組合化學(xué)的高通量合成策略

1、    組合化學(xué)的高通量合成策略    段梅莉【摘 要】本文對(duì)一門新興的用于新藥開發(fā)的組合化學(xué)技術(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)要的歸納和總結(jié)。組合化學(xué)的高通量合成策略從合成方法學(xué)上歸納為三類方法:平行合成法、裂分合成法、集組式合成。并概括介紹了高通量合成的重要輔助因子固相載體技術(shù)和自動(dòng)化技術(shù)?！娟P(guān)鍵詞】組合化學(xué) 高通量合成 新藥開發(fā)【中途分類號(hào)】o621.3 a 1673-8209(2009)11-0-0320世紀(jì)80年代末興起的組合化學(xué)技術(shù)在新藥開發(fā)的過程中,在先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化上取得了卓有成效的研發(fā)結(jié)果。組合化學(xué)所運(yùn)用的高通量合成技術(shù)與傳統(tǒng)的有機(jī)合成有顯著的不同。如

2、圖1所示,一般有機(jī)合成方法每次合成得到一個(gè)產(chǎn)物。高通量合成技術(shù)則是進(jìn)行組合合成,用一個(gè)構(gòu)建模塊a與另一個(gè)構(gòu)建模塊b的n個(gè)單元同時(shí)進(jìn)行一步反應(yīng),可以得到n個(gè)產(chǎn)物。用一個(gè)構(gòu)建模塊a的m個(gè)單元與另一個(gè)構(gòu)建模塊b的n個(gè)單元同時(shí)進(jìn)行一步反應(yīng),則得到m×n個(gè)化合物;若進(jìn)行y步反應(yīng),則得到n×n×y或m×n×y個(gè)化合物。有人作過統(tǒng)計(jì),一個(gè)化學(xué)家用組合合成在26周完成的工作量,相當(dāng)于十個(gè)化學(xué)家用傳統(tǒng)方法花費(fèi)一年時(shí)間才能合成得到的化合物數(shù)目。由此可見,高通量合成大幅度提高了新化合物的合成效率,減少了時(shí)間和資金的消耗,成為繼20世紀(jì)末至今化學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。高通量

3、合成可以分為固相組合合成和液相組合合成兩大類,組合化合物庫(kù)也相應(yīng)的分類為固相庫(kù)和液相庫(kù)。因此庫(kù)化合物的合成策略應(yīng)當(dāng)圍繞著這二大類組合合成展開進(jìn)行。高通量合成從合成方法學(xué)上來說,可歸納為以下三種方式:平行合成法;裂分合成法;集組式合成。1 平行合成法(parallel synthesis)也稱間隔平行式合成。間隔平行式合成的基本原理是一孔一化合物。與傳統(tǒng)有機(jī)合成的原理相似,通過空間隔開的整齊排列的反應(yīng)器皿來平行合成化合物。由于在特定區(qū)域可得到很純的化合物,因此化合物結(jié)構(gòu)測(cè)定容易,參數(shù)相對(duì)容易取得。該方法的特點(diǎn)是合成速度較快、化合物數(shù)目較大,可用于固相組合合成和液相組合合成中。平行合成法多使用96

4、孔微量滴定板操作。平行合成法已成功用于抗菌化合物和神經(jīng)激肽-2拮抗劑類似物等化合物庫(kù)的制備。當(dāng)化合物庫(kù)有許多生物活性化合物供篩選時(shí),使用平行合成法最適合。因?yàn)槠叫泻铣煞ê铣傻幕衔锸且豢滓换衔?單個(gè)化合物對(duì)新藥開發(fā)中先導(dǎo)化合物優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系研究(sar)特別有價(jià)值。平行液相合成和平行固相合成均可快速、高效的合成出對(duì)應(yīng)大量單個(gè)化合物的液相庫(kù)和固相庫(kù)。固相庫(kù)的合成產(chǎn)量可以從納摩爾到毫摩爾不等,一般來說液相庫(kù)的產(chǎn)量較固相庫(kù)高。化合物庫(kù)容量在幾千以上時(shí),多采用自動(dòng)化裝置進(jìn)行合成。1.1 多針法(polypin)也稱多中心合成法,它是geyson教授發(fā)明的用于多肽合成的一種96孔微量滴定板反應(yīng)裝置。該

