非小細胞肺癌多藥耐藥性病理學檢測的臨床意義

1、非小細胞肺癌多藥耐藥性病理學檢測的臨床意義【摘要】目的檢測113例非小細胞肺癌(nsclc )中谷胱甘肽疏基轉(zhuǎn)移酶n (gst 兀)、肺耐藥相關蛋白(lrp)、dna拓撲異構(gòu)酶ii a ( topo ii a )、多藥耐藥相關 蛋白(mrp)和多藥耐藥基因(mdr1 )的表達，觀察上述指標與腫瘤臨床病理因素 的關系及各指標表達之間的相關性。方法采用免疫組化sp法檢測gst tt、lrp、 topo ii a蛋白的表達;應用原位雜交技術(shù)檢測mrp和mdr1 mrna表達。結(jié)果(1) gst 冗、lrp、topo ii a蛋白及mrp、mdr1 mrna在113例nsclc中的陽性表達率分 別為

2、75. 2%. 80. 5%. 60. 2%. 79. 6%. 51.3%。其中 lrp 表達最高,mdr1 表達最低。 (2)lrp、topo ii a和mrp的表達分別與腫瘤組織學類型有關。(3)gst 兀與mrp (pv0.05)、lrp 與 mrp (p<0. 01 ). mdr1 與 mrp (p<0. 01 )的表達間具有相關 性。結(jié)論(1)多種耐藥相關基因的過度表達及其相互作用可能是nsclc產(chǎn)生原發(fā) mdr的重要原因。(2)lrp和mrp過度表達，topo ii a高表達和mrp低表達可能分 別與肺腺癌、鱗癌的化療敏感性有關?！娟P鍵詞】非小細胞肺癌；多藥耐藥；免疫組

3、化；原位雜交abstract: objective to evaluate the expressions of gst n, lrp, topo ii a, mrpandmdrl in 113 non smal 1 cel 1 lung cancer (nsclc), to observe their relat ionships wi th cl inicopathologic character ization of cancer and their interactions. methods expressions of gst tt , lrp and topo ii a were

4、detected by s p immunohistochemistry, and expressions of mrp, mdr1 mrna in paraffin embedded cancer tissues were detected by in situ hybridization. results (l)the positive rates of gst tt , lrp, topo ii a and mrp, mdr1 mrna were 75. 2%, 80. 5%, 60.2%, 79. 6% and 51. 3% in nsclc, respectively. (2)the

5、 expressions of lrp, topo ii a, mrp had a close relationship with the histological types in nsclc, respectively. (3)there were significant relationships between positive rates of gstn andmrp (p < 0. 05), lrp and mrp (p < 0. 01), mdr1 and mrp (p < 0. 01), respect ively. conclusion (1)the ove

6、rexpressions and interact ions of gst , lrp, topo ii a, mrp and mdr1 are important causes of primary mdr in nsclc. (2)the overexpressions of lrp and mrp, the overexpression of topo ii a and the reduced expression of mrp, which are related with the chemotherapeutic sensitivity in adenocarcinoma and s

7、quamous carcinoma, respect ively.key words: non small cell lung cancer; multidrug resistance; immunohistochemisty; in situ hybridizationo引言多藥耐藥是指腫瘤對一種化療藥物出現(xiàn)耐藥的同時，對其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用 機制各異的化療藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。與小細胞肺癌相比，非小細胞肺癌（nsclc ）的聯(lián)合化療有效率較低，其耐藥性更為突出。本研究采用免疫組化和原 位雜交技術(shù)，對nsclc組織中5種多藥耐藥相關蛋白或mrna的表達進行檢測，試 圖深入了解nsclc

8、的多藥耐藥狀況、相互關系及不同耐藥機制，為nsclc病例制 定合理的化療方案提供理論依據(jù)。1資料和方法1.1病例來源收集武漢大學中南醫(yī)院病理科1996 - 2000年5年間存檔并經(jīng)病理確診的 nsclc手術(shù)切除病例共113例。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放、化療，其中男91例，女 22例；年齡34 - 77歲，均齡57歲；鱗癌39例，腺癌（含細支氣管肺泡癌）61 例，腺鱗癌13例；高分化癌43例，中分化癌47例，低分化癌23例。113例中， 淋巴結(jié)送檢者共90例（有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者53例），23例無 淋巴結(jié)送檢記錄；按tnm分期，i期52例，ii期26例，iii期11例，iv期1例,

