第二章雞胚接種方法

1、公共衛(wèi)生學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院王德全王德全一、概況 1911年年Rous和和Murphy首先應(yīng)用雞胚培養(yǎng)首先應(yīng)用雞胚培養(yǎng)研究肉瘤病毒研究肉瘤病毒(Rous肉瘤肉瘤)的繁殖。的繁殖。 1938年年Goodpasture和和Burnet等應(yīng)用雞胚等應(yīng)用雞胚繁殖病毒、繁殖病毒、Cox應(yīng)用卵黃囊培養(yǎng)立克次氏體。應(yīng)用卵黃囊培養(yǎng)立克次氏體。近些年來(lái)由于組織培養(yǎng)技術(shù)和分近些年來(lái)由于組織培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，雞胚培養(yǎng)子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，雞胚培養(yǎng)技術(shù)在某些方面已被其他技術(shù)所技術(shù)在某些方面已被其他技術(shù)所取代，但是其在痘類(lèi)病毒、粘液取代，但是其在痘類(lèi)病毒、粘液病毒和皰疹病毒的分離、鑒定、病毒和皰疹病毒的分離、鑒

2、定、制備抗原、疫苗生產(chǎn)以及病毒性制備抗原、疫苗生產(chǎn)以及病毒性質(zhì)等方面的研究上仍然是很重要質(zhì)等方面的研究上仍然是很重要的。的。方法方法 應(yīng)應(yīng) 用用 價(jià)價(jià) 值值 存存 在在 問(wèn)問(wèn) 題題動(dòng)物動(dòng)物接種接種應(yīng)用最早；應(yīng)用最早；方法簡(jiǎn)便；方法簡(jiǎn)便；結(jié)果易于觀察結(jié)果易于觀察自身帶病毒；自身帶病毒；有的接種后不敏感；有的接種后不敏感；動(dòng)物飼養(yǎng)問(wèn)題動(dòng)物飼養(yǎng)問(wèn)題雞胚雞胚培養(yǎng)培養(yǎng)來(lái)源客觀，易于管理，帶來(lái)源客觀，易于管理，帶病毒機(jī)會(huì)少；多途徑接種病毒機(jī)會(huì)少；多途徑接種敏感病毒譜窄敏感病毒譜窄細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)應(yīng)用廣泛，敏感病毒譜廣應(yīng)用廣泛，敏感病毒譜廣設(shè)備技術(shù)要求條件高設(shè)備技術(shù)要求條件高病毒分離培養(yǎng)病毒分離培養(yǎng) 雞胚培

3、養(yǎng)法的雞胚培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1. 它的組織分化程度低，可選擇適當(dāng)途徑它的組織分化程度低，可選擇適當(dāng)途徑接種，病毒易復(fù)制，感染病毒的膜和液體接種，病毒易復(fù)制，感染病毒的膜和液體含大量病毒。含大量病毒。2. 是個(gè)整體，有神經(jīng)血管的分布及臟器的是個(gè)整體，有神經(jīng)血管的分布及臟器的構(gòu)造。構(gòu)造。3. 來(lái)源充足，操作簡(jiǎn)單，通常是無(wú)菌的，來(lái)源充足，操作簡(jiǎn)單，通常是無(wú)菌的，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體。對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體。 雞胚培養(yǎng)法的雞胚培養(yǎng)法的缺點(diǎn)缺點(diǎn)：1. 一般的病毒通常不使雞胚產(chǎn)生特異性的感染指一般的病毒通常不使雞胚產(chǎn)生特異性的感染指征。征。2. 卵黃中常常含有抗家禽病原體的母體抗體。卵黃中常常含有抗家禽

4、病原體的母體抗體。3. 某些細(xì)菌、衣原體和病毒能夠從感染的母雞傳某些細(xì)菌、衣原體和病毒能夠從感染的母雞傳遞到雞胚。遞到雞胚。4. 通常雞胚常常含有白血病病毒。通常雞胚常常含有白血病病毒。5. 在雞食物中加入抗菌素，母雞吃后會(huì)傳遞給雞在雞食物中加入抗菌素，母雞吃后會(huì)傳遞給雞胚，雞胚就會(huì)產(chǎn)生對(duì)立克次體和衣原體感染的抵胚，雞胚就會(huì)產(chǎn)生對(duì)立克次體和衣原體感染的抵抗?？埂６?、雞胚的結(jié)構(gòu)與生理 雞胚是由三個(gè)胚層發(fā)育起雞胚是由三個(gè)胚層發(fā)育起來(lái)的，即來(lái)的，即外胚層外胚層，中胚層中胚層和和內(nèi)內(nèi)胚層胚層，它們構(gòu)成胚胎的組織與，它們構(gòu)成胚胎的組織與器官。器官。 （約（約10日齡雞胚的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖）日齡雞胚的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖）氣

5、室雞胚卵黃囊尿囊腔羊膜腔絨毛尿囊膜卵白卵膜雞胚的管理雞胚的管理（一）雞胚的選擇（一）雞胚的選擇首選健康萊亨雞受精卵，其殼潔白易于觀首選健康萊亨雞受精卵，其殼潔白易于觀察胚胎，其他受精卵也可使用。接種病毒察胚胎，其他受精卵也可使用。接種病毒的受精雞卵應(yīng)未感染已知病毒或其它微生的受精雞卵應(yīng)未感染已知病毒或其它微生物（如新城疫病毒或支原體等），最好來(lái)物（如新城疫病毒或支原體等），最好來(lái)自無(wú)特定病原體（自無(wú)特定病原體（specified-pathogens free，SPF）雞群，接種立克次體的受精雞雞群，接種立克次體的受精雞卵應(yīng)來(lái)自未食用高濃度抗生素的雞群。卵應(yīng)來(lái)自未食用高濃度抗生素的雞群。 雞胚的

