基因芯片技術(shù)及其應(yīng)用

1、基因芯片技術(shù)及應(yīng)用示例目錄12345定義基因芯片的分類基因芯片的原理基因芯片技術(shù)的四個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)基因芯片技術(shù)的應(yīng)用定義基因芯片技術(shù)是指采用寡核苷酸原位合成或顯微打印手段，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、并行、高效地檢測(cè)或醫(yī)學(xué)診斷。特點(diǎn)：高通量、高集成、微型化、平行化、多樣化和自動(dòng)化?；蛐酒姆诸惏雌淦煌煞譃椋簾o機(jī)片基芯片和有機(jī)合成片基芯片。按其應(yīng)用不同可以分為：表達(dá)譜芯片、診斷芯片、檢測(cè)芯片。按其結(jié)構(gòu)不同可分為：DNA陣列和寡核苷酸芯片。按其制備方法不同可分為：原位合成芯片和合成后交聯(lián)芯片(

2、合成后點(diǎn)樣芯片)?；蛐酒脑?基于核酸分子堿基之間（A-T/G-C)互補(bǔ)配對(duì)的原理，利用分子生物學(xué)、基因組學(xué)、信息技術(shù)、微電子、精密機(jī)械和光電子等技術(shù)將一系列短的、已知序列的寡核苷酸探針排列在特定的固相表面構(gòu)成微點(diǎn)陣，然后將標(biāo)記的樣品分子與微點(diǎn)陣上的DNA雜交，以實(shí)現(xiàn)對(duì)多到數(shù)萬(wàn)個(gè)分子之間的雜交反應(yīng)，并根據(jù)雜交模式構(gòu)建目標(biāo)DNA的序列，從而達(dá)到高通量大規(guī)模地分析檢測(cè)樣品中多個(gè)基因的表達(dá)狀況或者特定基因(DNA)分子是否存在的目的?；蛐酒夹g(shù)的四個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)1、芯片的制備 主要是原位合成法和直接點(diǎn)樣法。原位合成法適用于寡核苷酸；點(diǎn)樣法多用于大片段，有時(shí)也用于寡核苷酸。原位合成法包括光導(dǎo)合成法和

3、壓電合成法。其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)量大，探針的密度高并且可以和其他芯片制備方法結(jié)合使用，該方法的缺點(diǎn)是探針的長(zhǎng)度較短，一般為2050bp。點(diǎn)樣法包括接觸式點(diǎn)樣和非接觸式點(diǎn)樣又稱噴墨式打印。因點(diǎn)樣法成本高，故適用于芯片上需要同一探針或是探針是長(zhǎng)鏈DNA。2、樣品制備與標(biāo)記 從待檢細(xì)胞或組織中分離出DNA或RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、末端標(biāo)記等操作，標(biāo)記主要有熒光標(biāo)記，生物素或同位素標(biāo)記、現(xiàn)在常用熒光素標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度和使用者的安全性。3、雜交反應(yīng) 屬于固液相反相雜交，探針分子固定于芯片表面，與液相的靶分子進(jìn)行反應(yīng)。但雜交條件的選擇需考慮多方面的因素，如雜交反應(yīng)體系中鹽濃度、探針G-C含量和所帶電

4、荷、探針與芯片之間連接臂的長(zhǎng)度及種類、檢測(cè)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。由于基因芯片影響因素很多，所以要合理設(shè)置異種核酸平行實(shí)驗(yàn)、核酸質(zhì)量、檢測(cè)對(duì)照、封閉對(duì)照、歸整化對(duì)照，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。4、信號(hào)檢測(cè)和分析 當(dāng)芯片雜交完畢之后,需要對(duì)信號(hào)進(jìn)行收集和分析。使用的標(biāo)記物不同,相應(yīng)的檢測(cè)方法也各異。常用的熒光標(biāo)記法使用激光共聚集熒光掃描儀進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。激光共聚焦掃描儀的激光光源可產(chǎn)生激發(fā)不同熒光染料的光，當(dāng)探針與待測(cè)核酸完全正常配對(duì)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度是具有單個(gè)或個(gè)錯(cuò)配堿基探針的535倍，而且熒光信號(hào)的強(qiáng)度還與樣品中靶分子的含量呈一定的線性關(guān)系。新發(fā)展的納米金標(biāo)記，通過銀放大后可直接用肉眼觀察，具有

5、非常好的靈敏度（超過熒光標(biāo)記法100倍）和特異性。基因芯片技術(shù)的應(yīng)用一、在食品中的應(yīng)用1、細(xì)菌檢測(cè) 細(xì)菌污染是食品最常見的污染，食品中病原性細(xì)菌檢測(cè)是食品衛(wèi)生安全檢測(cè)中一個(gè)重要的方面。Anthony等人建立了1個(gè)在4h以內(nèi)致病細(xì)菌的快速診斷方法。他們運(yùn)用該法158例經(jīng)血培養(yǎng)鑒定為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果符合率為 79.7%。Carl等在對(duì)4種細(xì)菌，即大腸埃希菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、空腸彎曲菌采用了基因芯片的檢測(cè)方法, 其檢測(cè)結(jié)果不僅敏感度高于傳統(tǒng)方法, 且操作簡(jiǎn)單, 重復(fù)性好, 并節(jié)省了大量時(shí)間, 大大提高了 4 種細(xì)菌診斷效率。2、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因食品的安全性現(xiàn)在還有很大的爭(zhēng)議，利

