聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分子生物學(xué)PPT課件

1、聚合酶鏈反應(yīng)稱皮克(pg)水平的DNA特異地?cái)U(kuò)增100萬倍左右，達(dá)到微克( g)水平。第1頁/共108頁在分子生物學(xué)、基因工程研究，以及遺傳病、傳染病和惡性腫瘤等基因診斷和研在分子生物學(xué)、基因工程研究，以及遺傳病、傳染病和惡性腫瘤等基因診斷和研究中得到廣泛應(yīng)用。究中得到廣泛應(yīng)用。第2頁/共108頁第3頁/共108頁第4頁/共108頁 70年代的初期由Dr. H. Klenow發(fā)現(xiàn)了較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的Klenow fragment of E. Coli ； 1976年從 溫泉中的細(xì)菌（Thermus aquaticus）分離出來的Taq polymerase ，它的特性能耐高溫。 80年代

2、之后它被廣泛運(yùn)用； 1983年美國Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)方法； 1985年美國PE-Cetus公司開發(fā)出了具有應(yīng)用價(jià)值的PCR技術(shù)； 1987年引入了耐高溫的DNA聚合酶，從而使PCR成為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，而迅速在世界各地推廣。 1993年Mullis也因此獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)第5頁/共108頁Kary B Mullis (1944-)l 1983 年提出PCR方法l 19931993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)第6頁/共108頁 一、一、PCR基本原理基本原理 PCR是一項(xiàng)是一項(xiàng)DNA體外合成技術(shù)體外合成技術(shù)，類似于生物體內(nèi)的類似于生物體內(nèi)的DNA復(fù)制過程。復(fù)制過程。 依據(jù)依據(jù)

3、DNA半保留復(fù)制的機(jī)理。半保留復(fù)制的機(jī)理。 PCR合成合成DNA比細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程簡單。比細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程簡單。第一節(jié)第一節(jié) PCR技術(shù)的原理和特點(diǎn)技術(shù)的原理和特點(diǎn)第7頁/共108頁細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程1）細(xì)胞內(nèi)有關(guān)蛋白質(zhì)參與下，DNA雙螺旋解鏈成兩條單鏈，各自作為模板。2）引物酶以兩條單鏈為模板各自合成一段引物，引物提供3-OH末端。3）DNA聚合酶以親代DNA單鏈為模板，以dNTP為原料，按照堿基配對(duì)的原則，從引物的3端，循53方向，將脫氧核苷酸聚合，最終形成子代的DNA雙鏈。第8頁/共108頁Denaturing95CAnnealingTm-5CExtension72CPCR的原理的原理第9頁/

4、共108頁P(yáng)CR的基本過程的基本過程1.變性：將反應(yīng)體系升溫至95左右，樣品中雙鏈DNA解開成兩條單鏈，各自作為模板（待拷貝的 DNA 稱為模板） 。2.退火：將溫度降至引物的Tm值以下( (55左右) )，5端和3端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合。5533編碼鏈3端引物5端引物33第10頁/共108頁3. 延伸：將溫度升到75左右，耐熱的Taq DNA聚合酶催化四種 dNTP，從引物3-OH端開始，依據(jù)模板堿基序列互補(bǔ)方式依次聚合，合成一條互補(bǔ)的DNA鏈。55335DNA聚合酶5第11頁/共108頁Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2

5、530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬倍以上。萬倍以上。第12頁/共108頁第13頁/共108頁P(yáng)CR的擴(kuò)增效應(yīng) 理論上，每增加1個(gè)循環(huán)，雙鏈DNA片段會(huì)增加1倍，使DNA量可成指數(shù)(2n)增加。 實(shí)際上，擴(kuò)增效應(yīng)低于指數(shù)增加，約為(1+X)n。 一般進(jìn)行30個(gè)左右的循環(huán)，特定區(qū)域的DNA量可至少增加 106 倍。第14頁/共108頁P(yáng)CR產(chǎn)物的積累規(guī)律 PCR反應(yīng)初期，目的DNA片段的增加呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的逐漸積累，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的增幅減慢，即出現(xiàn)“平臺(tái)效應(yīng)”。到達(dá)平臺(tái)期所需要的循環(huán)次數(shù)一般在30次循環(huán)之后。

