2019年三色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3的方法

1、三色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4、CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3的方法王琦 1 張行 1 邵雁 2 陳大方 1 陳萍 1 曹江 1目的 為探討甲狀腺患者外周血中Foxp3+ / CD4 T細(xì)胞的表達(dá)及在甲狀腺惡性腫瘤患者外周血手術(shù)前后的臨床意義。方法建立流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CD4、CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3的方 法。 結(jié)果 外周血中Foxp3+/CD4 T細(xì)胞平均比例，體檢健康組為3.7629 ± 1.9996%，甲狀腺惡性腫瘤術(shù)前組為 9.1492±6.4704%，術(shù)后組為 7.4435±6.3587%。結(jié)論 甲狀腺惡性腫瘤 患者Foxp3+/ CD4 T細(xì)胞平均比例

2、明顯高于體檢健康者（PV 0.05 ）。而甲狀腺惡性腫瘤患者術(shù)后Foxp3+/CD4 T細(xì)胞平均比例則低于術(shù)前。關(guān)鍵詞 : 流式細(xì)胞術(shù)、甲狀腺癌、 Foxp3CD4、CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是天然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的重要亞群之一，在穩(wěn)定的自身免疫環(huán)境中發(fā)揮重要的作用 1。 Foxp3 特異性地表達(dá)在 CD4+、 CD25+Treg 細(xì)胞上，并在該細(xì)胞 的發(fā)育和功能維持中起很重要的作用，進(jìn)而提示Foxp3可能是CD4、CD25Treg細(xì)胞的一個(gè)特征性標(biāo)志。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞有可能以某種機(jī)制抑制著機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫 應(yīng)答，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生 ，目前調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與腫瘤免疫機(jī)制及治療的研究逐漸

3、成為 熱點(diǎn)。甲狀腺癌是最為常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，占頭頸部腫瘤的首位，本研究為探討Foxp3+ / CD4 T細(xì)胞在甲狀腺惡性腫瘤患者外周血手術(shù)前后外周血中的表達(dá)，我們建立三色 法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CD4、CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3的方法，并討論其臨床意義。1 材料與方法1.1臨床資料與分組：收集甲狀腺癌患者（2007年11月2008年2月期間本院住院患者）外周血共 41 例，術(shù)前 24例， 其中的 17例患者術(shù)后 7天取外周血， 行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CD4+、 CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3檢測(cè)，所有患者手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)診斷。健康對(duì)照組21例,為本院體檢中心體檢健康者。1.2主要試劑

4、和儀器：淋巴細(xì)胞分離（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試機(jī)有限公司），CD4-FITC、CD25-PE購(gòu)自 Caltag 公司， Foxp3-PE-Cy5、 IgG2a- PE-Cy5、 Foxp3 破膜試劑盒等均購(gòu)自 eBioscience 公司，正常大鼠血清購(gòu)自杭州聯(lián)科有限公司。低溫高速離心機(jī)（HERAEUS D-37520德國(guó)）,流式細(xì)胞儀 EPICS XL 型 （Beckman Coulter 美國(guó)）。1.2 方法：1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞( PBMC )分離取患者外周靜脈血 4ml以EDTA抗凝，充分混勻。取10ml離心管，將4ml全血緩慢加 在 4ml 淋巴細(xì)胞分離液上部，2000 轉(zhuǎn) /分鐘室溫

5、離心 20 分鐘。輕輕吸取中間白色的淋巴細(xì)胞層至另一管，2000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心 5分鐘，去上清。加 2ml PBS混勻，2000轉(zhuǎn)/分室溫 離心 5 分鐘，去上清。計(jì)數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度至1X106ml-1。1.2.2 流式樣本制備取2001上述單細(xì)胞懸液，在對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管中分別加入100卩,且在兩管中均加入CD4-Pcy5、CD25-FITC 各 5 門 4C避光孵育 30 分鐘。力口 1ml Flow cytometry Staining buffer , 混勻。2000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心5分鐘，去上清。對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管中各加入2ml破膜劑。4C避光孵育 45-60 分鐘。 2000轉(zhuǎn)/分鐘

6、，離心 5分鐘，去上清。對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管中各加入 2ml Permeabilization Buffer ， 2000 轉(zhuǎn)/分鐘，室溫離心 5 分鐘，去上清。重復(fù) Permeabilization Buffer 洗細(xì)胞步驟一次。對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管各加入100卩Permeabilization Buffer，充分混勻，再加正常大鼠血清2 M, 4 C避光孵育15分鐘。無(wú)需Permeabilization Buffer清洗細(xì)胞，直接在對(duì)照 管中加入IgG1-PE 2.5，實(shí)驗(yàn)管中加入 Foxp3-PE 20 d。4C避光孵育至少 30分鐘。對(duì)照管 和實(shí)驗(yàn)管中各加入 2ml Permeabilizatio

7、n Buffer， 2000轉(zhuǎn)/分鐘，室溫離心 5分鐘。去上清， 重復(fù) Permeabilization Buffer 清洗步驟一次。加 400ul Permeabilization Buffer 上機(jī)檢測(cè)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用 SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異以LSD法進(jìn)行兩兩比較，PV0.05為有顯著性差異。2. 結(jié)果2.1甲狀腺惡性腫瘤手術(shù)前、后外周血中CD4/ CD25 T細(xì)胞的平均比例：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體檢健康者外周血中CD4/CD25T細(xì)胞的平均比例為 22.4048 ± 7.5827%，甲狀腺惡性腫瘤術(shù)前外周血中 CD4/CD25 T細(xì)胞的平均比例為19.7