5、裝置每孔對(duì)應(yīng)使用長(zhǎng)40mm,直徑4mm的聚乙烯小棒(針)固定在滴定板上進(jìn)行操作。每個(gè)小棒承載的化合物量在100納摩爾-50微摩爾不等,可合成超過25mg的產(chǎn)物。這種多針合成反應(yīng)裝置已成功地用于口蹄疫病毒抗原體的免疫學(xué)研究上。多針合成法的具體操作是,將浸在丙烯酸水溶液中的聚乙烯(pe)或聚丙烯(pp)小棒用射線照射,使針的表面活化?；罨蟮尼槺霍然采w。這些羧基與長(zhǎng)鏈的結(jié)合分子連接后,就提供了既能增加反應(yīng)體系流動(dòng)性又可以連接構(gòu)件的氨基基團(tuán)。把不同的氨基酸溶液反應(yīng)試劑移到96孔微板的每個(gè)孔中,即可對(duì)每一根針進(jìn)行獨(dú)立的合成反應(yīng)。在每步反應(yīng)完成后將小棒移開,在一個(gè)公共反應(yīng)器中對(duì)這些小棒同時(shí)進(jìn)行樹脂珠

6、的沖洗等純化操作。重復(fù)這些操作直至拿到理想化合物。對(duì)應(yīng)小棒上的目標(biāo)產(chǎn)物可通過切割分離到滴定板的每個(gè)孔中,就使得每個(gè)孔均含有一個(gè)單獨(dú)的化合物。使用連在針上的多肽進(jìn)行生物活性測(cè)定時(shí),可與多種靶分子進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn),操作可反復(fù)進(jìn)行多達(dá)幾十次。多針合成法是一種有效平行合成多肽的方法,尤其是以羧基或酰胺結(jié)尾的多肽。該法也可用以合成苯并二氮雜窧類有機(jī)小分子化合物庫(kù)。目前該技術(shù)正向著高負(fù)載量、多種官能團(tuán)化的固相載體材料以及多樣性豐富的化學(xué)反應(yīng)方向發(fā)展。在先期為抗原位點(diǎn)研究進(jìn)行的多肽合成中,多針合成法產(chǎn)生了非常大的影響,已成為最有價(jià)值的組合化學(xué)合成技術(shù)的標(biāo)志。1.2 茶葉袋法(tea-bag)茶葉袋法是hough

7、ten教授1986年發(fā)明的一種組合合成技術(shù)。該技術(shù)自使用以來,對(duì)探明激素分子活性片段有關(guān)的構(gòu)效關(guān)系研究、對(duì)蛋白質(zhì)片斷構(gòu)象的探察以及對(duì)rgd肽類似物的深入研究都顯示了很大的功效。該方法的固相載體為常見的merrifield聚苯乙烯樹脂,反應(yīng)容器為化學(xué)惰性的多孔pe小袋,袋子的大小尺寸約為15mm×22mm,茶葉袋網(wǎng)眼74um,可防止樹脂珠漏出,保證溶劑等可溶性物質(zhì)的出入。為了高通量合成大容量的多肽庫(kù),節(jié)省時(shí)間和工作量,在相同的化學(xué)反應(yīng)步驟中,每一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)可容納多個(gè)袋子,同時(shí)進(jìn)行相同的反應(yīng),集中進(jìn)行洗滌、脫保護(hù)和中和。再集中切除樹脂珠。根據(jù)茶葉袋的尺寸和樹脂珠的質(zhì)量,化合物庫(kù)每個(gè)產(chǎn)物的

8、產(chǎn)量大約為7-15mg,多的可達(dá)100mg。使用這種集中進(jìn)行共同反應(yīng)步驟的方法,在制備肽庫(kù)時(shí)大大提高了合成效率,使之成為組合合成的典型范例。1.3 點(diǎn)陣法該法是以纖維素紙片作為固相載體的合成技術(shù)。以纖維素為基質(zhì)的紙片具有多孔性和極性,可在篩選時(shí)避免出現(xiàn)非特異性蛋白結(jié)合的副作用。但其缺點(diǎn)是不耐受強(qiáng)酸環(huán)境,僅適合fmoc保護(hù)方式的構(gòu)件。該合成反應(yīng)操作簡(jiǎn)便,雖無制備意義,但其合成技巧可以與嫁接多針掃描法及超大規(guī)模固定化多肽合成技術(shù)相媲美。點(diǎn)陣法多肽庫(kù)的合成已用于對(duì)人體巨細(xì)胞病毒蛋白抗原決定簇的定位試驗(yàn)。點(diǎn)陣法斑點(diǎn)合成技術(shù)操作是,控制所用試劑的體積,選擇斑點(diǎn)的位置,使斑點(diǎn)布滿一張紙面而又不發(fā)生重疊。這