9、23例無記錄。標本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片厚45m m。1.2實驗方法1.2.1切片制作標本均經(jīng)10%中性formalin液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4ym厚切片。每例 切片6張。1張he染色，用于腫瘤常規(guī)病理診斷及分類。3張免疫組化染色，用 于觀察腫瘤中g(shù)st tt、lrp及topoiia蛋白表達；2張原位雜交，用于檢測腫瘤 中mrp和mdr1 mrna表達。1.2.2免疫組化染色及原位雜交采用免疫組化sp法。所用鼠抗人gst兀、lrp及top。ii a單克隆抗體分別購 于福州邁新生物技術(shù)公司、上海儀濤生物儀器有限公司，均為即用型。以已知陽 性切片作陽性對照，pbs取

10、代一抗作陰性對照。原位雜交所用地高辛標記mdr1.mrp寡核甘酸探針及檢測試劑盒購于武漢博士德 生物工程有限公司。檢測方法按試劑盒說明書進行。用已知陽性片作陽性對照， 以預雜交液代替一抗作陰性對照。1. 2. 3結(jié)果判斷除topo ii a蛋白陽性表達為細胞核著棕黃色外，gst 兀、lrp蛋白、mrp和mdr1 mrna陽性表達均為胞漿呈棕黃色顆粒。每例隨機取10個高倍視野（x 400 ）,計 數(shù)其陽性細胞百分率。陽性細胞率5%定為陽性，5%視為陰性1。1.2.4統(tǒng)計學處理采用spss 11. 5統(tǒng)計軟件，以雙向無序r x c表的x 2檢驗及fisher精確檢驗作 指標間的差異和相關性分析。p

11、<0. 05為顯著性檢驗標準。2結(jié)果2. 1 5種多藥耐藥相關蛋白或mrna在nsclc中的表達(dlrp蛋白在nsclc中的陽性表達率最高，見圖1 5。mdr1 mrna表達率最低； lrp、topo ii a蛋白和mrp mrna表達與nsclc組織學類型有關。lrp蛋白的表達 為腺癌腺鱗癌鱗癌，其在腺癌中的表達明顯高于腺鱗癌、鱗癌(p<0. 05); topo ii a蛋白在鱗癌中表達最高，明顯高于腺癌和腺鱗癌(pc0.05); mrp mrna 在鱗癌中的表達明顯低于腺鱗癌和腺癌(p<0. 05);上述5種多藥耐藥相關蛋 白或mrna的表達與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

12、狀態(tài)及臨床分期均無相關性(p >0. 05),見表1。表1 113例nsclc中5種多藥耐藥相關蛋白或mrna的表達(略)2.2 5種多藥耐藥相關蛋白或mrna表達間的相關性統(tǒng)計學分析表明，gst 兀蛋白與mrp mrna (p<0. 05). lrp蛋白與mrp mrna (p<0. 01)、mdr1 mrna與mrp mrna (p < 0. 01 )表達間均具有正相關關系。其余 多藥耐藥蛋白或mrna表達間無相關性。3討論多藥耐藥基因mdr1屬于人類mdr基因家族。p糖蛋白(p gp)為mdr1基因的 編碼產(chǎn)物，mdr1基因可導致其過量表達。p gp定位于胞膜和內(nèi)

13、質(zhì)網(wǎng)周邊，是一 種跨膜蛋白質(zhì)，可將進入癌細胞內(nèi)的抗癌藥物泵出癌細胞并導致癌細胞耐藥2。 mdr1幾乎在所有腫瘤類型中都有表達，但其表達水平與肺癌耐藥性和預后的關系 尚一直存在爭議。多數(shù)學者認為mdr1與肺癌多藥耐藥無關，甚至有學者提出mdr1 mrna和蛋白表達與nsclc化療敏感性或細胞內(nèi)/核內(nèi)順鉗的蓄積無關的觀點3。 尚有學者認為二者間存在明顯的關系4。本研究中mdr1在未經(jīng)治療的nsclc 中的陽性表達率為51.3%,表明其可能是導致腫瘤多藥耐藥的因素之一；但mdr1 在本研究5種多藥耐藥相關蛋白或mrna中表達率最低，且其表達與臨床病理因素 均無關，說明mdr1與nsclc生物學表型的

