1 實驗組實驗組od值值/對照組對照組od值值)100 %（96孔板，孔板，200l/孔孔 100010000個個/孔）孔） 培養(yǎng)培養(yǎng)（35d）mtt20l孵育孵育4h棄上清棄上清150l dmso 振蕩振蕩10min od普通普通mtt法實驗步驟法實驗步驟（4000較好）較好）藥物藥物mtt法實驗步驟法實驗步驟培養(yǎng)培養(yǎng)（96

27、孔板，孔板，100l/孔孔 100010000個個/孔）孔） od4h100l dmso 振蕩振蕩10min 加藥加藥（100l/孔孔 5個復孔）個復孔）1648hmtt10lod小，細胞存活率低，抑制率高小，細胞存活率低，抑制率高od大，細胞存活率高，抑制率低大，細胞存活率高，抑制率低mtt一些細節(jié)問題一些細節(jié)問題40005000個孔個孔105 第一節(jié)第一節(jié) 細胞生長增殖研究技術(shù)細胞生長增殖研究技術(shù)二、細胞周期分析技術(shù)二、細胞周期分析技術(shù) 細胞同步化實驗細胞同步化實驗 流式細胞儀檢測細胞周期流式細胞儀檢測細胞周期 通過分析通過分析cdk的活性檢測細胞周期的活性檢測細胞周期一、細胞增殖生長力一

28、、細胞增殖生長力 細胞計數(shù)細胞計數(shù) 細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù) 細胞集落形成實驗細胞集落形成實驗 3h-tdr滲入法滲入法(氚標記胸腺嘧啶核苷氚標記胸腺嘧啶核苷) mtt檢測細胞生長狀況檢測細胞生長狀況二、細胞周期分析技術(shù)二、細胞周期分析技術(shù)v細胞同步化實驗細胞同步化實驗v流式細胞儀檢測細胞周期（見第四章）流式細胞儀檢測細胞周期（見第四章）v通過分析通過分析cdk的活性檢測細胞周期的活性檢測細胞周期細胞周期分析技術(shù)細胞周期分析技術(shù)（一）細胞同步化實驗（一）細胞同步化實驗v同步化類型同步化類型 自然同步化自然同步化 人工同步化人工同步化自然同步化：自然同步化：自然界中存在一些群體處于自然界中存在一

29、些群體處于細胞周期的同一時期細胞周期的同一時期例例1粘菌的顯型原質(zhì)團：粘菌的顯型原質(zhì)團：只進行核分裂而不進只進行核分裂而不進行胞質(zhì)分裂，同一細胞質(zhì)中可達行胞質(zhì)分裂，同一細胞質(zhì)中可達108個個細胞核，細胞直徑可達細胞核，細胞直徑可達56cm。許多動物：許多動物：雌性一次產(chǎn)多個卵雌性一次產(chǎn)多個卵（處于同一時期）（處于同一時期）例例2受精受精受精卵受精卵同步卵裂同步卵裂同步化細胞群體同步化細胞群體概念：概念：利用藥物或其他方法使細胞停止在細胞利用藥物或其他方法使細胞停止在細胞 周期的某個時相。（人為地將處于不同周期的某個時相。（人為地將處于不同 時期的細胞分離開來，從而獲得不同時時期的細胞分離開來，

30、從而獲得不同時 期的細胞群體）。期的細胞群體）。特點：特點：可調(diào)節(jié)、可恢復可調(diào)節(jié)、可恢復意義：意義：為特定細胞周期轉(zhuǎn)變、細胞動力學、細為特定細胞周期轉(zhuǎn)變、細胞動力學、細 胞周期調(diào)控以及細胞在不同時相中對藥胞周期調(diào)控以及細胞在不同時相中對藥 物的敏感性研究奠定基礎(chǔ)。物的敏感性研究奠定基礎(chǔ)。人工同步化人工同步化 溫度休克法溫度休克法 短時間饑餓法短時間饑餓法 藥物抑制法藥物抑制法 離心淘洗法離心淘洗法 使細胞停留在細使細胞停留在細胞周期的不同時相胞周期的不同時相細胞周期中的檢驗點細胞周期中的檢驗點-蛋白質(zhì)或多肽蛋白質(zhì)或多肽人工同步化人工同步化實驗范例實驗范例（1）實驗用品）實驗用品v材料：材料：h