6、第15頁/共108頁 PCR DNA復(fù)制復(fù)制部位部位： DNA體外合成放大過程 生物體內(nèi)DNA合成引物：引物： DNA引物 RNA引物 （作為新鏈的一部分） （復(fù)制終止時(shí)被切除）催化酶：催化酶：TaqDNA聚合酶 DNA聚合酶 有5 3核酸外切酶 有5 3核酸外切酶 無3 5核酸外切酶 有3 5核酸外切酶基本過程：基本過程：每循環(huán)一次包括 復(fù)制起始、鏈延伸和 變性、退火、延伸 終止三階段反應(yīng)實(shí)質(zhì)：反應(yīng)實(shí)質(zhì)：擴(kuò)增靶DNA 合成子代DNA第16頁/共108頁P(yáng)CR儀 聚合酶鏈反應(yīng)中的變性、退火、延伸的溫度和時(shí)間，以及循環(huán)次數(shù)，是由具有程控的快速升溫和快速降溫裝置的PCR儀控制。第17頁/共108頁

7、第18頁/共108頁第19頁/共108頁P(yáng)CR儀越快，越精確，越昂貴第20頁/共108頁ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀儀 普通梯度普通梯度PCR儀儀第21頁/共108頁第22頁/共108頁二、PCR技術(shù)的特點(diǎn)1. 高度的敏感性：可將極微量(pg)DNA，擴(kuò)增到紫外光可見的水平( (ug) )，這是最主要的特點(diǎn)，它可對(duì)單拷貝基因、單個(gè)細(xì)胞、單根頭發(fā)、一滴血等微量標(biāo)本進(jìn)行分析。第23頁/共108頁2. 高度的特異性：PCR擴(kuò)增的特異性由兩個(gè)引物的序列決定，因此引物設(shè)計(jì)至關(guān)重要。 引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；遵循堿基配對(duì)原則；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 靶基因的特異

8、性與保守性。第24頁/共108頁基因組第25頁/共108頁3. 適用樣品的廣泛性： 對(duì)樣品的要求并不十分嚴(yán)格： 1) )可以是DNA，也可以是RNA 2) )可以是純化的，也可以是粗制的 3) )可以是新鮮組織，也可以是陳舊組織 4) )可以是細(xì)胞，也可以是體液4. 操作簡便、快速：PCR自動(dòng)化，數(shù)小時(shí)完成。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。 第26頁/共108頁三、參與三、參與PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 的因素及其作用的因素及其作用模板引物Taq DNA聚合酶dNTPMg2+ 緩沖液 反應(yīng)溫度 循環(huán)次數(shù) PCR儀等n PCR體系第27頁/共108頁（一）模板（一）模

9、板核酸核酸 1. 1. 模板：指能擴(kuò)增靶DNA片段的核酸2. 2. DNA是直接模板，RNA是間接模板 RNA樣品必須先經(jīng)過樣品必須先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄生成生成cDNA， cDNA作為作為PCR擴(kuò)增擴(kuò)增的的模板模板。這個(gè)技術(shù)稱為。這個(gè)技術(shù)稱為逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。）。第28頁/共108頁 病原體標(biāo)本：病原體標(biāo)本：有病毒、細(xì)菌、真菌、螺有病毒、細(xì)菌、真菌、螺旋體、立克次體、支原體等。旋體、立克次體、支原體等。 病理生理標(biāo)本：病理生理標(biāo)本：有細(xì)胞、血液、絨毛、有細(xì)胞、血液、絨毛、羊水細(xì)胞、尿液、上皮細(xì)胞、體外培養(yǎng)羊水細(xì)胞、尿液、上皮細(xì)胞、體外培養(yǎng)細(xì)胞系。細(xì)胞系。 法醫(yī)學(xué)標(biāo)本：法醫(yī)學(xué)標(biāo)本

10、：有血斑、精斑、毛發(fā)等。有血斑、精斑、毛發(fā)等。 考古標(biāo)本：考古標(biāo)本：殘留有核酸物質(zhì)殘留有核酸物質(zhì)3. 3. 常見的擴(kuò)增對(duì)象( (含核酸的標(biāo)本) )：第29頁/共108頁4.4.避免有影響擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)存在 如：核酸酶：降解DNA、RAN 蛋白酶：降解Taq DNA聚合酶 血紅素、抗凝劑：抑制Taq DNA聚合 酶活性理論上，要獲得最好的特異性及忠實(shí)性的擴(kuò)增只向反應(yīng)體系中加入單一拷貝的靶序列DNA作為模板。 第30頁/共108頁人基因組人基因組DNA0.1-1 g大腸桿菌基因組大腸桿菌基因組DNA10-100 ngDNA0.5-5 ng質(zhì)粒質(zhì)粒DNA0.1-10 ng5. 模板量要合適，一般為1

