微生物生理生化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)

1、微生物生理生化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)微生物生理生化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 微生物學(xué)教研室一、教學(xué)目的與要求一、教學(xué)目的與要求 1 要求學(xué)生了解要求學(xué)生了解imvic試驗(yàn)的原理及在腸道試驗(yàn)的原理及在腸道菌鑒定中的意義。菌鑒定中的意義。 2 掌握掌握imciv及硫化氫試驗(yàn)的操作。及硫化氫試驗(yàn)的操作。 教學(xué)時(shí)數(shù)：教學(xué)時(shí)數(shù)：6學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)二、二、試驗(yàn)原理試驗(yàn)原理 微生物體內(nèi)各種酶系統(tǒng)控制的復(fù)雜多樣的生化反微生物體內(nèi)各種酶系統(tǒng)控制的復(fù)雜多樣的生化反應(yīng)完成應(yīng)完成 ；測(cè)定微生物某些酶類的有無、對(duì)底物；測(cè)定微生物某些酶類的有無、對(duì)底物作用與否、反應(yīng)的條件、反應(yīng)的產(chǎn)物及代謝方作用與否、反應(yīng)的條件、反應(yīng)的產(chǎn)物及代謝方式都屬于生理生化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。式

2、都屬于生理生化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。 在培養(yǎng)基內(nèi)或在培養(yǎng)完成之后加入特定的指示劑在培養(yǎng)基內(nèi)或在培養(yǎng)完成之后加入特定的指示劑就可確定所發(fā)生的生理生化反應(yīng)類型。就可確定所發(fā)生的生理生化反應(yīng)類型。 常用的試驗(yàn)：糖代謝試驗(yàn)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝常用的試驗(yàn)：糖代謝試驗(yàn)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)、氮源和碳源的利用試驗(yàn)及酶的試驗(yàn)等。試驗(yàn)、氮源和碳源的利用試驗(yàn)及酶的試驗(yàn)等。 imvic是四個(gè)生理生化反應(yīng)英文詞第一個(gè)字是四個(gè)生理生化反應(yīng)英文詞第一個(gè)字母的縮寫，母的縮寫，i表示吲哚試驗(yàn)（表示吲哚試驗(yàn)（indol test）、）、m表示甲基紅試驗(yàn)（表示甲基紅試驗(yàn)（methyl red test）、）、v表示伏普反應(yīng)（表示伏普反應(yīng)（

3、voges-proskauer reaction，小寫之，小寫之i使之成為一個(gè)可發(fā)音的使之成為一個(gè)可發(fā)音的單詞）、單詞）、c表示檸檬酸鹽試驗(yàn)（表示檸檬酸鹽試驗(yàn)（citrate test）。這四個(gè)試驗(yàn)在腸道細(xì)菌的鑒別中常）。這四個(gè)試驗(yàn)在腸道細(xì)菌的鑒別中常常作為一組常規(guī)生理生化試驗(yàn)來進(jìn)行。常作為一組常規(guī)生理生化試驗(yàn)來進(jìn)行。 1、吲哚試驗(yàn)（吲哚試驗(yàn)（indol test） 含有色氨酸酶的細(xì)菌，能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸產(chǎn)生吲哚（靛基質(zhì)），吲哚本身沒有顏色，不為肉眼所見，當(dāng)加入對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑后，形成可見的紅色化合物，即玫瑰吲哚 2、甲基紅試驗(yàn)（、甲基紅試驗(yàn)（methyl red test） 腸道細(xì)菌

4、可分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并使丙酮酸進(jìn)一步分腸道細(xì)菌可分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并使丙酮酸進(jìn)一步分解為甲酸、乙酸、乳酸等。對(duì)于一些細(xì)菌如大腸桿菌、沙解為甲酸、乙酸、乳酸等。對(duì)于一些細(xì)菌如大腸桿菌、沙門氏菌等，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸較多，使培養(yǎng)基門氏菌等，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸較多，使培養(yǎng)基ph下降到下降到4.2甚至更低，因此可用指示劑甲基紅（反應(yīng)范圍甚至更低，因此可用指示劑甲基紅（反應(yīng)范圍ph4.2紅紅6.3黃）指示出來。黃）指示出來。 3、伏普反應(yīng)（、伏普反應(yīng)（voges-proskauer reaction ） 產(chǎn)氣桿菌能進(jìn)行丁醇發(fā)酵，可使丙酮酸脫羧，生成中性的產(chǎn)氣桿菌能進(jìn)行丁醇發(fā)酵，可使丙酮酸脫羧，生成中性的

