超聲引導下微波消融聯(lián)合自體CIK細胞治療原發(fā)性肝癌的療效研究

1、超聲引導下微波消融聯(lián)合自體CIK細胞治療原發(fā)性肝癌的療效研究周健，劉黎，黃麗雯武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院感染科 430064【摘要】目的：觀察超聲引導下微波消融(PMCT)聯(lián)合自體CIK細胞治療原發(fā)性肝癌(HCC)的臨床療效及安全性。方法：62例HCC患者分為兩組，PMCT組(n=30例)僅采用PMCT治療，聯(lián)合組(n=32例)則采用PMCT聯(lián)合自體CIK細胞，觀察兩組臨床療效，KPS評分，治療前后T細胞亞群及AFP變化，在0.5年、1年、2年的復發(fā)率及生存率以及不良反應。結果：聯(lián)合組治療總有效率(87.5%)和KPS有效率(90.6%)明顯高于PMCT組(70.0%)和(73.3%)(P<

2、;0.05)；兩組治療前T細胞亞群及AFP比較無顯著差異性(P>0.05)，兩組治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯升高(P<0.05)，而CD8+及AFP明顯下降(P<0.05)，聯(lián)合組升高或下降較PMCT組更為顯著(P<0.05)；聯(lián)合組在0.5年、1年、2年的復發(fā)率及生存率均明顯低于和高于對照組(P<0.05)；兩組治療期間均未出現嚴重不良反應。結論：PMCT聯(lián)合自體CIK細胞治療HCC療效明顯優(yōu)于單純PMCT，可明顯調節(jié)患者免疫狀態(tài)，降低復發(fā)率和提高生存率，安全可靠，值得臨床推廣應用。【關鍵詞】微波消融；CIK細胞；原發(fā)性肝癌；T細胞亞群

3、原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是目前最常見的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病隱匿，確診時常常失去了手術治療的機會，影響預后，病死率高1,2。對于無法手術切除特別是伴有轉移的患者，采用非手術的治療方法以及實行綜合治療是目前臨床最常用的策略3,4。研究表明，微波消融(percutaneous microwave coagulation therapy, PMCT)治療小肝癌可獲得與手術切除相近的生存療效5-7。PMCT治療肝癌具有并發(fā)癥發(fā)生率低、恢復快、住院時間短等優(yōu)勢，超聲引導下經皮微波消融治療肝癌具有成本低的優(yōu)勢8。PMCT治療后，機體腫瘤負荷減輕，腫瘤對免疫

4、系統(tǒng)的抑制大大解除，同時死亡和凋亡的腫瘤細胞使腫瘤抗原得以釋放和暴露，因而也是激發(fā)機體特異性抗腫瘤免疫的最佳時機。多種細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer,CIK 細胞)過繼性免疫治療能在一定程度上提高腫瘤患者的免疫功能，為預防腫瘤復發(fā)、消除患者體內殘留的腫瘤細胞、改善晚期腫瘤患者的生存質量提供了新的治療途徑。因此本研究擬觀察觀察超聲引導下微波消融聯(lián)合自體CIK細胞治療原發(fā)性肝癌的臨床療效及安全性。1 資料與方法1.1 臨床資料62例HCC患者均為本院2011年2月-2013年2月期間住院治療的患者，根據臨床癥狀體征、實驗室檢查及影像學檢查(CT或MRI等)均

5、已確診。排除標準包括：妊娠和哺乳期婦女，吸毒，精神異常，未控制的感染，全身皮質激素治療，自身免疫性疾病，缺血性心臟病或心力衰竭，近6個月內進行過化療或放療的患者。上述患者根據各自治療意愿分為PMCT組(n=30例)和聯(lián)合組(n=32例)，兩組患者在性別、年齡、病程、肝功能Child分級、病灶數目、腫瘤最大徑等方面比較無統(tǒng)計學差異(表1)。本研究已得到患者的知情同意及醫(yī)院倫理委員會的批準。1.2 治療方法1.2.1 微波消融儀器及步驟微波設備為中國南京康友微波能應用研究所研制的KY-2000(2450MHz)及KY-2100(915 MHz)微波消融儀，配用微波天線為15G，硬質裂隙水冷天線，最

6、大輸出功率為100 W；隨機配備組織測溫系統(tǒng)，連接3根21G組織測溫針(南京康友微波能應用研究所)。微波治療方案：設計為1次消融治療實現腫瘤完全滅活。治療步驟：常規(guī)腹部超聲檢查后選定體位，超聲引導擇點定位，應用2%利多卡因進針點局部麻醉，給予動態(tài)心電、呼吸、血壓監(jiān)護。15G微波天線直入預定部位，根據腫塊大小及患者情況選擇不同功率、作用時間和進針次數，同時觀察腫塊回聲變化。對<5cm的病灶給予單針50W功率10min治療，對>5cm的腫瘤采取雙針多部位分段凝固，按先深部后表淺，先周邊后中央的順序進行操作，選用功率5060W，作用時間1520min。PMCT組和聯(lián)合治療組患者均進行12

