流式試劑培訓(xùn).

1、流式細(xì)胞儀原理及試劑銷(xiāo)售培訓(xùn)流式細(xì)胞儀原理及試劑銷(xiāo)售培訓(xùn) 貝克曼庫(kù)爾特公司生物科學(xué)部 朱曉春流式細(xì)胞儀的基本原理流式細(xì)胞儀的基本原理流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)的基本概念v流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, , 簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)FCM）是）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性，并加以定個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性，并加以定量的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選量的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選v研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等人工合成微球等v

2、研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量并加以定量流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)v極短時(shí)間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，只要標(biāo)本中的細(xì)胞數(shù)量足夠，流式細(xì)胞儀（Flow cytometer）可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個(gè)細(xì)胞的速率進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量的細(xì)胞總數(shù)可達(dá)數(shù)千、數(shù)萬(wàn)乃至數(shù)百萬(wàn)個(gè)。 v可同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多種特征，當(dāng)同時(shí)用多種分子探針，如用不同熒光素標(biāo)記的不同單克隆抗體進(jìn)行多色熒光染色，通過(guò)流式細(xì)胞分析，即可獲得單細(xì)胞的多種信息，使細(xì)胞亞群的識(shí)別、計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。v定性或定量分析細(xì)胞：通過(guò)熒光染色對(duì)單細(xì)胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達(dá)量、Ca2+濃度、

3、酶活性以及細(xì)胞的功能等均可進(jìn)行單細(xì)胞水平的定性與定量分析 v強(qiáng)大的分選功能，在分析的同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)=細(xì)胞大小細(xì)胞大小=細(xì)胞粒度細(xì)胞粒度=細(xì)胞表面面積細(xì)胞表面面積=核漿比例核漿比例=DNADNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期=RNARNA含量含量=蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞功能=細(xì)胞表面細(xì)胞表面/ /胞漿胞漿/ /核的特核的特異性抗原異性抗原=細(xì)胞活性細(xì)胞活性=細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子=酶活性酶活性=激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn)=細(xì)胞受體細(xì)胞受體散射光信號(hào)散射光信號(hào)Right Angle Light Detector Cel

4、l ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source=前向角散射光（前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 =側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter）細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性LaserFALS SensorFSC信號(hào)信號(hào)SSC信號(hào)信號(hào)外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖 （紅細(xì)胞溶解后）（紅細(xì)胞溶解后）Side ScatterForward Scatter

5、流式細(xì)胞儀的檢測(cè)的熒光信號(hào)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)的熒光信號(hào)熒光信號(hào)熒光信號(hào)u使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析u熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量FITCPE-Cy5PE熒光信號(hào)熒光信號(hào)雙色直接染色雙色直接染色CD3-FITCCD19-PE數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析=數(shù)據(jù)顯示數(shù)據(jù)顯示: : 直方圖 ( Histogram )二維點(diǎn)圖(Dot Plot)等高線圖(Contour Plot)密度圖 (Density)三維圖（3D Plot）等數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析=單參數(shù)直方圖分析單參數(shù)直方圖分析PI - Fluorescenc

6、e# Events正常正常G0/G1G0/G1期細(xì)胞期細(xì)胞凋亡細(xì)胞峰凋亡細(xì)胞峰數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析=雙參數(shù)點(diǎn)圖分析雙參數(shù)點(diǎn)圖分析五光十色的熒光素五光十色的熒光素u單分子熒光素單分子熒光素u耦合的復(fù)合熒光素分子耦合的復(fù)合熒光素分子u新型的熒光素樣熒光物質(zhì)新型的熒光素樣熒光物質(zhì)Qdots常用激光和熒光素搭配常用激光和熒光素搭配uBluelFITClPElPerCPlPerCP-Cy5.5lPE-Texas Red(ECD)lPE-Cy5lPE-Cy7lPIlEGFPuRedlAPClAPC-Cy7uUVlDAPIlHoechst常用的標(biāo)記單克隆抗體的熒光素常用的標(biāo)記單克隆抗體的熒光素u488nm激光激

7、發(fā)：激光激發(fā)：lFITC（異硫氰酸熒光素）：（異硫氰酸熒光素）： 熒光強(qiáng)度可受熒光強(qiáng)度可受pH的影響，當(dāng)?shù)挠绊?，?dāng)pH降低時(shí)其熒光強(qiáng)度也隨之減弱降低時(shí)其熒光強(qiáng)度也隨之減弱lPE（藻紅蛋白）（藻紅蛋白）lPerCP（多甲藻葉綠素蛋白）：光量子產(chǎn)量并不太高，最好（多甲藻葉綠素蛋白）：光量子產(chǎn)量并不太高，最好應(yīng)用在檢測(cè)表達(dá)較高的抗原上應(yīng)用在檢測(cè)表達(dá)較高的抗原上lPerCP-Cy5.5（葉綠素蛋白偶聯(lián)物）（葉綠素蛋白偶聯(lián)物）lPE-Cy7（藻紅蛋白偶聯(lián)物）（藻紅蛋白偶聯(lián)物）lPE-Cy5（藻紅蛋白偶聯(lián)物，又稱(chēng)（藻紅蛋白偶聯(lián)物，又稱(chēng)Cy-Chrome）lPE-Texas Red（藻紅蛋白（藻紅蛋白- -