11、02105拷貝。50l PCR反應(yīng)體系中模板DNA推薦使用量 第31頁/共108頁（二）引（二）引 物物1）引物：2條人工合成的、能與模板DNA互補(bǔ)結(jié)合的脫氧寡核苷酸。1. 1. 引物的性質(zhì)和作用第32頁/共108頁2）引物的序列：根據(jù)欲擴(kuò)增的DNA片段兩端序列而設(shè)計(jì)的。5端引物：與模板鏈的5端序列相同；3端引物：與模板鏈的3端序列互補(bǔ)。5533模板鏈3端引物5端引物33第33頁/共108頁3)3) 引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和 長度。4) ) 引物設(shè)計(jì)決定PCR反應(yīng)的成敗。特異性：引物只針對(duì)DNA的一個(gè)特定序列互補(bǔ)結(jié)合，因此2條引物與DNA模板特異性結(jié)合決定了要擴(kuò)增的DNA區(qū)域。長度：2

12、條引物分別互補(bǔ)于所要擴(kuò)增DNA片段的兩端，使DNA片段的擴(kuò)增只限于引物之間的部位。第34頁/共108頁2. 引物設(shè)計(jì)的基本要求1）引物長度要合適，一般為1630個(gè)核苷酸，常用20bp左右。 引物過短：會(huì)影響PCR的特異性； 引物過長：需提高相應(yīng)的退火溫度，若超過延伸溫度即Taq DNA酶的最適溫度，則影響PCR反應(yīng)產(chǎn)物。第35頁/共108頁2）G+C含量一般占5060，有利于引物與模板的結(jié)合。G C太少擴(kuò)增效果不佳，G C過多易出現(xiàn)非特異條帶。3） ATCG 4 種堿基隨機(jī)分布，避免連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好隨機(jī)分布。否則易使引物與模板的嘌呤或嘧啶密集區(qū)發(fā)生錯(cuò)配。4

13、）引物內(nèi)部不能存在互補(bǔ)序列，以避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。5）兩個(gè)引物之間不能存在互補(bǔ)序列，以避免形成引物二聚體。第36頁/共108頁6）引物與非特異性序列的同源性不能超過70%或不能有連續(xù)8個(gè)堿基互補(bǔ)，否則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。7）引物3末端堿基一定要與模板正確配對(duì)，引物3端最佳堿基選擇是G和C。8）引物的5端可以修飾，如：引入酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列、用熒光素、生物素等標(biāo)記等9）引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。 第37頁/共108頁3GC第38頁/共108頁3.3.引物的使用要求 引物濃度要遠(yuǎn)高于模板濃度，一般每條引物的濃度0.1 0.5 mol，以最低引物量產(chǎn)

14、生所需要的結(jié)果為好。引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 合適的退火溫度比引物本身的Tm低 5 ，一般在 55 左右。第39頁/共108頁（三）（三）Taq DNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶是從一種水生棲嗜熱菌YT1株(一種嗜熱真菌)分離 提 取 出 來 ， 該 酶 基 因 全 長2.49kb，編碼832個(gè)氨基酸。該酶雖然在90以上幾乎無DNA合成， 但確有良好的熱穩(wěn)定性。（天然酶） 另一類通過基因工程合成的酶。（基因工程酶） Taq DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應(yīng)的前提條件，也是PCR反應(yīng)能迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的原因。第40頁/共108頁

15、(一)酶活性與熱穩(wěn)定性1）酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000/mg，Taq酶的濃度通常為12.5/ l，太多浪費(fèi)并易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。 2）熱穩(wěn)定性好：能耐受DNA變性時(shí)的高溫 在92.5、95 、97.5時(shí)，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經(jīng)130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。 PCR反應(yīng)時(shí)變性溫度為9520sec，50個(gè)循環(huán)后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。 第41頁/共108頁1）Taq DNA聚合酶是Mg2+ 依賴性酶，對(duì)Mg2+ 濃度非常敏感。2）Mg2+濃度2.0mmol/L時(shí)，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。3）Mg2

16、+ 能與dNTP結(jié)合而降低PCR反應(yīng)液中游離的Mg2+ 濃度，優(yōu)化濃度一般反應(yīng) 中Mg2+ 濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高0.51.0 mmol/L。4）適當(dāng)濃度的KCl能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%。(二)離子依賴性第42頁/共108頁1）TaqDNA聚合酶具有53 聚合酶活性和53外切酶活性，而無3 5外切活 性，在PCR反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯(cuò)配，該酶是沒有校正功能。Taq DNA聚合酶的堿基錯(cuò)配機(jī)率為2.110-4。2）Taq DNA聚合酶還具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性.(三)忠實(shí)性(四) Taq酶的最適溫度 7580每個(gè)酶分子可延伸約150個(gè)核苷酸/秒，70延伸率大于60個(gè)核苷

