生物技術(shù)-基因工程

1、第八章 基因工程1重組DNA技術(shù)23456基因工程的應(yīng)用7 首字母： 大寫：細(xì)菌屬名2-3字母： 小寫：細(xì)菌種名 如 EcoR 1 4 : 大寫: 菌株 1，2: 分離到的次序第一節(jié)、工具酶一、限制酶（restriction enzyme）：限制性內(nèi)切酶 1 類：限制和修飾作用 * * 2 類：識別DNA內(nèi)部位點(diǎn)、切割雙鏈 3 類：同類根據(jù)酶結(jié)構(gòu)、作用及DNA結(jié)合和裂解的特性1、分類2、命名89（2）產(chǎn)生平末端(blunt end):3.酶的識別和切割位點(diǎn):通常4-6bp,具有回文結(jié)構(gòu)(palindrom)（1）產(chǎn)生粘性末端(sticking end) 5-末端: EcoR 1: 5-GAAT

2、TC-3 3-CTTAAG-5 3-末端:Pst1 : 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 Sma1: 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5105.同尾酶(isoaudamers): 識別序列不同,但產(chǎn)生相同的粘性末端 BamH 1 :GGATCC Sau3A 1: NGATCN4.同功異源酶(isochizomers): 來源不同, 識別和切割位點(diǎn)相同 如:BamH 1 和 Bst 1111、DNA聚合酶 大腸桿菌中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)，MW 109KD 方向：53 還具有53及35外切酶活性. 缺口平移法標(biāo)記DNA時(shí)常用二 修飾酶對DNA 或RNA 末端進(jìn)行剪切、補(bǔ)平、連接及化學(xué)修飾的

3、酶。12 兩類：禽類成骨細(xì)胞性白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV） moloney小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV） 方向：53 作用：以RNA為模板合成DNA，構(gòu)建cDNA文庫2、逆轉(zhuǎn)錄酶 （reverse transcriptase）將3-OH 與5-P 連接形成3, 5-磷酸二酯鍵3、T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase）134、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）6、Taq DNA聚合酶 和其它耐熱DNA聚合酶去除DNA or RNA 5-P，制備載體時(shí)可防止載體自身連接， 提高重組效率。5、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶 ：末端轉(zhuǎn)移酶 作用：在DNA的3-OH上，加上 dN

4、TPPCR時(shí)14內(nèi)切酶、堿性磷酸酶、連接酶的作用15*分類： 克隆載體 質(zhì)粒 入噬菌體 粘性質(zhì)粒 M13噬菌體 表達(dá)載體 大腸桿菌表達(dá)載體 哺乳動(dòng)物表達(dá)載體第二節(jié) 載體*本質(zhì)：DNA 攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具。16質(zhì)粒載體 大腸桿菌質(zhì)粒載體 PBR322 枯草桿菌質(zhì)粒載體 PNC3 酵母菌質(zhì)粒載體 農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體 Ti噬菌體載體 噬菌體載體 Cos噬菌體載體病毒載體 SV40病毒載體 乳頭瘤病毒載體17 分子量相對較小，在細(xì)菌中穩(wěn)定存在， 拷貝指數(shù)高。 具有遺傳標(biāo)記： 如抗生素性基因 半乳糖酶基因（LacZ） 具 有 多 個(gè) 酶 的 單 一 切 點(diǎn) 。 稱 多 克 隆 位 點(diǎn)

5、（ multiple cloning sites , MCS） 如 PBR322(人工合成)4.3Kb ：含 AmP(氨卞青霉素)、 Tet(四環(huán)素) 24個(gè)單一切點(diǎn)一 常用的克隆載體1.質(zhì)粒（plasmid）：種類很多，但作為克隆載體須具備。18PBR32219質(zhì)粒的構(gòu)建20質(zhì)粒攜帶外源基因21 溶菌性（Lytic）：在細(xì)菌中連續(xù)增殖直到細(xì)菌裂時(shí)， 釋放噬菌體。 溶原性（Lysogenic）：將其DNA整入細(xì)菌中。 *只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶原周期。2. 噬菌體：最大容量：923kb感染細(xì)菌的病毒根據(jù)生活周期分 特點(diǎn)雙鏈DNA分子（線性或環(huán)形） 兩端具有12個(gè)nt單鏈互補(bǔ)粘性末端 具非

6、必需區(qū)（中間區(qū)約1/3長度） 可在E.Coli中大量繁殖 可克隆15Kb左右的外源基因22噬菌體的溶原周期和溶菌周期2324 插入型載體：外源DNA克隆到分子上，使噬菌體的某種生物 功能喪失效力，即插入失活效應(yīng)。 如：半乳糖酶失活的插入型載體（藍(lán)白篩選） 編碼 載體類型 （兩種）A :載體中含一個(gè)LacZ基因 半乳糖苷酶 X-gal(無色) X(藍(lán)色)+gal(半乳糖) *其中X為有色基因：（4-溴-5-氯吲哚）與gal結(jié)合成無色的X-galB:在含X-gal的培養(yǎng)基中，在Lac操縱子誘導(dǎo)物IPTG（異丙硫半乳糖苷）作用下，細(xì)菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，此菌落為藍(lán)色。25C.若Lac Z