8、德州紅偶聯(lián)物，又稱(chēng)德州紅偶聯(lián)物，又稱(chēng)ECDECD）u633nm激光激發(fā)：激光激發(fā)：lAPC（別藻青蛋白）（別藻青蛋白）lAPC-Cy7（別藻青蛋白偶聯(lián)物）（別藻青蛋白偶聯(lián)物）熒光及熒光發(fā)生機(jī)理簡(jiǎn)介熒光及熒光發(fā)生機(jī)理簡(jiǎn)介u熒光及熒光素：熒光及熒光素：l某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長(zhǎng)某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng)長(zhǎng)的光線比照射光波長(zhǎng)長(zhǎng)的光線 即熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒即熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱(chēng)光的物質(zhì)稱(chēng)熒光物質(zhì)或熒光素?zé)晒馕镔|(zhì)或熒光素. .u熒光發(fā)生機(jī)理：熒光發(fā)生機(jī)理：l室溫下熒光素分子大部分處于室溫下熒光素分子大部分處于“基態(tài)基態(tài)”，當(dāng)熒光素

9、在一，當(dāng)熒光素在一定波長(zhǎng)（激發(fā)波長(zhǎng)）的光的照射下吸收光能后（經(jīng)染色定波長(zhǎng)（激發(fā)波長(zhǎng)）的光的照射下吸收光能后（經(jīng)染色后的細(xì)胞在激光束的照射下），熒光染料吸收能量能級(jí)后的細(xì)胞在激光束的照射下），熒光染料吸收能量能級(jí)躍遷，進(jìn)入新的狀態(tài)，稱(chēng)為躍遷，進(jìn)入新的狀態(tài)，稱(chēng)為“激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)”，處于激發(fā)態(tài)的，處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，它可以通過(guò)在分子不穩(wěn)定，它可以通過(guò)在10-910-7秒的極短時(shí)間內(nèi)以秒的極短時(shí)間內(nèi)以發(fā)射一定波長(zhǎng)的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返發(fā)射一定波長(zhǎng)的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過(guò)程稱(chēng)為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光?；氐交鶓B(tài)。這一過(guò)程稱(chēng)為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。熒光素的激發(fā)和發(fā)射

10、光譜熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜u任何發(fā)熒光的物質(zhì)分子都具有這兩個(gè)特征光譜（任何發(fā)熒光的物質(zhì)分子都具有這兩個(gè)特征光譜（nm）u激發(fā)光譜（激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：）：l是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線，是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線，也稱(chēng)為吸收光譜。也稱(chēng)為吸收光譜。l吸收波峰（最大吸收波長(zhǎng)）：吸收波峰（最大吸收波長(zhǎng)）：Ex-Maxu發(fā)射光譜（發(fā)射光譜（Emission）：l是指某一波長(zhǎng)激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒是指某一波長(zhǎng)激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光光l發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長(zhǎng)）：發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長(zhǎng)）：Em-Maxu熒

11、光素的使用：熒光素的使用：l選擇正確的激光器選擇正確的激光器l確定所需熒光探測(cè)器（確定所需熒光探測(cè)器（PMT）區(qū)別區(qū)別488nm 520nm異硫氰酸熒光素（FITC）光學(xué)系統(tǒng)：濾光片光學(xué)系統(tǒng)：濾光片置于熒光探測(cè)器前，利用二向色性長(zhǎng)通濾片置于熒光探測(cè)器前，利用二向色性長(zhǎng)通濾片( (DL)及帶通濾片及帶通濾片( (BP) )可將不同熒光染料發(fā)出的相應(yīng)波長(zhǎng)光譜區(qū)別開(kāi)可將不同熒光染料發(fā)出的相應(yīng)波長(zhǎng)光譜區(qū)別開(kāi) 反射光反射光通過(guò)光通過(guò)光 光源光源二向色性長(zhǎng)通濾片二向色性長(zhǎng)通濾片( (DICHROIC FILTER)，一定波長(zhǎng)以上的光通過(guò)，該波定波長(zhǎng)以上的光通過(guò)，該波長(zhǎng)以下的光被反射。長(zhǎng)以下的光被反射。45

12、45度角放置。度角放置。 550nm 的光通過(guò)的光通過(guò) 550nm 的光被反射的光被反射帶通濾片帶通濾片( (BAND PASS) )，允許一定波長(zhǎng)的光通過(guò)。，允許一定波長(zhǎng)的光通過(guò)。550nm DL 620nm BP（620/20）可以允許可以允許610630nm的光通過(guò)的光通過(guò) Fluorescence Spectrum Viewer FITCFluorescence Spectrum Viewer PEFluorescence Spectrum Viewer PE-Cy5Fluorescence Spectrum Viewer PE-Cy7Fluorescence Spectrum Vie

13、wer PerCPFluorescence Spectrum Viewer APCFluorescence Spectrum Viewer PIFluorescence Spectrum Viewer EGFPFluorescence Spectrum Viewer DAPIFluorescence Spectrum Viewer FITC和和EGFP能否一起使用能否一起使用熒光染料比較熒光染料比較( (平均熒光強(qiáng)度平均熒光強(qiáng)度) ) Q-Prep / ImmunoPrep 試劑系統(tǒng)試劑系統(tǒng)PerCP APC FITC ECD PC5 PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCPerCP APC FITC ECD PC7 PC5 600nm）迅速降低。因此檢