6、孵育雞胚的孵育受精雞卵孵育時(shí)不要擦洗，以免受細(xì)菌污染。最受精雞卵孵育時(shí)不要擦洗，以免受細(xì)菌污染。最好用能自動(dòng)調(diào)節(jié)溫度、濕度、氣流及翻卵的孵卵好用能自動(dòng)調(diào)節(jié)溫度、濕度、氣流及翻卵的孵卵箱孵育。如沒(méi)有，也可用普通恒溫箱，但要在溫箱孵育。如沒(méi)有，也可用普通恒溫箱，但要在溫箱中放一盛滿(mǎn)水的方盤(pán)，以保持適當(dāng)?shù)臐穸?。孵箱中放一盛滿(mǎn)水的方盤(pán)，以保持適當(dāng)?shù)臐穸?。孵育?yīng)在育應(yīng)在3739、40%70%的相對(duì)濕度下的相對(duì)濕度下進(jìn)行。濕度太高會(huì)使氣室發(fā)育過(guò)度，而濕度過(guò)低進(jìn)行。濕度太高會(huì)使氣室發(fā)育過(guò)度，而濕度過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致氣室發(fā)育不良，甚至造成雞胚死亡。通又會(huì)導(dǎo)致氣室發(fā)育不良，甚至造成雞胚死亡。通氣也很重要，如果空氣不流

7、通，也可造成雞胚死氣也很重要，如果空氣不流通，也可造成雞胚死亡。為了避免胚胎膜粘連和胚胎發(fā)育不均勻，應(yīng)亡。為了避免胚胎膜粘連和胚胎發(fā)育不均勻，應(yīng)每隔一段時(shí)間轉(zhuǎn)動(dòng)一次受精雞卵。每隔一段時(shí)間轉(zhuǎn)動(dòng)一次受精雞卵。檢卵檢卵在發(fā)育的早期，雞胚不易辨認(rèn)，要到在發(fā)育的早期，雞胚不易辨認(rèn)，要到45天天后才容易看見(jiàn)。因此，檢卵要在孵育后才容易看見(jiàn)。因此，檢卵要在孵育45天天后進(jìn)行?；畹碾u胚絨毛尿囊膜界線(xiàn)較明顯，后進(jìn)行。活的雞胚絨毛尿囊膜界線(xiàn)較明顯，上面的血管清晰可見(jiàn)、成網(wǎng)狀，可看到明顯上面的血管清晰可見(jiàn)、成網(wǎng)狀，可看到明顯的胚胎自主運(yùn)動(dòng)。如果胚胎活動(dòng)呆滯或不能的胚胎自主運(yùn)動(dòng)。如果胚胎活動(dòng)呆滯或不能自主運(yùn)動(dòng)，血管模

8、糊、變細(xì)、折斷脫落，絨自主運(yùn)動(dòng)，血管模糊、變細(xì)、折斷脫落，絨毛尿囊膜界線(xiàn)模糊，說(shuō)明雞胚已瀕臨死亡或毛尿囊膜界線(xiàn)模糊，說(shuō)明雞胚已瀕臨死亡或已經(jīng)死亡。已經(jīng)死亡。 接種前后都要檢卵。接種前接種前后都要檢卵。接種前檢卵是要了解雞胚的存活情況，檢卵是要了解雞胚的存活情況，標(biāo)記氣室邊界和胚胎位置；接種標(biāo)記氣室邊界和胚胎位置；接種后檢卵是為了觀察接種后胚胎的后檢卵是為了觀察接種后胚胎的狀況。狀況。 發(fā)育正常胚與異常胚的辯別1、正常胚 頭照可見(jiàn)眼點(diǎn)明顯，血管色鮮紅，呈放射狀；二照可見(jiàn)整個(gè)蛋除氣室外均布滿(mǎn)鮮紅血管（合攏）三照時(shí)蛋的小頭看不到發(fā)亮部分（封門(mén)），氣室界線(xiàn)邊緣血管鮮紅。2、弱胚蛋 頭照胚體小，呈低階段

9、纖細(xì)血管，眼點(diǎn)不明顯；二照可見(jiàn)小頭有0.5cm2以上區(qū)域無(wú)血管分布；三照時(shí)小頭發(fā)亮，氣室界線(xiàn)邊緣的血管面較大。3、死胚蛋 頭照可見(jiàn)血點(diǎn)、血線(xiàn)或血環(huán)緊貼內(nèi)殼面，血管色因氧化而比活胚深，有時(shí)散黃或有灰白色凝塊；中期死胚特征是氣室界線(xiàn)模糊，胚胎呈黑團(tuán)狀，常與殼粘連，不動(dòng)，當(dāng)手搖胚蛋時(shí)，胚胎隨之轉(zhuǎn)動(dòng)，停止搖晃時(shí)也隨之停止。而活胚時(shí)刻在活動(dòng)；三照死胚的小頭發(fā)亮，血管色深，氣室界線(xiàn)模糊，蛋體發(fā)涼；對(duì)尚未出殼的也可用溫水來(lái)判斷將蛋放入40C溫水中，凡是在水中輕微晃動(dòng)的為活胚，反之則為死胚。 三、材料（一）受精雞卵（一）受精雞卵（二）孵卵箱或恒溫箱（二）孵卵箱或恒溫箱（三）撿卵燈，照卵燈（三）撿卵燈，照卵燈（

10、四）砂輪、三棱針（四）砂輪、三棱針（五）卵盤(pán)、卵杯（五）卵盤(pán)、卵杯（六）其它：（六）其它：1 1mlml注射器，針頭，注射器，針頭，2.5%2.5%碘酒，碘酒，75%75%酒精，鑷子，無(wú)菌生理鹽水，毛細(xì)吸管，酒精，鑷子，無(wú)菌生理鹽水，毛細(xì)吸管，橡膠吸頭，液體石蠟，蠟和膠布等。橡膠吸頭，液體石蠟，蠟和膠布等。四、接種技術(shù)（一）活胚檢查（一）活胚檢查 1.血管血管：活胚可見(jiàn)清晰的血管，有時(shí)可見(jiàn)血管搏動(dòng)，死胚血管模糊成淤血帶或淤血塊。 2.胎動(dòng)胎動(dòng)：活胚可見(jiàn)明顯的自然運(yùn)動(dòng)，尤其在轉(zhuǎn)動(dòng)胚胎時(shí)，死胚見(jiàn)不到任何胎動(dòng)，胚胎發(fā)紅像出血樣，有的呈現(xiàn)黑塊。 3.血管網(wǎng)是否豐滿(mǎn)血管網(wǎng)是否豐滿(mǎn)：發(fā)育好的雞胚可見(jiàn)密布豐