17、酸/秒，55時(shí)為22個(gè)核苷酸/秒。最適溫度75左右。 第43頁/共108頁第44頁/共108頁（四）原料 原料：四種脫氧核苷三磷酸( (dNTP) )：濃度為 20200mol/L。 Mg2+：為Taq 酶的必需激活劑。 濃度為0.52.5mmol/L。 太少：酶活性明顯降低； 太多：導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。（五） Mg2+第45頁/共108頁反應(yīng)溫度和時(shí)間反應(yīng)溫度和時(shí)間1. 變性： 95，30”1 雙鏈DNA變成單鏈。2. 退火：55，30”1 引物與模板互補(bǔ)結(jié)合。退火溫度對(duì)特異性影響很大。退火溫度=Tm值-(510) Tm值(解鏈溫度)= 4(G+C)2(A+T） 3. 延伸：7275， 1 2

18、 Taq 酶催化dNTP，從引物3-OH端開始，與模板互補(bǔ)，合成一條新的DNA鏈。小于20bp片段第46頁/共108頁 反應(yīng)緩沖液：常用10mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.38.8為Taq 酶最適pH值。 循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA的起始濃度，合適的循環(huán)數(shù)為25 30次。 循環(huán)數(shù)太少：產(chǎn)物量不多 循環(huán)數(shù)太多：非特異性擴(kuò)增會(huì)增加，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)第47頁/共108頁P(yáng)CR反應(yīng)體系5擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙蒸水至 50ul 第

19、48頁/共108頁 1.無擴(kuò)增產(chǎn)物1.1. 模板模板: :含有抑制物，含量含有抑制物，含量低低2.2. BufferBuffer對(duì)樣品不合適對(duì)樣品不合適3.3. 引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解解4.4. 反應(yīng)條件：退火溫度太低反應(yīng)條件：退火溫度太低延伸時(shí)間太短延伸時(shí)間太短 原因?qū)Σ?.1. 純化模板或者使用試劑盒純化模板或者使用試劑盒提取模板提取模板DNADNA或加大模板或加大模板的用量的用量2.2. 更換更換BufferBuffer或調(diào)整濃度或調(diào)整濃度3.3. 重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物或者換一管新

20、引物4.4. 提高退火溫度、延長延伸提高退火溫度、延長延伸時(shí)間時(shí)間現(xiàn)象：對(duì)照組有條帶，而樣品則無對(duì)照組有條帶，而樣品則無；第49頁/共108頁2. 非特異性擴(kuò)增 現(xiàn)象：現(xiàn)象：PCRPCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。第50頁/共108頁1.1.引物特異性差引物特異性差2.2.模板或引物濃度過模板或引物濃度過高高3.3.酶量過多酶量過多4.4.MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高5.5.循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原因?qū)Σ?.1.重新設(shè)計(jì)引物重新設(shè)計(jì)引物2.

21、2.適當(dāng)降低模板或引物適當(dāng)降低模板或引物濃度濃度3.3.適當(dāng)減少酶量適當(dāng)減少酶量4.4.降低降低Mg2+濃度濃度5.5.減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 非特異性擴(kuò)增第51頁/共108頁3.拖尾 現(xiàn)象現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈拖尾狀態(tài)產(chǎn)物在凝膠上呈拖尾狀態(tài)。 M 1 2第52頁/共108頁1.1.模板不純模板不純2.2.降解降解3.3.退火溫度偏低退火溫度偏低4.4.酶量過多酶量過多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+濃度偏濃度偏高高6.6.循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原因?qū)Σ?.1.純化模板純化模板2.2.改變條件改變條件3.3.適當(dāng)提高退火溫度適當(dāng)提高退火溫度4.4.適量用酶適量用酶5.5.適當(dāng)降低

22、適當(dāng)降低dNTPdNTP和和MgMg2+2+的濃度的濃度6.6.減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù)拖尾第53頁/共108頁4.假陽性 原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染 現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 對(duì)策：1.1. 操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；2.2. 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。3.3. 各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。 第54頁/共108頁五、 PCR實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 由于PCR的靈敏性極高，故微量的樣品污染便可導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。所有的溶液都應(yīng)該沒有核