9、些斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)不同的多肽,可以用鉛筆標(biāo)記斑點(diǎn)。將結(jié)合分子接到紙上后,對(duì)每個(gè)斑點(diǎn)滴加相應(yīng)高濃度的氨基酸活化酯溶液,經(jīng)洗滌-脫保護(hù)-再洗滌處理,完成一個(gè)構(gòu)件的縮合。如此反復(fù)操作進(jìn)行多肽的合成。用溴酚藍(lán)指示劑給紙片染色,通過觀察由藍(lán)到黃的顏色變化(游離的氨基被?；?來跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。1.4 光印法(light-directed parallel synthesis)也稱超大規(guī)模固定化多肽合成(very large scale immobilized peptide synthesis, vlsips)。光印法是將固相合成技術(shù)與光敏式印刷技術(shù)結(jié)合為一體的一種高通量合成方法。它是平行合成中較為特殊的一種方法,

10、其關(guān)鍵技術(shù)是對(duì)光不穩(wěn)定的保護(hù)基通過特殊位置的光照會(huì)選擇性的斷裂。該法可以在一張50um2的玻璃載片上合成出容量高達(dá)5萬的多肽或寡聚核苷酸的化合物庫(kù)。并且每種特定產(chǎn)物序列占據(jù)空間的一個(gè)特定區(qū)域。由于篩選是連在載體上進(jìn)行,經(jīng)熒光顯色篩選識(shí)別出有生物活性化合物的結(jié)構(gòu),可由其所在位置得到確認(rèn),合成十分精確。該合成技術(shù)已用于內(nèi)啡肽的抗體合成篩選試驗(yàn)。2 裂分合成法(split-poll synthesis)亦稱混合-裂分式合成、一珠一化合物(one-bead one-product, obop)。裂分合成法是最早也是至今應(yīng)用最廣泛的一種高通量組合合成技術(shù)。該法只需幾個(gè)反應(yīng)器即可構(gòu)成一個(gè)容量龐大的化合物庫(kù)

11、,是合成大量不同化合物最常用的方法。裂分合成技術(shù)為藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了充足的化合物資源,改變了傳統(tǒng)的單一合成/單一篩選的藥物研究格局。裂分合成法只需幾個(gè)反應(yīng)器就可以產(chǎn)生一個(gè)化合物庫(kù),圖2例示了三個(gè)構(gòu)建單元通過三步反應(yīng)的裂分合成。具體操作是,將固相載體樹脂珠分成數(shù)目相等的三部分,每一部分放在單獨(dú)的反應(yīng)器中,各部分獨(dú)自與不同的構(gòu)建單元a、b和c反應(yīng),這樣每一個(gè)樹脂珠就連接上了一個(gè)構(gòu)建單元。當(dāng)?shù)谝徊椒磻?yīng)完成后,將每個(gè)反應(yīng)器中的樹脂珠分成數(shù)目相等的三部分,并混合每一個(gè)反應(yīng)器中的樹脂珠成均等的三部分,爾后集中在一個(gè)器皿中進(jìn)行常規(guī)的沖洗和脫保護(hù)程序。然后將每一部分樹脂珠放在單獨(dú)反應(yīng)器中獨(dú)自與不同的構(gòu)

12、建單元a、b和c反應(yīng),這樣每一個(gè)樹脂珠就連接上了第二個(gè)構(gòu)建單元。如此反復(fù)直至庫(kù)容量達(dá)到了33=27個(gè)化合物。裂分合成法合成的特點(diǎn)是obop,即每一個(gè)樹脂珠都連有一個(gè)單獨(dú)的化合物。因此,該法的組合化合物庫(kù)又稱為一珠一化合物庫(kù)。裂分合成法制得的化合物庫(kù)中產(chǎn)物的數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng),n=bx(n為庫(kù)容量;b為構(gòu)建單元數(shù);x為合成步驟數(shù))。用高效的編碼技術(shù)輔助進(jìn)行裂分合成時(shí),可以幾個(gè)小圓柱形反應(yīng)器為混分操作的基礎(chǔ)單元,每一個(gè)反應(yīng)器由微孔外壁將幾百粒樹脂珠和射頻記錄片包在其中,在合成反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)輸入該構(gòu)件單元的射頻信號(hào)。因此合成完成后,通過解讀記錄片上的信號(hào)即可識(shí)別反應(yīng)器內(nèi)連在樹脂珠上的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)信息。每