11、滿(mǎn)的血管網(wǎng)，也就是絨毛尿囊膜，死胚則見(jiàn)不到這一現(xiàn)象。第一天胚盤(pán)直徑0.7cm，胚重0.2mg，在胚盤(pán)明區(qū)形成原條，其前方為原結(jié)，原結(jié)前端為頭突，頭突發(fā)育形成脊索神經(jīng)管，中胚層的細(xì)胞沿著經(jīng)管兩側(cè)，形成左右對(duì)稱(chēng)的呈方形薄片的體節(jié)4-5對(duì)，中胚層進(jìn)入暗區(qū)在胚部的邊緣出現(xiàn)許多紅點(diǎn)，俗稱(chēng)血島；第二天胚盤(pán)直徑1.0cm，胚重3mg，卵黃囊羊膜絨毛膜開(kāi)始形成，胚胎頭部開(kāi)始從胚盤(pán)分離出來(lái)，血島合并形成血管，入孵25小時(shí)心臟開(kāi)始形成，30-42小時(shí)后心臟開(kāi)始跳運(yùn)，可見(jiàn)到20-27對(duì)體節(jié)，照蛋時(shí)可見(jiàn)卵黃囊血管區(qū)，形似櫻桃，俗稱(chēng)櫻桃珠第三天胚長(zhǎng)0.55cm，胚重20mg，尿囊開(kāi)始長(zhǎng)出，胚的位置與蛋的長(zhǎng)軸垂直，開(kāi)始形

12、成前后肢芽，出現(xiàn)5個(gè)腦胞的原基，眼的色素開(kāi)始沉著，有35對(duì)體節(jié)，照蛋時(shí)，可見(jiàn)胚和伸展的卵黃囊血管形似蚊子，俗稱(chēng)“蚊蟲(chóng)珠”；第4天胚長(zhǎng)0.77cm，胚重50mg，孵黃囊血管包圍蛋黃達(dá)1/3，肉眼明顯看到尿囊，羊膜腔形成，胚和蛋黃分離，由于中腦迅速生長(zhǎng)，胚胎頭部明顯增大，舌開(kāi)始形成，照蛋時(shí)蛋黃不容易轉(zhuǎn)動(dòng)，胚與卵黃囊血管形似蜘蛛，俗稱(chēng)小蜘蛛；第5天胚長(zhǎng)1.0cm，胚重0.13g，生殖腺已性分化，組織學(xué)上可確定胚的公母，胚極度彎曲，整個(gè)胚胎成“C”形，可見(jiàn)指（趾）原基，眼的黑色素大量沉著，照蛋時(shí)可明顯看到黑色的眼點(diǎn)，俗稱(chēng)單珠或黑眼；第6天胚長(zhǎng)1.38cm，胚重0.29g，尿囊已達(dá)蛋殼膜內(nèi)表面，卵黃囊分

13、布在蛋黃表面的1/2以上，由于羊膜壁上的平滑肌收縮，胚胎有規(guī)律運(yùn)動(dòng)，蛋黃由于蛋白水分的滲入而達(dá)到最大重量，由約占蛋重的30.01%增至65.48%，喙原基出現(xiàn)，軀干部增長(zhǎng)，翅腳已可區(qū)分，照蛋時(shí)，可見(jiàn)頭部和增大的軀干部?jī)蓚€(gè)小圓團(tuán)，俗稱(chēng)雙珠；第7天胚長(zhǎng)1.42cm， 0.57g，尿囊液急劇增加，上喙前端出現(xiàn)小白點(diǎn)形的破殼器（卵齒），口腔鼻孔肌胃形成，胚胎已顯示鳥(niǎo)類(lèi)特征，胚胎自身有體溫，照蛋時(shí)胚在羊水中不容易看清，半個(gè)蛋表面布滿(mǎn)血管；第8天胚長(zhǎng)1.5cm，胚重1.15g，肋骨肺胃明顯可辨，頸背四肢出現(xiàn)羽毛，乳頭突起，右側(cè)卵巢開(kāi)始退化，照蛋時(shí)胚在羊水中浮游，背面兩邊蛋黃不易晃動(dòng)，俗稱(chēng)邊口發(fā)硬；第9天胚

14、 長(zhǎng) 2 c m ， 胚 重1.53g，喙開(kāi)始角質(zhì)化，軟骨開(kāi)始骨化，眼瞼已達(dá)虹膜，解剖時(shí)心肝胃腎腸已發(fā)育良好，尿囊?guī)缀醢鼑麄€(gè)胚胎，照蛋時(shí)可見(jiàn)卵黃兩邊易晃動(dòng)，尿囊血管伸展越過(guò)卵黃囊，俗稱(chēng)竄筋；第10天胚長(zhǎng)2.1cm，胚重2.26g，尿囊血管到達(dá)蛋的小頭，整個(gè)背頸、大腿部都覆蓋有羽毛，乳頭突起、龍骨突形成，照蛋時(shí)可見(jiàn)尿囊血管在蛋的小頭合攏，除氣室外，整個(gè)蛋布滿(mǎn)血管，俗稱(chēng)合攏；第11天胚長(zhǎng)2.54cm，胚重3.68g，背部出現(xiàn)絨毛，腺胃明顯可辯，冠鋸齒狀，尿囊液達(dá)最大量，照蛋時(shí)血管加粗，色加深；第12天胚長(zhǎng)3.57cm，胚重5.07g，身軀覆蓋絨毛，腎腸開(kāi)始有功能，開(kāi)始用喙吞食蛋白第13天胚長(zhǎng)4.