14、關系尚需進一步研究。大量研究表明，mrp基因表達是nsclc原發(fā)多藥耐藥的重要參與因素，尤其參與 腫瘤對長春新堿、依托泊武和阿霉素等藥物原發(fā)性耐藥的形成過程5。本組113 例nsclc中，mrp陽性表達率為79. 6%,提示nsclc具有與mrp基因相關的原發(fā)性 耐藥，且其表達與腫瘤組織學類型有關，在肺鱗癌中的陽性表達率分別明顯低于 腺鱗癌和腺癌(p<005),這與wright等6的報道基本一致。最近double等7 提出mrp1在dna異倍體細胞中的陽性細胞百分率顯著高于dna二倍體細胞，認為 其表達可用于預測腫瘤對化療的反應性，主張對dna異倍體腫瘤應采用不同于二 倍體腫瘤的治療方法

15、。1998年ikeda等8發(fā)現(xiàn)lrp在14個肺癌細胞系中均呈陽性表達，且其mrna 水平與多種抗腫瘤藥物的交叉耐藥有關。berger等9觀察了 16個nsclc細胞 系中l(wèi)rp的表達，發(fā)現(xiàn)每個細胞系均有不同水平lrp表達，且與順鉗的耐藥明顯 相關。在培養(yǎng)基中加入柔紅霉素與博來霉素后，有一半細胞中l(wèi)rp表達顯著升高。 上述研究表明lrp在nsclc中表達頻率非常高，與腫瘤內(nèi)在性和獲得性mdr均有 密切關系。在本研究觀察的5種多藥耐藥相關蛋白或mrna表達中，lrp表達水平 最高(80. 5%),尤其在肺腺癌中的表達分別明顯高于腺鱗癌和鱗癌。我們的觀察 結(jié)果不僅與文獻報道相符，而且進一步說明lrp

16、是導致nsclc多藥耐藥的主要原 因10。一般認為，gst冗在不少腫瘤中均有明顯的基因擴增及表達水平增高，是目前 認為與腫瘤耐藥關系最為密切的一種gst。nakanishi等11用免疫組化法觀察 54例未經(jīng)治療的nsclc,結(jié)果gst兀陽性表達率為69%,但其陽性表達組和陰 性表達組的化療反應率卻分別為16%和47%。最近unsal等12提出，gst 兀的表達并不總能預測nsclc對含有順鈾的聯(lián)合化療藥物的反應性。本組nsclc 病例中，gst兀陽性表達率為75.2%,但其表達與各臨床病理因素間均無相關性。 因此，gst兀在nsclc中的表達意義尚需繼續(xù)深入探討。topo ii a是一種能催化

17、dna超螺旋結(jié)構(gòu)局部構(gòu)型改變的基因核酸，尤其是topo ii a是腫瘤化療的重要靶點。目前應用的topo ii抑制劑是通過形成藥物-酶-dna 復合物干擾酶的活性，從而影響腫瘤細胞dna代謝而發(fā)揮其細胞毒作用，而腫瘤 細胞對topo ii抑制劑的敏感性則主要取決于細胞內(nèi)topo ii的水平。kreisholt等 發(fā)現(xiàn)，在未經(jīng)治療的nsclc中，topo ila表達明顯低于sclc的表達，說明topo ila數(shù)量減少和/或活性降低與腫瘤的耐藥明顯相關，也是nsclc原發(fā)耐藥形成因 素之一 13。本組nsclc中，topo ii a的陽性表達率為60. 2%,提示其也是腫瘤 原發(fā)耐藥的形成因素之一

18、。topo ii a在本組肺鱗癌中的陽性表達率明顯高于腺癌 和腺鱗癌(p<005),與肺鱗癌對化療藥物較敏感的臨床實際相符合。在nsclc 的化療中，有計劃地對topo ii a高表達的肺鱗癌應用topo ii抑制劑可能會取得更 好的療效。本研究結(jié)果表明，gst 兀與mrp、lrp與mrp、mdr1與mrp在nsclc表達間存 在明顯或顯著相關性，表明nsclc原發(fā)mdr的形成是一個多因素、多步驟的復雜 過程，其中包括多種耐藥相關基因的參與及相互協(xié)同作用。因此，深入研究腫瘤 mdr現(xiàn)象及其機制，對制定有針對性個體化治療方案，提高nsclc患者的化療效 果具有重要意義。(本文圖見第164頁)【參考文獻】1余少平，熊永炎，田素芳非小細胞肺癌多藥耐藥及其神經(jīng)內(nèi)分泌分化 的相關性研究j中華結(jié)核和呼吸雜志，2003, 26 ( 3 ): 165168.2 huang x, li l, guo z, et al immunoelectron microscopic analysis of p glycoprotein, p53, and bel 2 protein expressions