谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的制備PPT課件

1、1課前思考題課前思考題 1. 關(guān)于谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶。 2. 生物大分子的制備前期實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理和蛋白質(zhì)的提取方法。 3. 親和層析的原理，影響親和層析的因素。 4. 關(guān)于配基、載體及配基的偶聯(lián)。 5. 本實(shí)驗(yàn)中Buffer A和B中各組分的作用是什么？ 6. 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問題。第1頁/共24頁2谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶簡介谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶簡介 谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（Glutathion S-transferases，簡稱GSTs，EC2.5.1.18）廣泛存在于動(dòng)物和人體的各種組織，哺乳動(dòng)物肝臟中含量最高，約占肝可溶性蛋白的10%。GST是機(jī)體內(nèi)一組具有重要解毒作用的同工酶家族，均為由兩個(gè)亞基組成的二聚體，相

2、對(duì)分子質(zhì)量為45 00049 000，各同工酶的等電點(diǎn)不同，多為堿性同工酶。第2頁/共24頁3兔肝勻漿液及純化樣品SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜第3頁/共24頁4 GST參與芳香環(huán)氧化物、過氧化物和鹵化物的解毒作用，GST催化這些帶有親電中心的疏水化合物與還原型谷胱甘肽（GSH）的親核基團(tuán)GS反應(yīng)，中和它們的親電部位，使產(chǎn)物水溶性增加，經(jīng)過一系列代謝過程，最后產(chǎn)物為巰基尿酸，被排出體外，從而達(dá)到解毒目的。另外，GST還能共價(jià)或非共價(jià)地與非底物配基以及多種疏水化合物結(jié)合，具有結(jié)合蛋白的解毒功能。 第4頁/共24頁5親和層析原理親和層析原理 有很多生物大分子與相應(yīng)的分子間具有專一的可逆結(jié)合的特性，

3、如酶與其底物、抑制劑、輔助因子，抗體與抗原，核酸與互補(bǔ)的堿基序列、核酸聚合酶、結(jié)合蛋白，激素與其受體、載體蛋白，細(xì)胞與其表面特異蛋白等等，它們依靠分子間的氫鍵、范德華力進(jìn)行結(jié)合，這種專一的可逆結(jié)合力的稱為親和力。親和層析的方法就是根據(jù)具有親和力的生物分子間可逆地結(jié)合和解離的原理建立和發(fā)展起來的。第5頁/共24頁6 將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)，制成專一的親和吸附劑，當(dāng)被分離物隨著流動(dòng)相經(jīng)過親和吸附劑時(shí)，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附待分離物質(zhì)，通過解吸附使待分離物質(zhì)得以純化。 親和層析的優(yōu)點(diǎn)：專一性結(jié)合，分辨率高，操作簡單，通過一次性操作

4、即可得到較高純度的分離物質(zhì)；具有濃縮作用，可以從含量很低的溶液中得到高濃度的樣品；利用生物學(xué)的特異性進(jìn)行分離，所以分離條件比較溫和，能夠很好地保持樣品原有的生物學(xué)性質(zhì)。第6頁/共24頁7親和層析法分離生物大分子示意圖親和層析法分離生物大分子示意圖配基 待分離的 生物分子a. 載體 手臂 配基 親和吸附劑b.第7頁/共24頁8d.與待分離物質(zhì)專一可逆結(jié)合的物質(zhì)c.樣品雜質(zhì) 第8頁/共24頁9親和層析介質(zhì)的制備親和層析介質(zhì)的制備 配基的選擇：選擇合適的配基是親和層析中的重要環(huán)節(jié)，配基可以是有機(jī)小分子、生物大分子、染料等。根據(jù)待分離物質(zhì)在溶液中與配基之間的親和力的大小和專一性等特性進(jìn)行選擇，通過實(shí)驗(yàn)

5、來確定理想的配基。例如選擇酶的競爭性抑制劑、底物和輔助因子類配基可以純化酶，選擇互補(bǔ)的堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結(jié)合蛋白類配基可以純化核酸等等。在親和層析中，分離生物大分子的配基必須有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)能與活化基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)作用，有較高的偶聯(lián)率，偶聯(lián)后配基和被分離生物大分子的專一結(jié)合特性不變，有效地分離目標(biāo)產(chǎn)物；解吸附時(shí)不破壞生物大分子的生物活性和理化性質(zhì)。第9頁/共24頁10 載體的選擇：親和層析的載體一般是凝膠類層析介質(zhì)。一般比較理想的載體應(yīng)具備稀松的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)于溶液具有良好的親水性、流動(dòng)性和滲透性，大孔徑凝膠介質(zhì)可以有效地使凝膠內(nèi)部的羥基得到活化，以保證較高的活化效率，提高了配基