15、34cm，胚重7.37g，頭部和身體大部分覆蓋絨毛，脛趾出現(xiàn)角質(zhì)鱗片原基，蛋白通過(guò)漿羊膜道迅速進(jìn)入羊膜腔，眼瞼達(dá)瞳孔，照蛋時(shí)蛋小頭發(fā)亮部分隨胚齡增加而逐漸減少第14天胚長(zhǎng)4.7cm，胚重9.74g，胚胎全身覆蓋絨毛，頭向氣室，胚胎開(kāi)始改變?yōu)闄M著的位置，逐漸與蛋長(zhǎng)橫平行（二）接種途徑（二）接種途徑1.尿囊腔接種尿囊腔接種：該途徑一般用于流感、新城雞瘟病毒和腮腺炎的適應(yīng)和傳代。2.羊膜腔接種羊膜腔接種：這途徑主要用于臨床材料（如患者的鼻洗液及咽漱液）分離病毒。3.卵黃囊接種卵黃囊接種：該接種途徑主要用于抗流感病毒藥物實(shí)驗(yàn)。4.絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜殼塊培養(yǎng)法殼塊培養(yǎng)法：該法可用于流感病毒滴定、中和試

16、驗(yàn)和藥物實(shí)驗(yàn)。1.尿囊腔接種尿囊腔接種尿囊腔接種常用于流感病毒、新城疫尿囊腔接種常用于流感病毒、新城疫病毒和腮腺炎病毒的適應(yīng)和傳代。進(jìn)病毒和腮腺炎病毒的適應(yīng)和傳代。進(jìn)入尿囊腔的這些病毒，能夠在尿囊的入尿囊腔的這些病毒，能夠在尿囊的內(nèi)胚層細(xì)胞中大量繁殖，隨后釋放到內(nèi)胚層細(xì)胞中大量繁殖，隨后釋放到尿囊液中。由于這一接種途徑可獲得尿囊液中。由于這一接種途徑可獲得大量的病毒，也常被用于大量制備抗大量的病毒，也常被用于大量制備抗原、疫苗等。原、疫苗等。接種方法：接種方法：選選9 91111日齡雞胚照檢后，日齡雞胚照檢后，標(biāo)出氣室邊界標(biāo)出氣室邊界和胚胎位置。在胚胎面氣室上方靠近邊界和胚胎位置。在胚胎面氣室

17、上方靠近邊界23mm處，避開(kāi)血管作一標(biāo)記，用碘酒處，避開(kāi)血管作一標(biāo)記，用碘酒消毒標(biāo)記處的卵殼，在標(biāo)記處鉆一孔，再消毒標(biāo)記處的卵殼，在標(biāo)記處鉆一孔，再次用碘酒消毒鉆孔區(qū)，將注射器針頭經(jīng)孔次用碘酒消毒鉆孔區(qū)，將注射器針頭經(jīng)孔刺入尿囊腔，注入刺入尿囊腔，注入0.10.10.20.2mlml接種物，將接種物，將蠟熔化封孔，蠟熔化封孔，33333535孵育孵育48487272小時(shí)。小時(shí)。每日照檢，每日照檢，2424小時(shí)內(nèi)死亡的應(yīng)棄去。小時(shí)內(nèi)死亡的應(yīng)棄去。收獲：收獲： 收獲前先將雞卵置收獲前先將雞卵置4冷凍冷凍618小時(shí)，小時(shí)，如急于收獲也可如急于收獲也可將雞胚將雞胚置置-20-20、1 1小時(shí)左小時(shí)左右

18、。冷凍后的雞卵鈍端向上置于卵杯上，右。冷凍后的雞卵鈍端向上置于卵杯上，將氣室上方卵殼用碘酒或?qū)馐疑戏铰褮び玫饩苹?0%70%的酒精消毒的酒精消毒后去除，暴露殼膜，用無(wú)菌鑷子小心地將后去除，暴露殼膜，用無(wú)菌鑷子小心地將殼膜從絨毛尿囊膜上撕下，不要損傷絨毛殼膜從絨毛尿囊膜上撕下，不要損傷絨毛尿囊膜。用注射器或吸管經(jīng)絨毛尿囊膜刺尿囊膜。用注射器或吸管經(jīng)絨毛尿囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液，置低溫保存。同入尿囊腔，吸出尿囊液，置低溫保存。同時(shí)做無(wú)菌培養(yǎng)。時(shí)做無(wú)菌培養(yǎng)。2.羊膜腔接種羊膜腔接種 羊膜腔接種主要用于從臨床或現(xiàn)場(chǎng)材料羊膜腔接種主要用于從臨床或現(xiàn)場(chǎng)材料（如患者咽漱液等）中分離病毒。接種到（如患者

19、咽漱液等）中分離病毒。接種到羊膜腔中的接種物能夠被胚胎吞咽和進(jìn)入羊膜腔中的接種物能夠被胚胎吞咽和進(jìn)入呼吸管，可遍及各種組織和細(xì)胞，使具有呼吸管，可遍及各種組織和細(xì)胞，使具有特定細(xì)胞親嗜性的病毒被充分利用，從而特定細(xì)胞親嗜性的病毒被充分利用，從而提高病毒繁殖的可能性。由于可收獲的羊提高病毒繁殖的可能性。由于可收獲的羊膜組織或羊水較少，為了使病毒適應(yīng)在尿膜組織或羊水較少，為了使病毒適應(yīng)在尿囊內(nèi)胚層生長(zhǎng)，從而獲得大量的病毒，可囊內(nèi)胚層生長(zhǎng)，從而獲得大量的病毒，可將經(jīng)羊膜腔接種分離到的病毒再經(jīng)尿囊腔將經(jīng)羊膜腔接種分離到的病毒再經(jīng)尿囊腔傳代。傳代。接種方法：接種方法： 選選1012日齡雞胚檢卵后，標(biāo)出氣

