細(xì)胞色素P4503A4抗原表位分析及其抗體制備及鑒定

1、細(xì)胞色素p450 3a4抗原表位分析及其抗體制備及鑒定作者：劉海英，楊微 武正華，唐曉波，朱大嶺畢業(yè)論文【關(guān)鍵詞】；cyp3a4;,合成肽;,多克隆抗體，畢業(yè)論文摘要;目的：制備兔抗人細(xì)胞色素p450 3a4 （cyp3a4 ）抗體及其特性鑒定。方法：利用生物信息學(xué)方 法分析cyp3a4蛋白的序列，根據(jù)親水性、抗原性、柔韌 性及表面性等指標(biāo)選擇多肽序列，合成cyp3a4多肽，與載體蛋白鑰孔戚血藍(lán)素（klh ）偶聯(lián)，免疫日本大耳白兔制備抗cyp3a4抗體。辛酸硫酸鍍法純化抗體，間接elisa測(cè)定抗體的效價(jià)及相對(duì)親和力常數(shù)，western blot鑒定其特異性,免疫組化進(jìn)行定位。結(jié)果：獲得針對(duì)小分

2、子cyp3a4的抗體。該抗體效價(jià)為1:16000;相對(duì)親和力常數(shù)在105-106 m-1,具有實(shí)用價(jià)值；可與cyp3a4合成肽及天然cyp3a4出現(xiàn)特異性反應(yīng)；可識(shí)別正常人肝臟組織cyp3a4; western blot的結(jié)果顯示，該抗體識(shí)別的相應(yīng)抗原的相對(duì)分子質(zhì)量（mr） 為46000o結(jié)論：合成的多肽klh復(fù)合物具有免疫原性，可 用于制備相應(yīng)的抗體。制備的兔抗cyp3a4合成肽抗體可應(yīng) 用于elisa、western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)。畢業(yè)論文關(guān)鍵詞jcyp3a4;合成肽；多克隆抗體 細(xì)胞色素3a4（cyp3a4）是細(xì)胞色素p450超家族成員之一，主要存在于肝臟中、小腸中。它是人類藥

3、物代謝酶 中的最重要的酶，在臨床上超過(guò)半數(shù)的藥物完全或部分地被 該酶代謝1。cyp3a4與外源性致癌物、抗癌藥物和內(nèi)源 性類固醇激素、維生素、脂肪酸的代謝轉(zhuǎn)化密切相關(guān)2, 3。 目前，國(guó)外已研制出抗cyp3a4的抗體并且應(yīng)用試驗(yàn)中；而 國(guó)內(nèi)在研制cyp450抗體領(lǐng)域?qū)儆诳瞻纂A段，我們研制出針 278-292位的抗人cyp3a4抗體，并將對(duì)cyp3a4功能 的研究、體外藥物代謝及對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控的腫瘤防治提 供新的思路。畢業(yè)論文1；材料和方法畢業(yè)論文1.1；材料 日本大耳白兔,；雄性，6周齡，由哈爾濱醫(yī) 科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。福氏佐劑及3,3,5,5四甲基聯(lián)苯 胺（tmb ）均購(gòu)自sigma公

4、司。hrp山羊抗兔igg購(gòu)自 jackson immunoresearch公司。牛血清白蛋白（bsa ）購(gòu) 自solarbio公司。硝酸纖維素膜（nc ）購(gòu)自biorad公司。 ecl plus 購(gòu)自 amersham biosciences 公司。即用型 sabc 免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。其他試 劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。多肽合成及其與klh、bsa的聯(lián)接由 北京中科亞光生物有限公司完成。正常人肝臟組織，由“人類 肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃”項(xiàng)目提供。 畢業(yè)論文1.2;方法 畢業(yè)論文1.2.1; cyp3a4抗原表位的分析；由swissprot網(wǎng) 站獲知cyp3a4蛋白的序列，然后利用d

5、nastar軟件分析 其序列的特點(diǎn)，確定278-292位15個(gè)氨基酸作為欲合成的 多肽序列：sqnsketeshkalsdo畢業(yè)論文1.2.2; cyp3a4多肽的合成及其與klh和bsa的交聯(lián);cyp3a4多肽由北京中科亞光生物有限公司合成；獲得的多肽經(jīng)常規(guī)c18的rp2hplc柱進(jìn)行純化，純度達(dá)95%ocyp3a4與klh和bsa的交聯(lián)采用戊二醛連接法，將5 mg 合成多肽分別加入7 mg klh和bsa中，邊振蕩邊緩慢加入新鮮配制的3 g/l的戊二醛溶液（1 ml ）,室溫作用2 h。以 ph8.5硼酸緩沖液透析過(guò)夜，交聯(lián)成cyp3a4klh .cyp3a4bsa偶聯(lián)物。畢業(yè)論文1.2.