31、ela細胞。細胞。v器材：培養(yǎng)瓶、移液器、槍頭、小燒杯、器材：培養(yǎng)瓶、移液器、槍頭、小燒杯、10 ml吸管橡皮頭、超凈工作臺、吸管橡皮頭、超凈工作臺、co2孵箱、倒孵箱、倒置相差顯微鏡、離心機。置相差顯微鏡、離心機。v試劑：無血清培養(yǎng)基、胎牛血清、試劑：無血清培養(yǎng)基、胎牛血清、1640培養(yǎng)培養(yǎng)液、液、0.25%胰蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液、pbs。（2）實驗步驟）實驗步驟血清饑餓法血清饑餓法 （將細胞周期阻滯在（將細胞周期阻滯在g0/gl）對數(shù)生長期對數(shù)生長期hela細胞細胞消化、離心、棄上清消化、離心、棄上清ph7.4 ，37預溫的預溫的pbs或無血清培養(yǎng)基洗滌或無血清培養(yǎng)基洗滌血清濃度低于血

32、清濃度低于0.5%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2448 h換為正常血清濃度的培養(yǎng)液，換為正常血清濃度的培養(yǎng)液，使細胞重新進入細胞周期使細胞重新進入細胞周期細胞約在細胞約在12 h后進入后進入s期期細胞周期阻滯在細胞周期阻滯在g0/gl（時間過長不可逆或凋亡）（時間過長不可逆或凋亡）（流式檢測細胞均一性（流式檢測細胞均一性)對數(shù)生長期對數(shù)生長期hela細胞細胞v胸苷法（誘導細胞停滯在胸苷法（誘導細胞停滯在g1/s期交界）：期交界）：添加含添加含2 mmol/l胸苷新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)胸苷新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)12h棄去含有胸苷的培養(yǎng)液，棄去含有胸苷的培養(yǎng)液，用完全培養(yǎng)液洗滌用完全培養(yǎng)液洗滌2次次鮮培養(yǎng)液孵

33、育鮮培養(yǎng)液孵育16 h。細胞停滯在細胞停滯在g1/s期交界期交界（流式檢測細胞均一性（流式檢測細胞均一性) 原理：原理：在細胞進入有絲分裂時（尤其在細胞進入有絲分裂時（尤其在分裂中期）胞體變圓，和附著底物接觸在分裂中期）胞體變圓，和附著底物接觸面積變小。在這種情況下稍加外力便可使面積變小。在這種情況下稍加外力便可使分裂細胞從底物上脫落下來。然后再分離分裂細胞從底物上脫落下來。然后再分離收集脫落細胞進行分離培養(yǎng)，便可獲得一收集脫落細胞進行分離培養(yǎng)，便可獲得一定數(shù)量的同步化細胞群。定數(shù)量的同步化細胞群。有絲分裂搖落法（將細胞截獲于有絲分裂搖落法（將細胞截獲于m期）：期）：有絲分裂搖落法（將細胞截獲

34、于有絲分裂搖落法（將細胞截獲于m期）：期）：對數(shù)生長期對數(shù)生長期hela細胞細胞3 m1 0.1%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化5 min收集松動細胞收集松動細胞(分裂期分裂期)，離心，培養(yǎng)，離心，培養(yǎng)6h棄去未貼壁的細胞（死），洗滌棄去未貼壁的細胞（死），洗滌2次，繼續(xù)培養(yǎng)次，繼續(xù)培養(yǎng)10 h輕搖培養(yǎng)瓶，輕搖培養(yǎng)瓶，收集收集m期細胞期細胞離心，孵育離心，孵育2 h，細胞進入，細胞進入g1期期（流式檢測細胞均一性（流式檢測細胞均一性)時間過長，其他周期細胞增加時間過長，其他周期細胞增加v哺乳動物細胞周期時間是哺乳動物細胞周期時間是1030h，s+g2+m=10h, m3060min有絲分裂搖落法（將