20、室邊界和胚胎日齡雞胚檢卵后，標(biāo)出氣室邊界和胚胎位置。用碘酒消毒雞卵鈍端（氣室上方）的蛋殼，在位置。用碘酒消毒雞卵鈍端（氣室上方）的蛋殼，在氣室上方靠近胚胎側(cè)的卵殼上鉆一孔，鉆孔區(qū)再次用氣室上方靠近胚胎側(cè)的卵殼上鉆一孔，鉆孔區(qū)再次用碘酒消毒。用無(wú)菌眼科小剪子沿鉆孔周?chē)羧ド僭S，碘酒消毒。用無(wú)菌眼科小剪子沿鉆孔周?chē)羧ド僭S，開(kāi)一小窗，勿損傷內(nèi)層殼膜，經(jīng)小窗向氣室內(nèi)滴入一開(kāi)一小窗，勿損傷內(nèi)層殼膜，經(jīng)小窗向氣室內(nèi)滴入一滴無(wú)菌液體石蠟。將卵置照卵燈上，可清楚地看到胚滴無(wú)菌液體石蠟。將卵置照卵燈上，可清楚地看到胚胎的位置。將注射器瞄準(zhǔn)胚胎的腭下胸前，刺入后注胎的位置。將注射器瞄準(zhǔn)胚胎的腭下胸前，刺入后注入

21、入0.10.2ml接種物。用沾有碘酒通過(guò)火焰的小塊膠接種物。用沾有碘酒通過(guò)火焰的小塊膠布將窗口封上。接種后的受精卵根據(jù)接種的病毒在布將窗口封上。接種后的受精卵根據(jù)接種的病毒在33、35或或37的條件下孵育的條件下孵育4872小時(shí)。小時(shí)。收獲：收獲： 收獲前先將雞卵置收獲前先將雞卵置4冷凍冷凍618小時(shí)，小時(shí)，時(shí)間時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起散黃。冷凍后的雞卵鈍不能過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起散黃。冷凍后的雞卵鈍端向上置于卵杯上，將氣室上方卵殼用碘酒或端向上置于卵杯上，將氣室上方卵殼用碘酒或75%75%的酒精消毒后去除，暴露殼膜，用無(wú)菌鑷子的酒精消毒后去除，暴露殼膜，用無(wú)菌鑷子小心地去除殼膜，使其與絨毛尿囊膜分

22、開(kāi)，不小心地去除殼膜，使其與絨毛尿囊膜分開(kāi)，不要損傷絨毛尿囊膜。用注射器或吸管經(jīng)絨毛尿要損傷絨毛尿囊膜。用注射器或吸管經(jīng)絨毛尿囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液。然后，一只手囊膜刺入尿囊腔，吸出尿囊液。然后，一只手持鑷子將羊膜輕輕提起，另一只手持注射器或持鑷子將羊膜輕輕提起，另一只手持注射器或吸管刺入羊膜腔吸取羊水，置低溫保存。同時(shí)吸管刺入羊膜腔吸取羊水，置低溫保存。同時(shí)做無(wú)菌培養(yǎng)。做無(wú)菌培養(yǎng)。3.絨毛尿囊膜接種絨毛尿囊膜接種絨毛尿囊膜接種常常用于分離和繁殖在絨毛絨毛尿囊膜接種常常用于分離和繁殖在絨毛尿囊膜上產(chǎn)生斑和痘的病毒，如牛痘、天花、尿囊膜上產(chǎn)生斑和痘的病毒，如牛痘、天花、單純皰疹和鳥(niǎo)痘病毒?？?/p>

23、在絨毛尿囊膜上滴單純皰疹和鳥(niǎo)痘病毒。可在絨毛尿囊膜上滴定這些病毒，因?yàn)楦腥拘圆《绢w粒的量可以定這些病毒，因?yàn)楦腥拘圆《绢w粒的量可以通過(guò)產(chǎn)生的斑和痘的數(shù)目來(lái)計(jì)算。還可用于通過(guò)產(chǎn)生的斑和痘的數(shù)目來(lái)計(jì)算。還可用于抗體滴定試驗(yàn)，因?yàn)榘吆投坏膫€(gè)數(shù)減少的程抗體滴定試驗(yàn)，因?yàn)榘吆投坏膫€(gè)數(shù)減少的程度與抗體濃度有關(guān)。度與抗體濃度有關(guān)。定位：定位：將胎盤(pán)部分將胎盤(pán)部分及自然氣室部分用鉛及自然氣室部分用鉛筆畫(huà)出，在胎盤(pán)與蛋筆畫(huà)出，在胎盤(pán)與蛋白交界處（無(wú)血管區(qū)）白交界處（無(wú)血管區(qū)）畫(huà)一直徑約畫(huà)一直徑約1cm的等的等邊三角形。邊三角形。卵窗 氣室雞胚卵黃囊尿囊腔羊膜腔絨毛尿囊膜卵白卵膜取卵殼：取卵殼：消毒后取下所畫(huà)三角

24、形區(qū)域的消毒后取下所畫(huà)三角形區(qū)域的卵殼，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺卵殼，注意卵膜不要碰破，于卵膜中央刺一小口（不要傷及絨毛尿囊膜），一小口（不要傷及絨毛尿囊膜），造人工氣室造人工氣室：在自然氣室部分用大注射：在自然氣室部分用大注射器針頭鉆一孔，用橡皮頭自氣室端小孔將器針頭鉆一孔，用橡皮頭自氣室端小孔將氣室中空氣吸出，使絨毛尿囊膜下陷形成氣室中空氣吸出，使絨毛尿囊膜下陷形成一一“人工氣室人工氣室”n接種：接種：去除卵膜，于絨毛尿囊膜上去除卵膜，于絨毛尿囊膜上滴上病毒滴上病毒0.10.2ml。n封口：封口：用膠布封口，膠布事先用碘用膠布封口，膠布事先用碘酒消毒，并通過(guò)火焰燒去余碘。酒消毒，并通