23、酸和核酸酶的污染 采取的措施： 1）隔離不同的操作區(qū) 2）采用一次性用具 3）嚴(yán)格按無菌操作原則進(jìn)行 4）并設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照，以提高PCR結(jié)果的正確性。第55頁/共108頁除實(shí)驗(yàn)樣品外，應(yīng)設(shè)幾種實(shí)驗(yàn)對(duì)照：1）陽性對(duì)照：陽性DNA模板參與的PCR反應(yīng)；陽性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本。2）陰性對(duì)照：無核酸模板參與的PCR反應(yīng)；在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測試劑是否污染。第56頁/共108頁示例電泳結(jié)果 1 2 3 4 5 MM：DNA marker1：為陽性對(duì)照：為陽性對(duì)照2：為陰性對(duì)照：為陰性對(duì)照3-5：為擴(kuò)增出的：為擴(kuò)增出的DNA條帶條

24、帶第57頁/共108頁六、 PCR技術(shù)的主要用途PCR第58頁/共108頁利用特異性引物以利用特異性引物以cDNA或基因組或基因組DNA為為模板獲得已知目的基因片段模板獲得已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為為模板獲得目的片段。模板獲得目的片段。1. 目的基因的克隆第59頁/共108頁+第60頁/共108頁A正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)2. 基因檢測第61頁/共108頁第62頁/共108頁A第63頁/共108頁P(yáng)CR-ASO檢測基因點(diǎn)突變：主是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因的適當(dāng)片段，然后用人工合成

25、的含突變位點(diǎn)的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交第64頁/共108頁探針雜交NC膜探針第65頁/共108頁restriction fragment length polymorphism 限制性片段長度多態(tài)體第66頁/共108頁第67頁/共108頁第68頁/共108頁3. DNA和RNA的微量分析PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 第69頁/共108頁P(yáng)CR后將后將待測待測DNA片段既可克隆到特定片段既可克隆到特定的載體進(jìn)行序列測定，也可直接測定。的載體進(jìn)行序列測定，也可直接測定。PCR技術(shù)引入技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工序列測定，使測序工作大為簡化，也提

26、高了測序的速度；作大為簡化，也提高了測序的速度；使用引物對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，就可摻入同位使用引物對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，就可摻入同位素或非同位素標(biāo)記的各種堿基，獲得所需比活性素或非同位素標(biāo)記的各種堿基，獲得所需比活性的探針的探針 。4. DNA序列測定5. 用PCR標(biāo)記DNA探針第70頁/共108頁mRNA 第二節(jié) 常用幾種PCR反應(yīng) 1)RNase1)RNase2)2)堿性液( (水解RNA) ) 單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶 ( (使dNTP 聚合) )RNA-DNA雜化鏈PCR 一、逆轉(zhuǎn)錄 PCRDNA 聚合酶雙鏈DNA( (使dNTP 聚合) )PCR 第71頁/共108頁二、實(shí)時(shí) PCR 實(shí)時(shí)PCR（

27、real-time polymerase chain reaction）又稱熒光定量PCR。是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。第72頁/共108頁 熒 實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR，得到廣泛應(yīng)用。 I第73頁/共108頁P(yáng)CRPCR引物n實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理第74頁/共108頁引物之間一段帶有標(biāo)記寡核苷酸鏈，稱作探針第75頁/共1

28、08頁報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)第76頁/共108頁無熒光信號(hào)產(chǎn)生能量激發(fā)光完整的探針：5端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移） 第77頁/共108頁第78頁/共108頁第79頁/共108頁第80頁/共108頁第81頁/共108頁第82頁/共108頁?第83頁/共108頁 53外切酶活性 將探針5端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來第84頁/共108頁第85頁/共108頁第86頁/共108頁第87頁/共108頁第88頁/共108頁第89頁/共108頁第90頁/共108頁第91頁/共108頁第92頁/共108頁第93頁/共108頁第94頁/共108頁n實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物熒光標(biāo)記分子熒光標(biāo)記分子RQ 3355熒光報(bào)告分子熒光淬滅分子熒光信號(hào)第95頁/共108頁SYBR Green I作用機(jī)理EmissionEmission第96頁/共108頁SYBR Green I作用機(jī)理ExcitationEmission第97頁/共108頁 原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR)是進(jìn)行原位擴(kuò)增進(jìn)行定性定量定位分析。 把原位雜交的細(xì)胞定位技術(shù)與PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)。三、原位 PCR第98頁/共108頁 待檢標(biāo)本先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核