35、細胞截獲于有絲分裂搖落法（將細胞截獲于m期）：期）：對數(shù)生長期對數(shù)生長期hela細胞細胞3 m1 0.1%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化5 min收集松動細胞收集松動細胞(分裂期分裂期)，離心，培養(yǎng)，離心，培養(yǎng)6h棄去未貼壁的細胞（死），洗滌棄去未貼壁的細胞（死），洗滌2次，繼續(xù)培養(yǎng)次，繼續(xù)培養(yǎng)10 h輕搖培養(yǎng)瓶，輕搖培養(yǎng)瓶，收集收集m期細胞期細胞離心，孵育離心，孵育2 h，細胞進入，細胞進入g1期期（流式檢測細胞均一性（流式檢測細胞均一性)時間過長，其他周期細胞增加時間過長，其他周期細胞增加補充說明：補充說明：v一般細胞在指數(shù)生長期時，分裂期的細胞僅占一般細胞在指數(shù)生長期時，分裂期的細胞僅占1%5

36、%，數(shù)量還不夠充分。為增加分裂相數(shù)，一般可并用其它數(shù)量還不夠充分。為增加分裂相數(shù)，一般可并用其它能擴大分裂指數(shù)的措施如能擴大分裂指數(shù)的措施如低溫休克、秋水仙素阻滯分低溫休克、秋水仙素阻滯分裂中期法裂中期法等，其中以低溫休克簡而易行，對細胞的損等，其中以低溫休克簡而易行，對細胞的損傷小。傷小。v低溫休克法原理低溫休克法原理：隨著細胞溫度降低，細胞：隨著細胞溫度降低，細胞dna的合的合成會受抑制或停止，使很多細胞阻滯趨于成會受抑制或停止，使很多細胞阻滯趨于g1期，當恢期，當恢復復37培養(yǎng)液后，過一定時間，多量細胞可同步進入培養(yǎng)液后，過一定時間，多量細胞可同步進入 s期，隨之便出現(xiàn)一個明顯的細胞分裂

37、高潮。期，隨之便出現(xiàn)一個明顯的細胞分裂高潮。低溫處理法低溫處理法對數(shù)生長期細胞對數(shù)生長期細胞傍晚傍晚4，210h（ g1期，細胞分裂受阻能持續(xù)期，細胞分裂受阻能持續(xù)1620h）37培養(yǎng)培養(yǎng)612h次日晨取出培養(yǎng)瓶（次日晨取出培養(yǎng)瓶（80%細胞為分裂期）細胞為分裂期）吸除培養(yǎng)液（去除死和未貼壁細胞）吸除培養(yǎng)液（去除死和未貼壁細胞）加入新培養(yǎng)液，水平橫向搖動，沖刷細胞層加入新培養(yǎng)液，水平橫向搖動，沖刷細胞層倒出培養(yǎng)液，裝入另一培養(yǎng)瓶，得同步化分裂細胞倒出培養(yǎng)液，裝入另一培養(yǎng)瓶，得同步化分裂細胞（二）流式細胞儀檢測細胞周期（二）流式細胞儀檢測細胞周期 （三）通過分析通過分析cdk的活性檢測細胞周期的活性檢測細胞周期細胞周期中的檢驗點細胞周期中的檢驗點-蛋白質(zhì)或多肽蛋白質(zhì)或多肽mpf（matuation-promoting factor,促成熟因子）促成熟因子）mpf=cyclin-cdk （異質(zhì)二聚體異質(zhì)二聚體）vcyclin:周期蛋白周期蛋白(調(diào)控亞基，含量呈周期性變化調(diào)控亞基，含量呈周期性變化)vcdk（cyclin-dependent kinase）:周期蛋白依周期蛋白依賴性蛋白激酶賴性蛋白激酶(催化亞基，含量穩(wěn)定，活性周期的催化亞基，含量