25、過(guò)火焰燒去余碘。n培養(yǎng)：培養(yǎng)：放入溫箱培育放入溫箱培育4天，然后收天，然后收獲病毒。獲病毒。收獲：收獲：收獲前檢卵，看人工氣室是否仍然存在，收獲前檢卵，看人工氣室是否仍然存在，如果不存在，輕輕地吸氣室上的孔。用如果不存在，輕輕地吸氣室上的孔。用碘酒消毒人工氣室上的卵殼，去掉殼和碘酒消毒人工氣室上的卵殼，去掉殼和殼膜至人工氣室的邊緣，盡量最大范圍殼膜至人工氣室的邊緣，盡量最大范圍地暴露地暴露絨毛尿囊膜，用無(wú)菌剪子沿人工絨毛尿囊膜，用無(wú)菌剪子沿人工氣室的邊緣將接種病毒的絨毛尿囊膜剪氣室的邊緣將接種病毒的絨毛尿囊膜剪下，低溫保存。同時(shí)做無(wú)菌培養(yǎng)。下，低溫保存。同時(shí)做無(wú)菌培養(yǎng)。4.卵黃囊接種卵黃囊接種

26、 卵黃囊接種常用于分離和繁殖卵黃囊接種常用于分離和繁殖立克次體，也可用于分離和傳代衣立克次體，也可用于分離和傳代衣原體。這些大的病原微生物易于在原體。這些大的病原微生物易于在沿卵黃排列的內(nèi)胚層細(xì)胞中生長(zhǎng)。沿卵黃排列的內(nèi)胚層細(xì)胞中生長(zhǎng)。 接種方法：接種方法： 選用選用5 56 6日齡雞胚，因?yàn)槁腰S囊在這個(gè)階日齡雞胚，因?yàn)槁腰S囊在這個(gè)階段比較大，易于接種，并為病毒的繁殖提供段比較大，易于接種，并為病毒的繁殖提供了一個(gè)比較大的表面。檢卵后，用碘酒消毒了一個(gè)比較大的表面。檢卵后，用碘酒消毒氣室端卵殼，在氣室中心的卵殼上鉆一孔，氣室端卵殼，在氣室中心的卵殼上鉆一孔，再次用碘酒消毒鉆孔處，將注射器的針頭經(jīng)

27、再次用碘酒消毒鉆孔處，將注射器的針頭經(jīng)鉆孔沿卵的縱軸刺入鉆孔沿卵的縱軸刺入3 3cmcm左右，進(jìn)入卵黃囊中，左右，進(jìn)入卵黃囊中，通常注入通常注入0.50.51 1mlml接種物。用蠟熔化封口，接種物。用蠟熔化封口，35353737孵育孵育3 38 8天，視接種的病毒或立天，視接種的病毒或立克次體而定。克次體而定。圖5-5 卵黃囊接種示意圖收獲：收獲： 先將雞胚冷凍，去除氣室上方卵殼，先將雞胚冷凍，去除氣室上方卵殼，用無(wú)菌鑷子揭去殼膜，撕開(kāi)用無(wú)菌鑷子揭去殼膜，撕開(kāi)絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜后，將雞胚內(nèi)容物倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，后，將雞胚內(nèi)容物倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，注意要避免內(nèi)容物沿卵殼流下而發(fā)生污注意要避免內(nèi)

28、容物沿卵殼流下而發(fā)生污染。將雞胚從卵黃囊上剪下，如收獲雞染。將雞胚從卵黃囊上剪下，如收獲雞胚，則去雙眼、爪和嘴，置無(wú)菌瓶中低胚，則去雙眼、爪和嘴，置無(wú)菌瓶中低溫保存。倒出卵黃囊中的卵黃，用生理溫保存。倒出卵黃囊中的卵黃，用生理鹽水將卵黃囊洗凈，置無(wú)菌培養(yǎng)皿或燒鹽水將卵黃囊洗凈，置無(wú)菌培養(yǎng)皿或燒瓶中低溫保存。并取一塊做無(wú)菌試驗(yàn)。瓶中低溫保存。并取一塊做無(wú)菌試驗(yàn)。注意事項(xiàng) 雞胚為一活的有機(jī)體，因此要嚴(yán)格無(wú)菌操作，同時(shí)動(dòng)作要仔細(xì)，以免造成物理死亡。接種后24小時(shí)內(nèi)死亡應(yīng)不計(jì)結(jié)果。收獲物的檢測(cè)收獲物的檢測(cè)（一）無(wú)菌試驗(yàn)（一）無(wú)菌試驗(yàn)雞胚培養(yǎng)所收獲的材料應(yīng)當(dāng)未受細(xì)菌污染。檢查雞胚培養(yǎng)所收獲的材料應(yīng)當(dāng)未受

29、細(xì)菌污染。檢查收獲物是否受到細(xì)菌污染，可在收獲時(shí)取一小塊收獲物是否受到細(xì)菌污染，可在收獲時(shí)取一小塊組織或?qū)⒌谝坏我后w（如尿囊液）放入盛有組織或?qū)⒌谝坏我后w（如尿囊液）放入盛有2 23 3mlml無(wú)菌肉湯的小試管中，無(wú)菌肉湯的小試管中，3737培養(yǎng)培養(yǎng)3636小時(shí)。如小時(shí)。如肉湯依舊清亮透明，無(wú)菌落出現(xiàn)，說(shuō)明沒(méi)有污染；肉湯依舊清亮透明，無(wú)菌落出現(xiàn)，說(shuō)明沒(méi)有污染；如肉湯變混濁，有絮狀菌落出現(xiàn)，說(shuō)明受到細(xì)菌如肉湯變混濁，有絮狀菌落出現(xiàn)，說(shuō)明受到細(xì)菌污染。被細(xì)菌污染的收獲物應(yīng)滅菌后棄掉。污染。被細(xì)菌污染的收獲物應(yīng)滅菌后棄掉。病毒檢測(cè)檢測(cè)雞胚培養(yǎng)的收獲物中是否有病毒存在，有直接觀察法和試驗(yàn)法兩種方法。1