7、次消融治療，使用微波針數為14針，兩組消融治療次數和治療針數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。1.2.2 自體CIK的制備及治療方法 抽取患者外周血，經人淋巴細胞分離液密度梯度離心獲得外周血單個核細胞(PMBC)，培養(yǎng)當天加入重組人IFN-、IL-2，培養(yǎng)第14d時，抽取培養(yǎng)液進行細菌真菌檢測，回輸當天進行內毒素檢測和細胞表性分析。聯(lián)合組患者共接受46次自體誘導的CIK 細胞治療，每周一次，每次回輸后如無不良反應則繼續(xù)完成以后的治療。每次回輸的CIK細胞不少于1×1010，回輸時由專人負責，如出現不可耐受的副反應則終止治療。1.3 觀察指標及評定標準治療后3個月評價臨床療效：完

8、全緩解(CR：所有靶病灶消失)；部分緩解(PR：靶病灶最長直徑與基線狀態(tài)比較，至少減少30%)；無變化(SD：靶病灶縮小不到50%或增大不超過25%)；疾病進展(PD：靶病灶最長徑之和與治療開始之后所記錄到的最小靶病灶之和比較，增加20%或者出現1個或多個病灶)。 治療后KPS評分的變化，升高：化療結束后較治療前評分增加>10分；穩(wěn)定：化療前評分增加或減少不足10分；降低：較化療前評分減少>10分。升高和穩(wěn)定為有效。1.4 外周血淋巴細胞亞群分析患者治療前后外周血淋巴細胞表型分析用流式細胞儀進行檢測。血樣以EDTA抗凝，各檢測管中加入相應抗體(CD3-PerCP，CD4-FITC，

9、CD8-FITC，CD 25 PE，CD 28 PE，CD56 PE，Mouse IgG1-FITC，Mouse IgG1-PE，Mouse IgG2a-PE，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，BDIS，USA)，混勻，室溫暗處反應15 min；加入2 ml FACS Lysing Solution(BDIS，USA)，混勻，室溫暗處放置10 min；3000 r/min，離心5 min，棄上清；洗滌，加入300 l 1%多聚甲醛；28暗處保存，24 h內用FACS-Calibur(Becton Dickinson，USA)檢測分析。1.5 觀察

10、指標1.5.1 檢測治療中和治療后局部或全身毒副反應；1.5.2 檢測治療前后(1年內)外周血AFP濃度；1.5.3 觀察患者無瘤生存率和1年，3年生存率。1.6 統(tǒng)計學分析方法采用SPSS 16.0軟件包進行數據的統(tǒng)計處理。組間計量資料比較采用t檢驗，組內計量資料比較采用配對t檢驗；率和構成比的比較采用2檢驗，生存率分析用Kaplan-Meier法，生存時間比較采用Log-rank檢驗。檢驗水準=0.05。2 結果2.1 兩組臨床資料比較 兩組患者在性別、年齡、病程、肝功能Child 分級、病灶數目、腫瘤最大徑等方面比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。表1 兩組臨床資料比較組別例

11、數性別(男/女)年齡(歲)病程(d)病灶數(個)病灶最大徑(mm)肝功能Child分級ABCPMCT組3025/552.2±11.638.5±12.41.7±0.527.9±6.718102聯(lián)合組3226/653.5±12.1 40.1±11.51.8±0.527.2±7.116113注：兩組比較，P>0.05。2.2 兩組臨床療效及KPS評分比較 聯(lián)合組治療總有效率(87.5%)和KPS有效率(90.6%)明顯高于PMCT組(70.0%)和(73.3%)(P<0.05)；見表2及表3。表2 兩組療效比

12、較組別例數CRPRSDPD治療總有效率PMCT組304176370.0%聯(lián)合組3282031 87.5%*注：與PMCT組比較，*P<0.05。表3 兩組KPS評分比較組別例數升高穩(wěn)定降低總有效率PMCT組30715873.3%聯(lián)合組3215143 90.6%*注：與PMCT組比較，*P<0.05。2.3 兩組治療前后T細胞亞群及AFP變化兩組治療前T細胞亞群及AFP比較無顯著差異性(P>0.05)，兩組治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯升高(P<0.05)，而CD8+及AFP明顯下降(P<0.05)，聯(lián)合組升高或下降較PMCT組更為顯著(P&

13、lt;0.05)，見表4。表4 兩組治療前后T細胞亞群及AFP變化 組別例數CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+ AFP(ug/mL)PMCT組 治療前 治療后303063.52±2.71 65.23±3.13*32.22±1.43 33.72±1.58*30.31±2.74 27.55±2.25*1.05±0.57 1.27±0.62*472.41±140.23 147.25±25.47*聯(lián)合組 治療前 治療后323263.85±2.8770.42±