7、基因被外源DNA插入而破壞，則不能制造半乳糖苷酶，菌落為無色（白色）。26取代型載體（又叫替換型載體） 圖8-4基因工程原理P258在DNA分子的中央，插入一段DNA片段： 具有多克隆位點(diǎn)的反向重復(fù)序列 當(dāng)外源DNA插入時(shí)其可被置換掉 作用：提高了克隆外源DNA的能力。27*由DNA的Cos區(qū)與質(zhì)粒構(gòu)建*環(huán)狀雙鏈DNA特點(diǎn)；含質(zhì)粒的抗性標(biāo)記如Amp，Tet 帶Cos區(qū)，可進(jìn)行體外包裝 一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn) 分子量小，容量大 /篩選AP平板2、粘性質(zhì)粒（Cosmid）：容量40-50kb282930（1）大腸桿菌噬菌體（2）基因組DNA全長6.5kb（單鏈）（3）感染后，可復(fù)制成雙鏈DNA（RF，

8、DNA）（4）當(dāng)RF100200后，只有（+）鏈復(fù)制 4種常用載體的比較 P146 表82 篩選：藍(lán)白篩選3、M13噬菌體（M13 phage）3132在受體細(xì)胞中表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）外源基因的載體。二. 表達(dá)載體（expressing vector） 大腸桿菌表達(dá)載體 除克隆載體的特性外還含有：表達(dá)系統(tǒng)元件 啟動(dòng)子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 克隆位點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄終止信號啟動(dòng)子：常用的有 trp-lac啟動(dòng)子（or tac啟動(dòng)子） 噬菌體Pc啟動(dòng)子 T7噬菌體啟動(dòng)子33除含有原核序列：在E-Coli中的復(fù)制起始點(diǎn)、便于篩選的抗性基因還包括真核表達(dá)元件 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子 克隆位點(diǎn) 終止信號和加poly（A）信號哺乳

9、動(dòng)物表達(dá)載體原核受體 E-Coli受體系統(tǒng) 外源基因復(fù)制、擴(kuò)增場所 鏈霉菌受體系統(tǒng) 外源基因表達(dá)場所 酵母菌受體系統(tǒng)真核受體 動(dòng)物（哺乳）細(xì)胞受體系統(tǒng) 一般只作基因表 植物/ 昆蟲細(xì)胞受體系統(tǒng) 達(dá)場所基因工程的受體系統(tǒng)341. 特點(diǎn)：遺傳背景清楚利于研究 繁殖快易獲得大量基因產(chǎn)物（20一代） 含質(zhì)粒利于基因轉(zhuǎn)移 表達(dá)非E-Coli基因，其潛力幾乎是無限的. E-Coli受體系統(tǒng)2. 缺點(diǎn)：高水平表達(dá)基因產(chǎn)物易沉淀、凝集、不易折疊 基因產(chǎn)物純化工藝復(fù)雜 基因產(chǎn)物易受污染（內(nèi)毒素） 基因產(chǎn)物對受體菌有毒害作用 基因產(chǎn)物易被水解 從安全角度并不理想 缺乏基因產(chǎn)物表達(dá)后加工機(jī)制35特點(diǎn)：安全性大 遺傳

10、信息和生理狀況更適合于真核基因表達(dá) 基因產(chǎn)物外分泌 遺傳背景較清楚 具基因表達(dá)后加工機(jī)制二. 酵母菌受體系統(tǒng)36目的基因的獲得載體的選擇與制備目的基因與載體的結(jié)合（DNA分子的體外連接）重組DNA導(dǎo)入受體重組體篩選和鑒定目的基因表達(dá)基因產(chǎn)物的分離純化第三節(jié) 重組DNA技術(shù)的基本過程七步：37. 目的基因的制備方法： 1. 內(nèi)切酶法 2. 機(jī)械力降解 3. 化學(xué)合成 4. cDNA合成 5. PCR制備法 6. 從基因文庫中提取1.限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法或散彈法） 用酶降解染色體DNA（esp原核生物），將降解的DNA克隆到載體上，從而得到目的基因優(yōu)點(diǎn)：原理簡單，操作簡便，具有一定的應(yīng)用范圍。缺

11、點(diǎn)：隨機(jī)性有限，盲目性大，篩選麻煩，應(yīng)用范圍有限 （只適用于原核生物）382、機(jī)械降解法優(yōu)點(diǎn)：隨機(jī)性大缺點(diǎn)：所得基因片段不能直接連接，需加工修飾。用超聲波震蕩等機(jī)械法使DNA斷裂。3. cDNA合成cDNA文庫（Cdna library）：將一個(gè)細(xì)胞中，所有cDNA都與載體連接成重組DNA，并列入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，稱為cDNA文庫。cDNA的獲得： 圖85 七年制P149 不同細(xì)胞，不同細(xì)胞狀態(tài)，得到的cDNA文庫不同。394.PCR（polymerase chain reaction）3、化學(xué)合成法a.acodeDNA化學(xué)合成nt5.從基因文庫中提取基因文庫（genom