13、一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)的所有樹脂珠上均連著同一產(chǎn)物,這樣得到的化合物庫(kù)稱其為一反應(yīng)器一化合物庫(kù),即ovop(one-vessel one-product)庫(kù)。裂分合成法合成的庫(kù)化合物的生物活性篩選可以直接用樹脂珠上的化合物測(cè)試活性,更可靠的方法是用固相載體上切下的混合物溶液來測(cè)試。解纏繞過程是常用的一種對(duì)混合裂分合成化合物庫(kù)進(jìn)行生物活性篩選的方法和手段。3 集組式合成(pooling synthesis)也稱混合試劑合成法。集組式合成的特點(diǎn)是對(duì)全部構(gòu)件進(jìn)行有序排列并按一定形式編組。每一組含有多種不同的構(gòu)件,一組作為一種構(gòu)建單元投入合成。庫(kù)化合物組合合成的每一步反應(yīng)都是在構(gòu)建單元混合物的反應(yīng)器皿中進(jìn)行。固

14、相集組式合成得到的不是一珠一化合物庫(kù),而是一珠一組甚至是一珠多組化合物庫(kù)。液相集組式合成得到的化合物庫(kù),可以按組分布,每一組均含多種化合物。不管是固相庫(kù)合成還是液相庫(kù)合成,兩者都需要高效的編碼技術(shù)輔助進(jìn)行,以備在其后的生物篩選中它們的結(jié)構(gòu)信息得到及時(shí)的識(shí)別。集組式合成可歸納為正交編組法、索引編組法以及模板核心法三種形式的操作過程。集組式合成是發(fā)現(xiàn)藥物先導(dǎo)化合物最經(jīng)濟(jì)的方法。該方法實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低,不必逐一合成組合庫(kù)中各個(gè)單組分,一般的實(shí)驗(yàn)室即能進(jìn)行合成操作。雖然該法簡(jiǎn)易可行,但缺點(diǎn)也明顯,即組分越多,分析跟蹤及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)識(shí)別的難度越大。4 固相載體技術(shù)固相合成技術(shù)是高通量合成的核心內(nèi)容,該技術(shù)從2

15、0世紀(jì)60年代被merrifield創(chuàng)造性地成功合成多肽以來,便得到了極大的重視。在國(guó)際醫(yī)藥企業(yè)的合力運(yùn)作下,1990年代至今固相合成技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展,基本形成了固相有機(jī)合成化學(xué)的獨(dú)立學(xué)科。而且固相合成技術(shù)遠(yuǎn)未成熟,被認(rèn)為仍有極大的發(fā)展空間,現(xiàn)在的成果只是金山一角。有統(tǒng)計(jì)表明,與有機(jī)化學(xué)相關(guān)的排名前15位的國(guó)際期刊幾乎每一期均刊登與固相有機(jī)合成相關(guān)的論文。固相合成技術(shù)最基本的構(gòu)成要素就是固相載體。因此固相載體技術(shù)可以說是固相庫(kù)合成的基石。4.1 功能樹脂固相載體是在各種溶劑中不溶解但可溶漲的高聚物材料,即功能樹脂。高通量合成要求載體具有一定的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度;能夠與結(jié)合分子相連,但對(duì)庫(kù)合

16、成中使用的反應(yīng)條件惰性,在需要時(shí)隨時(shí)方便斷開;能夠在結(jié)合分子上延續(xù)化合物的制備,延續(xù)的合成步驟不破壞載體,也不影響其它化學(xué)鍵。隨著高分子材料的發(fā)展,基于交聯(lián)聚苯乙烯(ps)的高強(qiáng)度merrifield樹脂、在極性非質(zhì)子溶劑中溶解度高,官能團(tuán)保護(hù)、脫保護(hù)和切割條件更加溫和的聚酰胺樹脂以及可在水相中進(jìn)行合成、對(duì)酶學(xué)研究意義重大的tentagel(ps-peg copolymer)樹脂等各類功能性樹脂材料被先后開發(fā)出來。任何功能樹脂均可以按合成的要求制成固相載體。固相載體從外形上可以分為樹脂珠、多針和薄片。4.2 樹脂珠技術(shù)(bio-bead)絕大多數(shù)的固相庫(kù)合成是通過樹脂珠技術(shù)來實(shí)施的。1g樹脂可

17、以制成幾百萬個(gè)樹脂珠,按照“三倍多余”的原則,可以構(gòu)建一個(gè)10萬個(gè)產(chǎn)物的化合物庫(kù)。每個(gè)樹脂珠的直徑大約為100?m,可承載200pmol的化合物。樹脂珠的制備方法是,向單體有機(jī)相和交聯(lián)劑的混合水溶液中加入自由基引發(fā)劑,升溫啟動(dòng)聚合反應(yīng),將微小液滴轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w球狀小珠子顆粒。其聚合反應(yīng)的要點(diǎn)是保證小珠體積均一。運(yùn)用平行合成法、裂分合成法進(jìn)行的組合合成均可得到每一個(gè)樹脂珠都連有一個(gè)單獨(dú)化合物的一珠一化合物庫(kù),即obop(one-bead one-product)庫(kù)。4.3 薄片技術(shù)(thin tag)任何一種能在樹脂珠上進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)均能在薄片上實(shí)施合成反應(yīng)。用ps樹脂制成的形似小餅干的薄片(chi