14、4.21*#32.14±1.6534.92±1.44*#30.76±2.8425.43±2.07*#1.07±0.55 1.54±0.62*#481.07±133.48 51.04±27.12*#注：與治療前比較，*P<0.05；與PMCT組治療后比較，#P<0.05。2.4 兩組患者復發(fā)率及生存率比較 聯(lián)合組在0.5年、1年、2年的復發(fā)率及生存率均明顯低于和高于對照組(P<0.05)，見表5。表5 兩組患者復發(fā)率及生存率比較(%)組別例數復發(fā)率生存率0.5年1年2年0.5年1年2年PMCT組 3

15、08(26.7)15(50.0)20(66.7)23(76.7)17(56.7)13(43.3) 聯(lián)合組 32 4(12.5)* 10(31.3)*13(40.6)*29(90.6)* 24(75.0)*20(62.5)*注：與PMCT組比較，*P<0.05。2.5 兩組治療不良反應 PMCT組及聯(lián)合組CIK細胞回輸治療均未出現或級嚴重不良反應，治療后主要的不良反應為穿刺部位滲血、肝區(qū)隱痛、發(fā)熱及輕微乏力，經對癥處理，上述癥狀均消失。臨床觀察未發(fā)現有明顯肝腎心肺、血液系統(tǒng)和神經系統(tǒng)毒性作用，亦無明顯自身免疫疾病臨床表現。3 討論 目前，治療肝癌的有效方法有手術切除、局部消融和經肝動脈栓塞

16、等，均能極大地減少腫瘤負荷，取得顯著的階段性臨床療效。然而，腫瘤常常在治療后1年內出現復發(fā)。研究顯示，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫功能失調密切相關，免疫系統(tǒng)無法識別和清除惡變和突變的細胞致使腫瘤細胞逃逸機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，因此對于影像學上肉眼無法分辨的微小病灶，最終需要動員機體免疫系統(tǒng)識別和清除惡變腫瘤細胞才能徹底清除9,10。 PMCT治療不僅直接使腫瘤細胞凝固壞死，原位徹底滅活肝癌組織，而且還能提高免疫細胞數量及其抗腫瘤功能，而手術切除腫瘤有可能直接或間接地抑制細胞免疫11。PMCT能提高機體免疫功能，其機制為12,13： PMCT減輕了患者的腫瘤負荷及相應的免疫抑制因子； PMC

17、T在腫瘤局部造成了炎性環(huán)境，有利于抗原提呈細胞提取、加工腫瘤抗原，誘發(fā)抗腫瘤免疫； PMCT降低了免疫抑制因子的水平，腫瘤細胞分泌的可溶性IL-2 受體能中和活化T 淋巴細胞分泌IL-2，使肝癌患者IL-2水平降低； PMCT可刺激淋巴細胞活化，釋放細胞因子，通過細胞因子網絡調節(jié)作用，增強機體的免疫力。Schueller 等14研究發(fā)現，熱療通過加強肝癌細胞HSP70和HSP90 的表達，能增加對肝細胞癌的免疫能力；AFP具有免疫抑制作用，PMCT后患者AFP明顯下降，進一步解除了機體的免疫抑制。但近些年研究發(fā)現，雖然PMCT治療可刺激局部免疫反應，但持續(xù)時間較短，提示微波治療后有必要進行免疫

18、治療，進一步鞏固和擴大微波治療后減滅瘤負荷的成果，達到降低和延緩腫瘤復發(fā)的目的15。 CIK是一群增值率高并具有抗腫瘤活性的異質細胞，通過穿孔素/顆粒酶殺傷腫瘤細胞16。CIK抗腫瘤已經被批準臨床試驗，許多病人已經由此獲得良好的治療效果17-19。與傳統(tǒng)的肝癌切除相比，免疫治療具有副作用少、減少腫瘤免疫逃避及避免免疫耐受的優(yōu)點。CIK細胞主要通過3種途徑發(fā)揮抗癌作用20： CIK在體內通過LFA/ICMA-1 等粘附因子粘附并穿過內皮細胞，直接識別并定位到血管外的腫瘤組織，分泌含大量BLT 酯酶的顆粒進而裂解殺傷腫瘤細胞； 分泌IL-2、IL-6、TNF-及GM-CSF等細胞因子，改造機體的內

19、免疫環(huán)境，在DC 細胞的存在下激活體液免疫并起到協(xié)同作用，提高機體免疫功能，抑制腫瘤細胞生長； 誘導腫瘤細胞凋亡從而抑制肝癌發(fā)展 本研究結果顯示，聯(lián)合組治療總有效率和KPS有效率明顯高于PMCT組；兩組治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯升高，而CD8+及AFP明顯下降，聯(lián)合組升高或下降較PMCT組更為顯著；聯(lián)合組在0.5年、1年、2年的復發(fā)率及生存率均明顯低于和高于對照組(P<0.05)；治療期間均未出現嚴重不良反應。由此可知，PMCT聯(lián)合自體CIK細胞治療HCC療效明顯優(yōu)于單純PMCT，可明顯調節(jié)患者免疫狀態(tài)，降低復發(fā)率和提高生存率，安全可靠，值得臨床推廣應用。參考

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