12、ic library）：因限制性內(nèi)切酶將基因組 DNA切成片段，每一段與一個(gè)載體連接成重組DNA，并引入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，稱基因文庫。401.粘性末端連接 5末端連接（易） 3末端連接（難） 二.載體的選擇和制備分離純化三.DNA分子的體外連接（外源DNA與載體連接） P與OH形成二酯鍵T4連接酶：載體經(jīng)酶切后，易自身環(huán)化，形成自身載體。 處理方法之一：堿性磷酸酶處理5P412、利用人工接頭（linker）連接帶有限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的一段人工DNA片段423、加入同聚體尾連接：TdT末端加尾的原理43444.平端連接 所用ATP及T4DNA連接酶的濃度比，粘性末端連接要高些

13、（大于2.5倍）45轉(zhuǎn)化程序： 感受態(tài)細(xì)胞+質(zhì)粒DNA 42、90sec 不含抗生素的培養(yǎng)基熱休克37 涂布選擇性平板 37 得到細(xì)胞的克隆 30-60min （合適抗生素） 10hr （使質(zhì)粒擴(kuò)增）四、將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化（transformayion）將質(zhì)粒或其它外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。宿主：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（Competent Cell）：E-coli經(jīng)Cacl2處理（0-5），使細(xì)胞膜通透性增加，從而具有攝取外源DNA的能力。46DNA E-coli 轉(zhuǎn)染動(dòng)、植物病毒DNA 動(dòng)植物細(xì)胞 （transfection） 噬菌體顆粒 E-coli 感染病毒顆粒 動(dòng)、植物細(xì)

14、胞 2.感染（infection）：也稱轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）由噬菌體或病毒介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程有一個(gè)：體外包裝過程47（1）遺傳學(xué)方法 （2） 免疫學(xué)方法 （3）核酸雜交法 （4）PCR技術(shù) （5）酶切鑒定1.遺傳學(xué)方法 篩選轉(zhuǎn)化菌： 含抗性基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后，細(xì)菌在含這種抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌即被殺死，能生長的，就是一轉(zhuǎn)化的。五、重組體的篩選484950A：當(dāng)M13感染空載宿主后，產(chǎn)生完整的LacZ產(chǎn)物。 -半乳糖苷酶 Xgal X（蘭色）+gal（無外源DNA） B：當(dāng)M13插入了外源DNA后，其LacZ基因被破壞，不能與宿主細(xì)胞中LacZ的互補(bǔ)，產(chǎn)生

15、LacZ產(chǎn)物。 Xgal X （蘭色） （含外源DNA 重組克?。〤：藍(lán)白篩選： 篩選帶有重組體的克隆插入失活法（insertion inactivation）鑒別：質(zhì)粒重組體和非重組體適用于： 具有兩個(gè)或兩個(gè)以上抗生素性標(biāo)記的質(zhì)粒。 -互補(bǔ) （-complementation）M13噬菌體（插入了一段LacZ基因）宿主（刪除了一段LacZ基因 Lac-512免疫學(xué)方法 原理：以目的基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物作為Ag，免疫動(dòng)物制備Ab，通過Ag、Ab反應(yīng)，將帶目的基因的克隆篩選出來。方法：放免、化學(xué)方法、顯色反應(yīng)等。523. 核酸雜交法 從基因文庫、cDNA文庫或重組反應(yīng)質(zhì)粒中篩選目的基因。

16、將含有外源DNA的細(xì)菌生長在瓊脂板上 將NC膜或尼龍膜覆蓋平板表面 NaOH處理膜 32P-DNA雜交或RNA X線曝光 放射自顯影 陽性斑點(diǎn)534. PCR技術(shù)5、酶切鑒定54第四節(jié)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染一. 基本方法和原理1.磷酸鈣共沉淀法（Calcium phosphate co-pecipitation）外源DNA或重組質(zhì)粒DNA與磷酸鈣混合，形成微小顆粒，沉積在細(xì)胞表面，被宿主細(xì)胞攝取。2.電穿孔法（electroporation）外源DNA與宿主細(xì)胞混合于電穿孔杯中，在高頻電流作用下，細(xì)胞膜出現(xiàn)許多小孔，外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞。553、DEAE葡聚糖（DEAEDextran）法（帶正點(diǎn)荷）經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞作用吸入細(xì)胞短暫表達(dá)外源DNA（帶負(fù)電荷）4、脂質(zhì)體(liposome)介導(dǎo)基因?qū)腙栯x子脂質(zhì)體（膜成分） DNA負(fù)電荷與細(xì)胞膜溶合外源DNA被釋放到胞漿 短暫表達(dá)565、顯微注射法（microinjection）將外源基因通過毛細(xì)玻璃管，再顯微鏡下注釋到受精卵的細(xì)胞核內(nèi)的方法。57 tk tk 轉(zhuǎn)入外源