6、3;兔抗cyp3a4多肽抗體的制備；每只取200 pg 多肽klh偶聯(lián)物與等量的完全福氏佐劑充分乳化后，于兔 背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)約100 pg。2周后加強(qiáng)免疫，劑量 同前，用不完全福氏佐劑充分乳化后，于兔背部皮下多點(diǎn)注 射；以后隔2周加強(qiáng)1次；從第3次加強(qiáng)免疫開始，每次免 疫后7 d,經(jīng)耳緣靜脈采血測(cè)定抗體的效價(jià)4, 5o經(jīng)4次加 強(qiáng)免疫后，符合要求，立即頸動(dòng)脈取血。分離血清后，無(wú)菌分 裝保存于80°c備用。畢業(yè)論文1.2.4;人肝臟微粒體蛋白制備；取10 g正常人的肝 臟、剪碎，用磷酸鉀鹽緩沖液反復(fù)沖洗除去血紅蛋白后，加 入上述磷酸鉀鹽緩沖液制成肝勻漿。然后將肝勻漿依次于4&#

7、176;c以10000g離心30 min,取上清液，以30000 g離心60 min,取上清液及100000 g離心60 min,取沉淀后，懸浮于 磷酸鉀鹽緩沖液(含有200 ml/l甘油，5 g/l膽酸鈉,2 mg/l 抑肽酶,2 mg/l亮肽素，1 mg/l胃酶抑素及1 mmol/l苯甲基 磺酰氟)中，用bradford法進(jìn)行蛋白定量。分裝后，置于 80°c冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆?。畢業(yè)論文1.2.5;抗血清的純化；用醋酸鈉緩沖液(60 mmol/l,ph=4.0 )將抗血清稀釋34倍，0.1 mol/l naoh調(diào)節(jié)ph至4.5,緩慢滴加辛酸至濃度為25 ml/l,室溫?cái)嚢?0 mino

8、 4°c 10000 g離心30; min,棄沉淀后濾膜(0.22 pm )過(guò)濾, 加入 仍0體積的10xpbs,用0.1 mol/l naoh調(diào)節(jié)ph至7.4,緩慢加入預(yù)冷的飽和硫酸錢至45%飽和度，混合后49過(guò)夜。49 3000 g離心30 min,棄上清后，用0.01 mol/lpbs ( ph=7.4 )重懸,透析過(guò)夜。用branford法進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)sdspage分離后，用biorad quantity one軟件分析其純度。畢業(yè)論文1.2.6; elisa檢測(cè)抗血清效價(jià);elisa檢測(cè)板用以多肽bsa偶聯(lián)物以1 mg/l的濃度包被，每孔100 pl, 49孵育過(guò)夜后，

9、用10 ml/l的牛血清封閉，每孔200 pl, 37°c 2 h后,洗滌備用。取出包被好的檢測(cè)板，每孔加入按1:2梯度稀釋 的抗血清100 pl (對(duì)照為正常兔血清)，379孵育30 min,洗 滌3次后每孔加入1 :5000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗兔igg100 pl, 37°c孵育15 min,洗滌3次后進(jìn)行tmb顯色,37°c孵育15 min,終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀式測(cè)定樣品a450值.畢業(yè)論文1.2.7;間接elisa檢測(cè)抗血清親和常數(shù)；elisa 檢測(cè)板分別用多肽交聯(lián)bsa包被成5 mg/l和10 mg/l,封 閉后加入倍比稀釋的已知蛋白濃度的純化后的多抗