6、的有效濃度，提供較高的親和容量；必須有足夠數(shù)量的化學(xué)基團(tuán)，經(jīng)化學(xué)方法活化后，可以與大量的配基相偶聯(lián)；具有良好的機(jī)械性能，保證親和柱維持較好的流速；必須是不溶于水、化學(xué)惰性的，非特異性吸附作用弱；有良好的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性，在配基偶聯(lián)、親和層析、再生處理過程中不會(huì)因離子強(qiáng)度、溫度、pH的變化，變性劑、去污劑的應(yīng)用而破壞載體的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)，在介質(zhì)的反復(fù)使用過程中能抗微生物和酶的侵蝕。第10頁/共24頁11 瓊脂糖凝膠：目前應(yīng)用最多的是瑞典Pharmacia公司生產(chǎn)的Sepharose，它具有理想載體的特性，由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖交替結(jié)合而成的大分子多聚糖，靠糖鏈之間的次級(jí)鍵交聯(lián)成的

7、穩(wěn)定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的珠狀凝膠，改變瓊脂糖濃度可控制網(wǎng)孔的大小。如Sepharose 2B，4B和6B，其中阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量，機(jī)械強(qiáng)度隨凝膠濃度降低而減弱。目前廣泛使用Sepharose 4B來分離生物大分子， 本實(shí)驗(yàn)采用的是本院自己研制的Sepharose QT4，相當(dāng)于Sepharose 4B。瓊脂糖凝膠的多聚合鏈不是由共價(jià)鍵連接而成的，在使用中應(yīng)當(dāng)注意的問題有受熱失去穩(wěn)定性，引起部分溶解，故不宜加熱消毒，低溫保存，凍結(jié)會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)，要避免在pH低于4高于9下長期工作，使用破壞氫鍵的試劑會(huì)降低凝膠的穩(wěn)定性，一般情況下不能進(jìn)行干燥，適宜濕態(tài)保存。 第11頁/共24頁12 常用活化劑

8、：活化劑一般用溴化氰和環(huán)氧氯丙烷較多，二者各有利弊： (1)溴化氰：溴化氰活化載體是目前用得最多、效果最好的活化方法?；罨矢撸俣瓤?。缺點(diǎn)是溴化氰容易分解產(chǎn)生劇毒的氫氰酸及溴，活化臂短，不利于生物大分子的結(jié)合。 (2)環(huán)氧氯丙烷：環(huán)氧氯丙烷活化效率高，活化臂較長，有利于生物大分子的結(jié)合。毒性很小，可以在常規(guī)條件下操作。缺點(diǎn)是活化溫度較高，4550，活化時(shí)間較長。 第12頁/共24頁13偶聯(lián)條件的選擇： (1)偶聯(lián)pH值：配基偶聯(lián)最佳pH在8-10之間最有效，在這個(gè)pH范圍內(nèi)配基上的氨基多是非質(zhì)子化形式，要盡可能地選用堿性條件。但是在高pH值時(shí)，配基的高級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)改變，甚至失活，所以偶聯(lián)時(shí)

9、pH的選擇要根據(jù)具體情況而定。 (2)偶聯(lián)溫度和時(shí)間：溴化氰活化的載體，一般都在4左右偶聯(lián)過夜，也可以室溫（20-25）下反應(yīng)2h。環(huán)氧氯丙烷活化的載體，一般在3545偶聯(lián)。偶聯(lián)時(shí)間要根據(jù)配基的濃度來確定，一般情況要1624小時(shí)。 (3)偶聯(lián)配基的濃度：偶聯(lián)時(shí)并不總是需要大量的配基才能制成高效的親和吸附劑，高濃度配基的偶聯(lián)可以增加結(jié)合強(qiáng)度、空間位阻和非特異性結(jié)合，空間位阻可使親和吸附劑結(jié)合效率的降低，尤其是當(dāng)高濃度大分子蛋白被偶聯(lián)時(shí)。對(duì)于多數(shù)親和吸附劑選用的配基濃度是1-20mol/mL gel，2mol/mL是最常用的配基使用量。第13頁/共24頁14親和層析技術(shù)親和層析技術(shù) 吸附條件的選擇