5、乙酰甲基甲醇（乙酰甲基甲醇（3-羥基丁酮）可通過羥基丁酮）可通過v.p試驗(yàn)檢測(cè)出來。試驗(yàn)檢測(cè)出來。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇可被空氣中的氧所氧化，生在堿性條件下，乙酰甲基甲醇可被空氣中的氧所氧化，生成二乙酰（丁二酮），二乙酰再與蛋白質(zhì)中精氨酸的胍基成二乙酰（丁二酮），二乙酰再與蛋白質(zhì)中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即為作用，生成紅色化合物，即為v.p反應(yīng)陽性。反應(yīng)陽性。 檸檬酸鹽培養(yǎng)基是合成培養(yǎng)基，不含蛋白胨和糖類，檸檬酸鹽為唯一碳源。有的細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌能利用檸檬酸鈉作為碳源，檸檬酸鈉為弱酸強(qiáng)堿鹽，被分解利用后使培養(yǎng)基ph值升高，由中性變?yōu)閴A性，可使培養(yǎng)基中的指示劑溴麝香草酚藍(lán)（反應(yīng)范圍p

6、h6.07.6，黃色藍(lán)色）由綠變藍(lán)。 4、檸檬酸鹽試驗(yàn)（、檸檬酸鹽試驗(yàn)（citrate test） 三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材 恒溫水浴鍋，接種針，接種環(huán)，試管架，記號(hào)筆，滴管； 蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，檸檬酸鹽培養(yǎng)基（西蒙氏培養(yǎng)基）； 甲基紅試劑，v.p試劑，吲哚試劑，40% koh溶液（內(nèi)含0.3%肌酸），乙醚，6% -萘酚酒精溶液； 大腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌，枯草芽孢桿菌，普通變形桿菌。 四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備（略，已準(zhǔn)備）：蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，檸檬酸鹽培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基編號(hào)培養(yǎng)基編號(hào)3、接種：接種：按要求接種按要求接種4、培養(yǎng)：培養(yǎng)：

7、37溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng) 5、生理生化反應(yīng)及觀察、生理生化反應(yīng)及觀察（1）吲哚試驗(yàn)）吲哚試驗(yàn) 培養(yǎng)后取出，先加入乙醚約培養(yǎng)后取出，先加入乙醚約1ml（使呈現(xiàn)明顯的乙醚層），（使呈現(xiàn)明顯的乙醚層），充分震蕩后沿試管壁緩緩滴加吲哚試劑充分震蕩后沿試管壁緩緩滴加吲哚試劑5-10滴，觀察有無滴，觀察有無紅色環(huán)出現(xiàn)。注意：加入吲哚試劑后不可再動(dòng)搖紅色環(huán)出現(xiàn)。注意：加入吲哚試劑后不可再動(dòng)搖!有紅色有紅色環(huán)出現(xiàn)者為陽性，反之為陰性環(huán)出現(xiàn)者為陽性，反之為陰性 （2）甲基紅試驗(yàn)）甲基紅試驗(yàn) 取出培養(yǎng)物，在培養(yǎng)液中加入幾滴甲基紅試劑（約每毫升取出培養(yǎng)物，在培養(yǎng)液中加入幾滴甲基紅試劑（約每毫升培養(yǎng)液加指示劑培養(yǎng)液加

8、指示劑1滴），立即觀察結(jié)果，呈現(xiàn)紅色為甲基滴），立即觀察結(jié)果，呈現(xiàn)紅色為甲基紅試驗(yàn)陽性，桔紅色為弱陽性，桔黃或黃色為陰性反應(yīng)。紅試驗(yàn)陽性，桔紅色為弱陽性，桔黃或黃色為陰性反應(yīng)。 （3）v.p反應(yīng)試驗(yàn)反應(yīng)試驗(yàn) 取出培養(yǎng)物取出培養(yǎng)物2 ml，加入與培養(yǎng)基等量的，加入與培養(yǎng)基等量的v.p試劑，試劑，充分振蕩，放置充分振蕩，放置37溫箱中溫箱中30min，觀察。呈紅，觀察。呈紅色者為陽性，不呈紅色者為陰性。色者為陽性，不呈紅色者為陰性。 （4）檸檬酸鹽的利用試驗(yàn)）檸檬酸鹽的利用試驗(yàn) 取出培養(yǎng)物，觀察，培養(yǎng)基上有菌苔生長(zhǎng)且變?yōu)槿〕雠囵B(yǎng)物，觀察，培養(yǎng)基上有菌苔生長(zhǎng)且變?yōu)樗{(lán)色即為陽性反應(yīng)；無菌生長(zhǎng)、培養(yǎng)基仍為綠色藍(lán)色即為陽性反應(yīng)；無菌生長(zhǎng)、培養(yǎng)基仍為綠色者為陰性反應(yīng)。凡陰性反應(yīng)者，最好繼續(xù)培養(yǎng)觀者為陰性反應(yīng)。凡陰性反應(yīng)者，最好繼續(xù)培養(yǎng)觀察至第察至第7 d。 五、注意事項(xiàng)五、注意事項(xiàng) 1.檸檬酸鹽利用試驗(yàn)應(yīng)防止瓊脂中的雜質(zhì)，同時(shí)制備培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)嚴(yán)格調(diào)節(jié)ph值。 2. v.p反應(yīng)要求在與空氣充分接觸下完成，因此加入試劑后須充分振搖。六、實(shí)驗(yàn)記錄六、實(shí)驗(yàn)記錄菌種吲哚試驗(yàn)