10、，再加入 hrp標(biāo)記的羊抗兔igg二抗,tmb顯色測(cè)定a450。以抗體 濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，a值為縱坐標(biāo)作圖。以曲線達(dá)到水平 的a值為100%,求出a50即50%a值時(shí)對(duì)應(yīng)的抗體濃度.按照kaf仁(n1)/2(nabl t2abt)算出抗體親和常數(shù)，其 中ab't、abt指的是a50時(shí)即包被分別5 mg/l和10 mg/l時(shí)抗體半飽和時(shí)抗體的摩爾濃度，agt, agt指的是包 被的抗原濃度本實(shí)驗(yàn)中即指10 pg和5 pg, n=agt/agjt,本 實(shí)驗(yàn)中n=26o畢業(yè)論文1.2.8;多克隆抗體的western blot分析；用2xsds上樣緩沖液懸浮制備的人肝臟微粒體蛋白、多肽bsa

11、及bsa, 于95°c加熱5 min,置于冰上冷卻10 min。上樣量分別為70、 15和15 pg,經(jīng)sdspage分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。經(jīng)脫脂奶粉封閉（室溫1 h ）后，依次滴加1:1000 稀釋抗血清（49過(guò)夜，以1 ml/l tween20 tbs洗膜3次） 及1:10000 hrp山羊抗兔igg （室溫孵育1 h,以1 ml/l tween20 tbs洗膜3次）b用化學(xué)發(fā)光劑試劑盒（ecl plus ） 處理5 min后，于暗室曝光到x膠片上顯影、定影。畢業(yè)論文1.2.9;多克隆抗體的免疫組化染色；取出用丙酮固定的冰凍人正常肝臟組織切片，滴加50 g/l b

12、sa,室溫下封閉20 min,加入1:1000稀釋兔抗人cyp3a4多肽抗體,49孵育過(guò)夜。pbs洗片后加入羊抗兔igghrp, 379孵育20 min,pbs洗片后進(jìn)行dab顯色蘇木素復(fù)染，返藍(lán)后，脫水、；透明、封片，鏡檢，放大400倍拍照記錄結(jié)果7。畢業(yè)論文2;結(jié)果畢業(yè)論文2.1; cyp3a4的氨基酸序列分析；用dnastar軟件對(duì) 蛋白序列進(jìn)行分析（圖1）,根據(jù)親水性、抗原性、表面 性及柔韌性4個(gè)參數(shù)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行綜合考慮，選取欲合成的多肽序列為278-292位氨基酸（圖中陰影區(qū)）：sqnsketeshkalsdo圖1; dnastar軟件對(duì)人cyp3a4蛋白序列參數(shù)的預(yù)測(cè) 略畢業(yè)論文

13、2.2; cyp3a4合成肽抗原的合成與純化；化學(xué)合成的 多肽經(jīng)hplc純化后，純度可達(dá)95%,交聯(lián)klh后可作為抗 原免疫動(dòng)物。畢業(yè)論文2.3;抗血清的特性鑒定；效價(jià)測(cè)定：間接elisa法 檢測(cè)表明，抗血清的效價(jià)為1:16000o相對(duì)親和力常數(shù)測(cè) 定：純化抗血清按1:2的蛋白濃度倍比稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 如圖2所示，結(jié)果表明相對(duì)親和力常數(shù)在105-106 m-1o 抗體特異性鑒定：以制備的人肝臟微粒體蛋白、多肽bsa、 bsa作為抗原，以兔抗血清作為一抗進(jìn)行western blot分析 顯示，；抗血清與人肝臟微粒體蛋白在mr約為46000處出現(xiàn) 1條清晰帶，與cyp3a4 mr相符；與多肽bs

14、a在mr約為 69000處出現(xiàn)1條清晰帶，與bsamr相符；而與bsa則無(wú) 條帶出現(xiàn)（圖3 b說(shuō)明所制備的抗體可識(shí)別含有半抗原的抗 原表位的蛋白并能與天然cyp3a4蛋白結(jié)合。畢業(yè)論文圖2 圖3;略畢業(yè)論文2.4;兔抗人cyp3a4多克隆抗體的免疫組化定位; cyp3a4主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜，而二者位于胞質(zhì) 中。經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)證明，cyp3a4多肽多克隆抗體可與正 常人肝細(xì)胞胞質(zhì)中的cyp3a4蛋白結(jié)合（圖4 b畢業(yè)論文圖4;兔抗人cyp3a4多克隆抗體的免疫組化定位分 析略畢業(yè)論文3;討論畢業(yè)論文國(guó)外abeam、researchd、cypex公司已研制出用 于elisa、wester