30、、直接觀察法有些病毒在雞胚中繁殖，可對(duì)雞胚產(chǎn)生眼睛可見(jiàn)的直接損害，可通過(guò)直接觀察法確認(rèn)病毒的存在。 這些損害有：這些損害有：（1 1）在絨毛尿囊膜上形成特殊的增生性損）在絨毛尿囊膜上形成特殊的增生性損害或痘皰，如各種痘類(lèi)病毒和皰疹病毒，害或痘皰，如各種痘類(lèi)病毒和皰疹病毒，常產(chǎn)生白色或灰色痘皰，并常伴有膜上血常產(chǎn)生白色或灰色痘皰，并常伴有膜上血管充血，偶可見(jiàn)出血；管充血，偶可見(jiàn)出血；（2 2）引起雞胚死亡，如新城疫病毒、流行）引起雞胚死亡，如新城疫病毒、流行性乙型腦炎病毒，但應(yīng)與接種損傷和細(xì)菌性乙型腦炎病毒，但應(yīng)與接種損傷和細(xì)菌污染引起的死亡區(qū)別開(kāi)；污染引起的死亡區(qū)別開(kāi)；（3 3）造成雞胚特殊損

31、害和胚胎生長(zhǎng)遲緩）造成雞胚特殊損害和胚胎生長(zhǎng)遲緩2、試驗(yàn)法、試驗(yàn)法 有些病毒在雞胚中繁殖并不造成可見(jiàn)有些病毒在雞胚中繁殖并不造成可見(jiàn)損害，直接觀察無(wú)法確認(rèn)病毒的存在，損害，直接觀察無(wú)法確認(rèn)病毒的存在，必須用試驗(yàn)加以證實(shí)。有些病毒能引起必須用試驗(yàn)加以證實(shí)。有些病毒能引起紅細(xì)胞凝集，可對(duì)羊水或尿囊液進(jìn)行血紅細(xì)胞凝集，可對(duì)羊水或尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)證明病毒的存在，如流感病毒、凝試驗(yàn)證明病毒的存在，如流感病毒、新城疫病毒和流行性腮腺炎病毒等。還新城疫病毒和流行性腮腺炎病毒等。還可以用特異性免疫血清與收獲的液體或可以用特異性免疫血清與收獲的液體或組織做補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)來(lái)證明病毒的存在。組織做補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)來(lái)證明

32、病毒的存在。 第五節(jié) 雞胚接種技術(shù)的應(yīng)用一、人類(lèi)與動(dòng)物病毒的培養(yǎng)、 分離與鑒定1流感病毒的分離和鑒定 病人須采集發(fā)病初期（一般為前3天）鼻咽洗液或含漱液，加青、鏈霉素殺菌后，接種于雞胚羊膜腔內(nèi)及尿囊腔中，35孵育24 d后，取羊水、尿囊液做血凝試驗(yàn)，檢查有無(wú)病毒增殖。若試驗(yàn)為陰性，需在雞胚中盲目傳代三次后再試驗(yàn)。若血凝試驗(yàn)為陽(yáng)性，可用已知流感病毒各型特異性抗體與新分離病毒進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)鑒定型別。 2禽流感病毒的分離和鑒定 由于所有的禽流感病毒毒株都能在雞胚中增殖，所以用其進(jìn)行分離培養(yǎng)AIV及其它研究最為常見(jiàn)。3其他病毒的分離和鑒定 介紹一些病毒在雞胚中的繁殖情況。 病 毒胚齡（日）適宜接種途

33、徑 孵育 孵育 收獲 時(shí)間 溫度 （）表現(xiàn) 材料流行性感冒912尿囊腔、羊膜腔3648h 3335 血凝尿囊液、羊水水痘 1013絨毛尿囊膜35d37痘皰絨毛尿囊膜牛痘 1012絨毛尿囊膜23 d37 死亡、痘皰 絨毛尿囊膜天花 1012 絨毛尿囊膜3 d37 死亡、痘皰絨毛尿囊膜流行性腮腺炎 912尿囊腔、羊膜腔57 d35血凝尿囊液、羊水流行性乙腦 68卵黃囊 3 d37 死亡 絨毛尿囊膜新城疫911絨毛尿囊、羊膜腔4 d32 死亡、血凝 絨毛尿囊膜 二、疫苗的研制流感疫苗是將流感病毒接種到雞胚里，大量繁殖后經(jīng)減毒或殺滅以后制成的，其有減毒活疫苗和滅活疫苗兩種?；钜呙缡怯没畹牧鞲胁《窘?jīng)減毒

34、處理以后制成的疫苗，滅活疫苗是把大量流感病毒殺滅后制成的。病毒的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（病毒的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HAHA）血凝素（血凝素（hemagglutinin HA）：）：由由病毒基因編碼的糖蛋白刺突。與病毒病毒基因編碼的糖蛋白刺突。與病毒吸附和傳入宿主細(xì)胞有關(guān)。吸附和傳入宿主細(xì)胞有關(guān)。HA能與人能與人或其它動(dòng)物多種紅細(xì)胞表面或其它動(dòng)物多種紅細(xì)胞表面N乙酰神乙酰神經(jīng)氨酸酶受體結(jié)合引起紅細(xì)胞凝集。經(jīng)氨酸酶受體結(jié)合引起紅細(xì)胞凝集。virusNo virus 一、一、 概念概念病毒的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象：病毒的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象： 許多病毒表面有血凝素，能許多病毒表面有血凝素，能與各種動(dòng)物的紅細(xì)胞表面受體結(jié)與各種