10、 ：純化生物大分子一般采用柱層析吸附法，根據(jù)親和吸附劑的吸附容量和待分離物質(zhì)的總量選擇大小合適的層析柱。選擇吸附條件時(shí)要考慮平衡緩沖液的組成、pH范圍和離子強(qiáng)度，樣品上柱的體積、溫度和流速等因素，使親和介質(zhì)與被分離物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和力。樣品溶液的pH和離子強(qiáng)度要與平衡緩沖液一致，一般接近中性。假如樣品中雜質(zhì)多，純化對(duì)象與配基結(jié)合力弱時(shí)，可以控制樣品上柱的流速或重復(fù)過柱，以使純化對(duì)象與配基間充分起作用。樣品上柱后，用平衡緩沖液除去未吸附的雜蛋白，也可以用較高離子強(qiáng)度的鹽溶液進(jìn)一步洗去非專一吸附的雜質(zhì)，盡可能在親和柱上只留下專一吸附的結(jié)合物。 第14頁/共24頁15 洗脫條件的選擇 ：親和層析的洗

11、脫屬于特異性的解離方式，洗脫劑的選擇必須不引起待分離物的變性失活。洗脫劑多數(shù)采用改變層析條件如改變pH、離子強(qiáng)度或緩沖液組成的方法，使固定化配基和生物大分子之間的親和力降低，以致解開二者的結(jié)合。主要有幾種基本洗脫類型： (1)競爭性洗脫：特異的配基競爭性洗脫或底物競爭性洗脫，即在洗脫液中加入與親和吸附劑上相同或不同的配基，這些水溶性的配基和固定相配基相互競爭與大分子結(jié)合，由于前者游離的配基較高，結(jié)合力大大超過后者時(shí)，將被吸附的大分子洗脫下來。使用親和力更強(qiáng)的配基或底物洗脫效果更好。洗脫液中配基或底物的濃度要根據(jù)配基與結(jié)合物親和力的大小來決定。 (2)離子強(qiáng)度洗脫：洗脫液離子強(qiáng)度增加有利于洗脫，

12、可以是一步法或梯度變化，在強(qiáng)離子的作用下，使親和層析的結(jié)合力減弱，將被吸附物洗脫下來。增加鹽濃度可以使被吸附物解吸附，NaCl是最常用的鹽。 第15頁/共24頁16 (3)pH離子強(qiáng)度洗脫：pH的變化改變結(jié)合位點(diǎn)上帶電基團(tuán)的離子化程度，解吸附一般是降低pH， pH使用的限度要考慮載體、配基和被吸附物質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性。pH變化和離子強(qiáng)度雙重作用洗脫適合結(jié)合得比較牢的物質(zhì)。 (4)變性劑洗脫：有的蛋白質(zhì)在親和介質(zhì)上結(jié)合得比較牢固，在一定濃度的變性劑中有較好的穩(wěn)定性，這樣可以在洗脫液中加入變性劑，如鹽酸胍，尿素等，有利于蛋白質(zhì)的解離。另外，親和介質(zhì)多次使用后，柱效下降，用變性劑可以將吸附比較牢固的雜質(zhì)

13、洗凈，使親和介質(zhì)再生。 (5)化學(xué)斷裂：當(dāng)一些蛋白質(zhì)與親和吸附劑結(jié)合牢固，上述洗脫方法或用上述方法洗脫被吸附的大分子會(huì)發(fā)生不可逆失活時(shí)，可以采用專一的化學(xué)方法將配基和載體之間的連接鍵裂解，獲得配基蛋白質(zhì)復(fù)合物。這個(gè)方法的缺點(diǎn)是親和吸附劑使用一次后，需要重新與配基偶聯(lián)后，才能再次使用。第16頁/共24頁17 洗脫方式：親和層析的洗脫方式，原則上與離子交換層析的洗脫方式相似，主要有以下三種方式： (1)一步洗脫：屬于非選擇性洗脫方法，應(yīng)用于高度特異性吸附劑的結(jié)合，經(jīng)過一次洗脫將被吸附物質(zhì)全部洗脫下來，就可得到較純的分離物。非選擇性洗脫主要受洗脫液的pH、離子強(qiáng)度、溫度和介電常數(shù)等因素的影響，有效的