15、n blot和免疫組化的抗cyp3a4抗體，但 上述公司抗體僅能應(yīng)用部分試驗(yàn)。而本實(shí)驗(yàn)室的抗cyp3a4 抗體可完全用于以上試驗(yàn)。表位是抗原分子中決定抗原特異 性的特殊化學(xué)基團(tuán)，找到個(gè)抗原的表位，就可能研制出針 對(duì)該抗原的抗體或疫苗。結(jié)合現(xiàn)代生物信息學(xué),用多參數(shù)的綜 合預(yù)測(cè)抗原表位可以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性8。本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行蛋 白質(zhì)序列表位分析時(shí)，著重考慮了以下幾個(gè)方面9:親水 性高。疏水性片段往往為跨膜成分或嵌入膜成分；而親水性 片段多暴露在脂質(zhì)雙分子膜外，容易形成抗原識(shí)別位點(diǎn)。 表面可及性強(qiáng)。柔韌性好，更易形成三維結(jié)構(gòu)，暴露抗原 表位。連續(xù)性表位的氨基酸殘基數(shù)在1020之間為宜，過(guò) 短時(shí)不易形成明

16、顯的表位，過(guò)長(zhǎng)則合成時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)增 加。根據(jù)以上原因最終確定以親水性強(qiáng)、抗原指數(shù)高、表 面性及柔韌性好的區(qū)域（即278-292位14個(gè)氨基酸）作為 cyp3a4的抗原決定簇。雖然合成肽與載體蛋白（klh ）偶 聯(lián)可增加免疫原性，但也會(huì)產(chǎn)生一定的抗klh的抗體10o 所以，在間接elisa法中包被抗原用多肽bsa而不是多肽klh,以避免klh的干擾。同樣原因，在western blot實(shí)驗(yàn)中，用多肽bsa和bsa各作抗原，以避免klh的干擾。本 實(shí)驗(yàn)中獲得的抗血清與人肝微粒體蛋白的免疫印跡分析結(jié) 果顯示2條特異性條帶，一條mr是46000,另一條大約是90000o我們認(rèn)為90000的條帶可能

17、是cyp3a4的二聚體?？贵w的親和力是指抗體和抗原結(jié)合的牢固程度。多克隆血清 是含有不同親和力抗體的復(fù)雜混合物，因此，多克隆血清的 親和力不能精確測(cè)定下來(lái)，但可制定其平均相對(duì)親和力x。 根據(jù)文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)中相對(duì)親和力在105-106 m-1,對(duì)確定 抗體的用途和驗(yàn)證抗體的均一性等均有重要價(jià)值。總之，我 們以合成肽klh為抗原免疫家兔制備了抗cyp3a4pab,western blot分析pab的特異性良好、效價(jià)高，為后 續(xù)cyp3a4分子功能的研究和與藥物代謝的研制及應(yīng)用提 供了有用的工具。畢業(yè)論文參考文獻(xiàn)：畢業(yè)論文1 lee ji, chaves g, amico ja, et al. app

18、lication of semisimuhaneous midazolam administration for hepaticand intestinal cytoehrome p450 3a; phenotypingj.phamacogene genom, 2002, 72(6): 718-728.畢業(yè)論文2 邱星輝，冷欣夫.細(xì)胞色素p450與癌癥因治療j.生命的化學(xué)，2000, 20(5): 238-239.畢業(yè)論文3 柳曉泉，王廣基，錢之玉.細(xì)胞色素p450酶在藥物代謝及開發(fā)研究中的應(yīng)用j藥學(xué)進(jìn)展，2000, 24 ( 6 ): 334-338.畢業(yè)論文4 黃；永，陳蘇民，陳南春，等.yggg截?cái)嗟鞍椎谋磉_(dá)及其抗體的制備j細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2004, 20(2): 171-173.畢業(yè)論文