6、用基因芯片技術(shù)可以快捷準(zhǔn)確的檢測(cè)出樣品是否為轉(zhuǎn)基因食品。只需將目前通用的報(bào)告基因、抗性基因、啟動(dòng)子和終子的特異片斷制成檢測(cè)芯片與待測(cè)產(chǎn)品的 DNA進(jìn)行雜交, 就可以判斷待測(cè)樣品是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。該技術(shù)檢測(cè)的可靠性已被對(duì)大豆、玉米、油菜、棉花等農(nóng)作物樣品的檢測(cè)結(jié)果所證實(shí)。另外, 利用該技術(shù)也可以篩選轉(zhuǎn)基因所需要的目的基因。 3、對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)成分的檢測(cè) 傳統(tǒng)的檢測(cè)方法對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)是非常繁瑣的，更不用說對(duì)不同食品的類別和性質(zhì)進(jìn)行真?zhèn)舞b定了?；蛐酒夹g(shù)可用來研究食品的營(yíng)養(yǎng)成分,對(duì)食品的類別和性質(zhì)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定。Lyakhovich等應(yīng)用DNA芯片技術(shù)檢測(cè)1,25-二羥維生素D3處理過的乳腺

7、癌細(xì)胞的FGF-7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)無論在mRNA水平還是在蛋白水平都有明顯的增加，從而首次揭示了維生素D可能通過調(diào)節(jié)FGF-7的表達(dá)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。 二、在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用1、用于藥物作用新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn) 運(yùn)用基因芯片技術(shù)能夠比較正常組織細(xì)胞及病變組織細(xì)胞中大量(可達(dá)數(shù)千)基因的表達(dá)差異,從而發(fā)現(xiàn)一組疾病相關(guān)基因或致病新基因作為藥物篩選靶標(biāo)。 用于藥物作用新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn) Kumar Sinha等利用DNA芯片篩選發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌及其他癌細(xì)胞中，均檢測(cè)到脂肪酸合成酶(fatty acid synthesis, FAS)基因過度表達(dá)，酪氨酸激酶抑制劑抑制FAS基因表達(dá)可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。表明FAS基因

8、及其相應(yīng)的信號(hào)通路與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，可能被用來作為治療或藥物篩選的新靶標(biāo)。Mandel等利用基因芯片建立帕金森病的基因表達(dá)指紋(finger-prints)圖譜,發(fā)現(xiàn)了多種有利于抗帕金森病藥物研制和開發(fā)的潛在藥靶。 2、用于藥物有效成分的篩選 如何分離和鑒定藥物的有效成分是目前藥物開發(fā)遇到的重大障礙，基因芯片技術(shù)是解決這一障礙的有效手段。如在尋找HIV藥物中, Jellis用組合化學(xué)合成DNA芯片技術(shù)篩選65453種硫代磷酸八聚核苷酸，并從中確定了具有XXG4XX樣結(jié)構(gòu)的抑制物，實(shí)驗(yàn)表明，這種篩選物對(duì)HIV感染細(xì)胞有明顯阻斷作用。 三、在植物研究中的應(yīng)用1、基因表達(dá)水平的檢測(cè) 植物基因的表達(dá)

9、受遺傳、環(huán)境或生化信號(hào)的影響，并且具有時(shí)空特異性，組織器官的基因只在某個(gè)特定的情況下才會(huì)表達(dá)，表達(dá)量也有很大差異，形成不同的基因表達(dá)譜，基因表達(dá)譜能夠用來幫助理解植物體內(nèi)功能基因的不同表達(dá)情況，可以揭示基因的功能以及它們?cè)谥参锷砩x途徑中的作用。基因表達(dá)水平的檢測(cè) Schena等采用擬南芥基因組內(nèi)共45個(gè)基因的cDNA微陣列（其中14個(gè)為完全序列，31個(gè)為 EST），檢測(cè)該植物的根、葉組織內(nèi)這些基因的表達(dá)水平，用不同顏色的熒光素標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后分別與該微陣列雜交，經(jīng)激光共聚焦顯微掃描，發(fā)現(xiàn)該植物根和葉組織中存在26個(gè)基因的表達(dá)差異，而參與葉綠素合成的CAB1基因在葉組織較根組織表達(dá)高500倍。 2、基因多態(tài)性分析及突變性檢測(cè) 將基因芯片技術(shù)用于檢測(cè)分子突變，不僅可準(zhǔn)確地確定突變位點(diǎn)和突變類型，更主要的是它的快速高效是目前所用的其他方法無法比擬的。基因芯片可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因乃至整個(gè)基因組的突變，還可研究基因(組)的多態(tài)性，這將大大促進(jìn)植物育種科學(xué)的發(fā)展并促進(jìn)植物新品種的產(chǎn)生。研究突變性和多態(tài)性對(duì)檢測(cè)防治植物疾病，探究分子突變與環(huán)境的關(guān)系，促進(jìn)植物育種和植物新品種的產(chǎn)生等有積極意義 。小結(jié) 目前，基因芯片技術(shù)飛速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、基因診斷、藥物篩選、序列分析等諸多領(lǐng)域。而且而