35、動(dòng)物的紅細(xì)胞表面受體結(jié)合，而出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，簡(jiǎn)合，而出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，簡(jiǎn)稱(chēng)為病毒的血凝現(xiàn)象。稱(chēng)為病毒的血凝現(xiàn)象。二、應(yīng)用二、應(yīng)用當(dāng)動(dòng)物感染某病毒而發(fā)病時(shí)，當(dāng)動(dòng)物感染某病毒而發(fā)病時(shí)，可在機(jī)體的相應(yīng)器官查出病毒?？稍跈C(jī)體的相應(yīng)器官查出病毒。病毒進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，將發(fā)生病毒進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體，將發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，即產(chǎn)生免疫特異性免疫反應(yīng)，即產(chǎn)生免疫物質(zhì)物質(zhì)抗體，而抗體抗體，而抗體90%90%都都存在于動(dòng)物的血清中。存在于動(dòng)物的血清中。病毒相當(dāng)于免疫效應(yīng)物質(zhì)中病毒相當(dāng)于免疫效應(yīng)物質(zhì)中的抗原。的抗原。抗原和抗體發(fā)生特異性結(jié)合抗原和抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。反應(yīng)。當(dāng)以被檢動(dòng)物的某一器官為當(dāng)以被檢動(dòng)物的某一器官

36、為病料，進(jìn)行病料，進(jìn)行HAHA試驗(yàn)，結(jié)果為陽(yáng)試驗(yàn)，結(jié)果為陽(yáng)性者，證明該被檢材料中有能性者，證明該被檢材料中有能凝集紅細(xì)胞的某種病毒。凝集紅細(xì)胞的某種病毒。凝集價(jià)的測(cè)定：將被檢病毒凝集價(jià)的測(cè)定：將被檢病毒材料，稀釋成不同的稀釋倍材料，稀釋成不同的稀釋倍數(shù)，進(jìn)行數(shù)，進(jìn)行HAHA試驗(yàn)，出現(xiàn)血凝試驗(yàn)，出現(xiàn)血凝現(xiàn)象的各稀釋孔中，能出現(xiàn)現(xiàn)象的各稀釋孔中，能出現(xiàn)病毒的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的病病毒的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的病毒的最大稀釋倍數(shù)者即定為毒的最大稀釋倍數(shù)者即定為凝集價(jià)。凝集價(jià)。 凝集價(jià)稀釋倍數(shù)中所含病毒凝集價(jià)稀釋倍數(shù)中所含病毒數(shù)叫一個(gè)病毒的凝集單位。數(shù)叫一個(gè)病毒的凝集單位。在病毒的紅細(xì)胞凝集抑制試在病毒的紅細(xì)胞凝

37、集抑制試驗(yàn)（驗(yàn)（HIHI試驗(yàn)）中，確定病毒試驗(yàn)）中，確定病毒的稀釋倍數(shù)，應(yīng)按含有的稀釋倍數(shù)，應(yīng)按含有4 4個(gè)病個(gè)病毒凝集單位為標(biāo)準(zhǔn)。毒凝集單位為標(biāo)準(zhǔn)。 三、實(shí)驗(yàn)材料： 96孔V型微量反應(yīng)板、微量振蕩器、病毒材料、紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、微量吸液器、注射器、抗凝劑、離心機(jī)、恒溫箱等。 四、方法與步驟：制備雞紅細(xì)胞懸液：用注射器抽取抗凝劑。2.2.用上述注射器，采用無(wú)菌法用上述注射器，采用無(wú)菌法抽取健康的未免疫雞的靜脈抽取健康的未免疫雞的靜脈血，與抗凝劑等量。血，與抗凝劑等量。3.3.混勻，加生理鹽水適量，洗混勻，加生理鹽水適量，洗滌離心，共離心三次（第一、滌離心，共離心三次（第一、二次二次2000

38、2000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分分5 5分鐘、第三分鐘、第三次次30003000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分分 8 8分鐘）洗去血分鐘）洗去血清及白細(xì)胞。清及白細(xì)胞。所余的純紅細(xì)胞，用生理鹽所余的純紅細(xì)胞，用生理鹽水稀釋水稀釋100100倍，即成倍，即成1%1%的雞紅的雞紅細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液。 （二）按下表順序加樣二）按下表順序加樣 棄去棄去.025試管號(hào)試管號(hào) 123.10對(duì)照對(duì)照 對(duì)照對(duì)照 生生 理鹽水理鹽水 0.025 0.025 0.025 .0.025 0.025 0.025 病病 毒毒 0.025 0.025 0.025 .0.025 0.025 0.0 紅細(xì)胞紅細(xì)胞 0.025 0.025 0.025 .0

39、.025 0.00.025 病毒稀釋病毒稀釋倍數(shù)倍數(shù) 21 22 23 .210 （三）置于振蕩器上振蕩（三）置于振蕩器上振蕩1 1分鐘。分鐘。（四）（四）3737恒溫箱恒溫箱2020分鐘觀察結(jié)果。分鐘觀察結(jié)果。（五）判定結(jié)果：（五）判定結(jié)果：（）凝集反應(yīng)者，凝集的紅細(xì)胞（）凝集反應(yīng)者，凝集的紅細(xì)胞呈薄膜狀，均勻的復(fù)滿(mǎn)孔底，有的呈薄膜狀，均勻的復(fù)滿(mǎn)孔底，有的似有紅細(xì)胞沉積于中央。似有紅細(xì)胞沉積于中央。（）紅細(xì)胞全部沉于孔底中央，（）紅細(xì)胞全部沉于孔底中央，周?chē)鸁o(wú)散在的紅細(xì)胞。周?chē)鸁o(wú)散在的紅細(xì)胞。 6）觀察結(jié)果：一層紅細(xì)胞均勻地鋪于孔壁上者為+。基本同上，但邊緣不整齊，鋪的面積稍小些者為+。紅細(xì)胞形成一個(gè)環(huán)狀，四周有小凝集塊者為+。紅細(xì)胞形成一個(gè)小團(tuán)，但邊緣不光滑，四周有小凝塊者為+。如用雞紅細(xì)胞于孔底形成一個(gè)小團(tuán)，邊緣光滑有立體感，將板傾斜片刻，就可見(jiàn)紅細(xì)胞滑動(dòng)像人的眼淚樣為-。如用豚鼠或人紅細(xì)胞形成一個(gè)小圓圈，邊緣光滑無(wú)任何小凝集者為-?！啊奔礊榭梢桑?jì)算時(shí)以“-”（陰性）處理。Dilution248163264 128 256 512prozonetit