18、p),如四邊形、三角形、圓形、五角形和六角形的小薄片,它們有一定的強(qiáng)度和許多微孔,且有良好的溶脹性。由于較大的表面積,產(chǎn)物的上載量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于一粒樹脂珠,因此較有制備意義。運(yùn)用裂分合成法組合合成可得到每片薄片上有一種產(chǎn)物的化合物庫(kù),即ocop(one-chip one-product)庫(kù)?；诩埰谋∑勺鳛辄c(diǎn)陣法平行合成的載體。而基于玻片的薄片可作為光印法平行合成的載體。4.4 固相膜技術(shù)基于高聚物的薄片比紙片的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定,因而可以承受更寬的化學(xué)反應(yīng)條件范圍。聚氟乙烯膜制成的高聚物薄片的點(diǎn)合成,其合成方法與紙片斑點(diǎn)技術(shù)相似,將膜表面用乙二胺衍生化后,便提供了帶有氨基的活化基團(tuán)表面。將有fmo

19、c保護(hù)的丙氨酸活化酯溶液以規(guī)則的空間排布方式點(diǎn)到固相膜上,就得到了用于多肽合成的斑點(diǎn)。在點(diǎn)合成偶聯(lián)步驟之間,膜可被多次晾干-洗滌-再晾干,用哌啶溶液脫fmoc保護(hù),多肽的多種產(chǎn)物就集合在一張薄片上。還有一種固相膜三明治合成技術(shù),是將兩張pp小片夾住樹脂珠,像三明治一樣,用一種低熔點(diǎn)的聚合物使珠子在膜操作及整個(gè)合成步驟中固定不動(dòng)。運(yùn)用裂分合成法組合合成可得到每張層狀載片上有一種產(chǎn)物的化合物庫(kù),即osop(one-slide one-product)庫(kù)。由于每一張層狀載片上含有許多樹脂珠(可達(dá)幾千粒),則每一種產(chǎn)物的量相對(duì)較高,因此osop庫(kù)合成具有制備意義,比obop庫(kù)合成實(shí)用性高。5 自動(dòng)化合

20、成技術(shù)隨著生物化學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展,每天可篩選上萬個(gè)化合物生物活性的高通量篩選技術(shù)已經(jīng)被廣泛運(yùn)用。當(dāng)組合化合物庫(kù)容量達(dá)到上千的規(guī)模時(shí),在有限的時(shí)間里,完成人工合成和對(duì)生物靶點(diǎn)的篩選是一項(xiàng)十分艱巨的工作。因此庫(kù)化合物的自動(dòng)化高通量合成技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生,可以說這是為了跟上高通量篩選的步伐,而產(chǎn)生的一種快速、高效的合成技術(shù)。與該技術(shù)相配合,需要機(jī)器來完成的操作有,樹脂珠裝載、試劑的轉(zhuǎn)移、合成條件的控制、合成反應(yīng)的進(jìn)行、化合物的分離、純化和結(jié)構(gòu)分析以及樹脂珠的切割等。顯然自動(dòng)化高通量合成技術(shù)是一項(xiàng)繁雜有序的過程工程,它將有機(jī)化學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及信息和電氣自動(dòng)化技術(shù)等多學(xué)科集于一體。組合化學(xué)需要合成大量毫克級(jí)量的化合物來篩選。該特點(diǎn)使得利用高效小型機(jī)件和器械來處理大量樣品,成為節(jié)約省時(shí)最基本的前提。固相庫(kù)的平行合成法組合合成是自動(dòng)化高通量合成技術(shù)取得成功運(yùn)營(yíng)的一個(gè)范例。滴定機(jī)器人等自動(dòng)化機(jī)件被廣泛的使用在許多合成操作上。已知多肽和核酸的組合合成,目前已經(jīng)完全可以用自動(dòng)平行合成儀來進(jìn)行操作。但是自動(dòng)化高通量合成技術(shù)水平仍然低于發(fā)展較為完善的高通量篩選。平行合成自動(dòng)儀每天約產(chǎn)生10002000個(gè)化合物,而微量滴定板上的高