14、洗脫液既能改變被吸附蛋白質(zhì)的構(gòu)象以降低蛋白質(zhì)與配基之間的親和力，又不破壞蛋白質(zhì)和親和吸附劑的穩(wěn)定性。 (2)分步洗脫：屬于選擇性洗脫方法，應(yīng)用于基團(tuán)特異性吸附劑，親和吸附劑上吸附有特異性不盡相同的多組分樣品，用幾種不同的洗脫條件分幾步洗脫，可以將親和力大小不同的組分分開。 (3)梯度洗脫：屬于選擇性洗脫方法，利用洗脫液的濃度梯度變化，即解吸附能力逐漸增強(qiáng)，對(duì)于吸附性質(zhì)相同、特異性程度不同的酶和同工酶有效地洗脫。梯度洗脫比分步洗脫更有可能得到較純的分離對(duì)象。此方法需要有梯度混合儀來實(shí)現(xiàn)洗脫液的梯度變化。 第17頁/共24頁18影響親和層析的主要因素 ： (1)樣液體積的影響：在平衡條件下分離對(duì)象

15、與固定化配基能緊密結(jié)合時(shí)，樣品溶液上柱時(shí)對(duì)體積要求不很嚴(yán)格，親和吸附劑的吸附總?cè)萘磕鼙怀浞掷?。與吸附劑結(jié)合力弱的樣品濃度要高，避免和非吸附物質(zhì)一起流掉。 (2)流速的影響：發(fā)生親和吸附時(shí)配基與生物大分子之間達(dá)到結(jié)合反應(yīng)平衡是一個(gè)緩慢的過程，因此樣品上柱的流速應(yīng)保證被結(jié)合物與配基之間有足夠的時(shí)間達(dá)到吸附平衡，尤其是弱的親和吸附劑。如果流速較快，樣品中蛋白質(zhì)濃度又相對(duì)高時(shí)，往往有少量的待分離樣品和雜蛋白一起流出柱子，所以親和層析上柱樣品濃度大時(shí)，如組織勻漿液、腹水等，上柱前可將溶液適度稀釋，降低溶液的粘度并使親和吸附反應(yīng)完全。洗脫時(shí)為得到尖銳的洗脫峰、被分離物最小的洗脫體積和最大的回收，一般采用

16、低的洗脫速度。第18頁/共24頁19 (3) 柱長的影響：多數(shù)情況下根據(jù)親和介質(zhì)的吸附容量和待純化樣品的總量確定柱子的大小。如果親和介質(zhì)的吸附容量高，可選擇較短的柱子，用較慢的線性流速，使待分離物質(zhì)得以快速分離；如果親和吸附劑的親和性很低，選擇相對(duì)較長的柱子，保證待分離物與親和介質(zhì)有充分接觸的時(shí)間，使二者較好地結(jié)合。 (4) 溫度的影響：溫度效應(yīng)在親和層析中非常重要，親和介質(zhì)的吸附強(qiáng)度隨溫度升高而減小。所以在親和層析中可以利用不同的溫度吸附和洗脫有利于蛋白質(zhì)的親和純化，以得到親和層析最好的結(jié)果。一般選擇在4進(jìn)行吸附，在不影響生物大分子活性的較高溫度下如25進(jìn)行洗脫。第19頁/共24頁20親和層

17、析法分離親和層析法分離GSTGST的試劑的試劑緩沖液A：0.025mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/L二硫蘇糖醇（DTT），1mmol/L EDTA，0.2mol/L NaCl緩沖液B：0.025mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/L GSH，2mmol/L DTT 注：根據(jù)酶的性質(zhì)在分離純化過程中需要加入適量的金屬鰲合劑、還原劑等，以保持酶的活性。第20頁/共24頁21親和層析法分離親和層析法分離GSTGST操作步驟操作步驟1. 親和層析介質(zhì)Sepharose 4B-GSH的制備： Sepharose 4B在堿性條件下，加入環(huán)氧氯丙烷和二氧六環(huán)活化，將GSH偶聯(lián)到載體上，制成專一吸附劑。2. 親和層析柱的準(zhǔn)備： 裝柱，柱床體積約46mL（柱高約23cm），連接蛋白監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，用Buffer A平衡（約1020mL），至記錄儀基線平穩(wěn)。第21頁/共24頁223. 上柱樣品的準(zhǔn)備： (1) 按照兩組4g兔肝，剪碎，加入約10倍組織