8、725 ± 7.9942%，術(shù)后組為21.5765 ±9.1018%。無(wú)顯著性差異(P>0.05 )。2.2甲狀腺惡性腫瘤組術(shù)前Foxp3+/CD4T細(xì)胞的平均比例(9.1492 ± 6.4704%),明顯高于體檢健康者(3.7629 ± 1.9996%),二者相比有顯著性差異(Pv 0.05 )。2.3 甲狀腺惡性腫瘤組進(jìn)行腫瘤切除術(shù)后，外周血中的Foxp3+/ CD4T 細(xì)胞的平均比例7.4435 ±6.3587%),而體檢健康者為( 3.7629± 1.9996%),二者相比有顯著性差異(Pv0.05 ）。2.4甲狀腺惡性

9、腫瘤術(shù)后組外周血中的Foxp3+/CD4T細(xì)胞的平均比例(7.4435 ± 6.3587%)低于術(shù)前組(9.1492 ± 6.4704%),無(wú)顯著性差異(P> 0.05 )3. 討論 :腫瘤的發(fā)生是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)測(cè)的結(jié)果,在腫瘤宿主體內(nèi)許多可以被自體T 細(xì)胞識(shí)別的腫瘤相關(guān)抗原目前已經(jīng)被證明是自身的正常組分。通過外周耐受抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞活性的機(jī)制, 也同樣影響著對(duì)腫瘤相關(guān)的自身抗原的應(yīng)答, 從而參與腫瘤在宿主體內(nèi)發(fā) 生和發(fā)展，而具有免疫調(diào)節(jié)潛力的 CD4 CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞就是限制自身免疫反應(yīng)的重要因 素之一 3、4。甲狀腺腫瘤是較常見的內(nèi)分泌腺腫瘤,臨床最初

10、多表現(xiàn)為無(wú)痛性甲狀腺結(jié)節(jié), 在總?cè)巳褐械陌l(fā)病率為4%7%其中大多數(shù)為良性，但約有5%為惡性5。甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后是多種基因相互或獨(dú)立作用的結(jié)果, 了解各種類型甲狀腺癌及其不同病程階段的 基因和編碼蛋白表達(dá)變化,對(duì)于分析病變相關(guān)分子生物學(xué)具有重要的意義6。本研究收集甲狀腺惡性腫瘤患組 24例,甲狀腺切除術(shù)后組 17例,體檢健康組 21例, 用三色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD4 / CD25 T細(xì)胞、Foxp3+ / CD4T細(xì)胞的平均比例。結(jié)果表明,甲狀腺惡性腫瘤術(shù)前組、術(shù)后組和體檢健康組三組間CD4+/ CD25+ T 細(xì)胞的平均比例經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無(wú)顯著性差異。而甲狀腺惡性腫瘤組無(wú)論術(shù)前、

11、術(shù)后Foxp3+/ CD4T細(xì)胞的平均比例均高于體檢健康者(PV 0.05 )。目前國(guó)內(nèi)外有報(bào)道腫瘤患者外周血和腫瘤組織中CD4/CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞升高，并且在腫瘤組織切除后外周血中CD4/ CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平有所下降。本實(shí)驗(yàn)中甲狀腺惡性腫瘤術(shù)后組外周血中的Foxp3+ / CD4T細(xì)胞的平均比例(7.4435±6.3587%)低于術(shù)前組( 9.1492±6.4704%),呈下降趨勢(shì),與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道 一致。為臨床提供了觀察患者手術(shù)療效的一個(gè)有效指標(biāo)。流式細(xì)胞儀在分析細(xì)胞群體時(shí)具有速度快、 多參數(shù)、 細(xì)胞數(shù)量大等優(yōu)點(diǎn), 此方法檢測(cè)外 周血在臨床上應(yīng)用非常廣泛，本實(shí)

12、驗(yàn)建立三色法檢測(cè)外周血中CD4、CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3的方法，可及時(shí)了解患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平的變化，為臨床觀察手術(shù)、藥物及基因治療等療效提供一定的依據(jù),也可作為對(duì)患者預(yù)后的判斷和隨訪治療的參考。參考文獻(xiàn)：1. 呂凌。介導(dǎo)CD4 +、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育與功能的一個(gè)關(guān)鍵基因-Foxp3J 。國(guó)際免疫學(xué)雜志, 2006, 29(2)：65-68。2. Fontenot JD, Gavin EW , Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4+、 CD25 + regulatory T cellsJ . Nat Immunol, 2003, 4（4）:330-336.+ +3. 崔永生，李欣，于春雷等肺癌和乳腺癌患者外周血中CD4 CD25 T細(xì)胞及Foxp3 mRNA的變化特點(diǎn)及臨床意義 J. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版） ， 2006， 32（5）：843-846 。4. Sakaguchi S. Regulatory T cells : key controllers of immunologic self-toleranceJ.Cell, 2000, 101: 455-458.5. 許晨，趙文川 . 甲狀腺分子標(biāo)記物研究進(jìn)展 J. 現(xiàn)代腫