國自然標書模板

1、國自然標書模板申請代碼受理部門收件日期受理編號國家自然科學基金申 請 書（2 0 1 6 版）資助類別：青年科學基金項目亞類說明： 附注說明：項目名稱：poly(a)化gant61納米顆粒靶向治療膠質(zhì)瘤的實驗研究申 請 人：電 話：依托單位：通訊地址：郵政編碼：單位電話：電子郵箱：申報日期：國家自然科學基金委員會1申請人信息姓名性別出生年月民族學位職稱每年工作時間（月）電話電子郵箱傳真國別或地區(qū)個 人 通 訊 地 址工作單位主 要 研 究 領 域依托單位信息名稱聯(lián)系人電子郵箱電話網(wǎng)站地址合作研究單位信息單 位 名 稱項目基本信息項目名稱poly(a)化gant61納米顆粒靶向治療膠質(zhì)瘤的實驗研

2、究英文名稱study of poly functionalized gant61 nanoparticles targeting treatment of glioma資助類別亞類說明附注說明申請代碼基地類別研究期限申請經(jīng)費萬元中 文 關 鍵 詞gant61 ；shh信號通路；納米顆粒；膠質(zhì)瘤；靶向治療英 文 關 鍵 詞gant61 ; sonic hedgehog signaling pathway ; nanoparticles; glioma; targeted therapy基本信息第 2 頁中文摘要膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，許多患者治療后常常遺留神經(jīng)系統(tǒng)功能缺陷和認知

3、障礙，嚴重影響著患兒的生存質(zhì)量。因此，尋找新型、高效、安全的治療方法對于治療膠質(zhì)瘤具有重要意義。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，gli1蛋白的表達與膠質(zhì)瘤的發(fā)生相關。gli1靶向抑制劑gant61能夠明顯抑制膠質(zhì)瘤的增殖生長，促進其凋亡。但同時gant61還存在著一定的缺限。為此，本項目擬結(jié)合體內(nèi)和體外實驗，通過利用ga nt61與poly腺嘌呤(a堿基)氫鍵特異性結(jié)合，同具有良好生物相容性的二氧化硅納米顆粒相結(jié)合，研究一種poly(a)化gant61二氧化硅納米顆粒。通過免疫組化、westerblot、qpcr、流式細胞術、cck8等實驗，深入研究其在膠質(zhì)瘤增殖及凋亡的作用，為提高膠質(zhì)瘤的治療效果提

4、供新的思路和理論依據(jù)。英文摘要glioma (mb) is the most common malignant brain tumor, and clinical outcome is worse. many patients suffer from considerablelong-termdisability and morbidity after aggressive multimodal therapy. therefore, it is important to find a novel, efficient, safety therapeutic method for glioma

5、. our results indicate a significant role for gli1 in the proliferation of mb, and molecular targeting of gli1,gant61, is a potential therapeutic approach to inhibitory tumor proliferation and induced cell apoptosis of mb. however, gant61 has some disadvantages. therefore, this project intends to co

6、mbine in vivo and in vitro experiments. combined gant61, poly (a) with silica nanoparticles can synthesise gant61 with poly(a) silica nanoparticles. it assays by immunohistochemistry, western blot, qpcr, flow cytometry and cck8 to investigate tumor proliferation and cell apoptosis of mb. in order to

7、 improve the treatment effect of glioma provides new train of thought and theory basis.國家自然科學基金申請書項目組主要參與者（注: 項目組主要參與者不包括項目申請人）編號姓名出生年月性別職 稱學 位單位名稱電話電子郵箱證件號碼每年工作時間（月）總?cè)藬?shù)高級中級初級博士后博士生碩士生第 3 頁國家自然科學基金項目資金預算表金額單位：萬元序號科目名稱金額1一、 項目資金2(一) 直接費用31、 設備費4(1)設備購置費5(2)設備試制費6(3)設備改造與租賃費72、 材料費83、 測試化驗加工費94、 燃料動力費

8、105、 差旅費116、 會議費127、 國際合作與交流費138、 出版/文獻/信息傳播/知識產(chǎn)權事務費149、 勞務費1510、 專家咨詢費1611、 其他支出17(二) 間接費用18其中：績效支出19二、 自籌資金第 19 頁預算說明書（定額補助）（請按國家自然科學基金項目資金預算表編制說明中的要求，對各項支出的主要用途和測算理由及合作研究外撥資金單價10萬元的設備費等內(nèi)容進行詳細說明，可根據(jù)需要另加附頁。）科目 申請經(jīng)費（萬元） 備注（計算依據(jù)與說明） 一、 項目資金： (一) 直接費用： 20 1、 設備費： 2 (1)設備購置費： 1 (2)設備試制費： 1 (3)設備改造與租賃費：

9、 2、 材料費： 8 細胞系、細胞培養(yǎng)液、細胞凋亡檢測試劑盒、各種一抗等，具體見經(jīng)費申請說明 3、 測試化驗加工費： 納米顆粒合成、 rna引物合成、 流式細胞儀檢測等 4、 燃料動力費： 1 水、電和實驗室平臺的有償使用費 5、 差旅費： 1 參加學術會議交流和實驗經(jīng)驗交談會議 6、 會議費： 1 參加國內(nèi)和國際學術會議交流 7、 國際合作與交流費： 到國內(nèi)外先進實驗室學習和交流的來回機票、住宿等 8、 出版/文獻/信息傳播/知2 文獻檢索、復印打印、版面費、信識產(chǎn)權事務費： 息咨詢、通訊費等 9、 勞務費： 3 直接參加項目研究的研究生的勞務費用 10、 專家咨詢費： 1 11、 其他支出

10、： (二) 間接費用： 其中：績效支出： 二、 自籌資金： 5.協(xié)作費 、（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000 字）：1. 項目的立項依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析， 需結(jié)合科學研究發(fā)展趨勢來論述科學意義；或結(jié)合國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中迫切需要解決的關鍵科技問題來論述其應用前景。附主要參考文獻目錄）；1.1 研究意義膠質(zhì)瘤 (glioma) 是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，約占兒童腦腫瘤的 25%。具有生長迅速、手術難以徹底切除的特點。近年來開展的以手術切除并結(jié)合放化療的綜合治療僅能治愈部分 病例，還有相當多的膠質(zhì)瘤患者治療后遺留神經(jīng)系統(tǒng)功能缺陷和認知障礙， 嚴重影響著患

11、者的生存質(zhì)量。因此，對膠質(zhì)瘤的靶向治療和分子機制的深入研究，將為治療膠質(zhì)瘤的治療提供更多的理論依據(jù)和實驗基礎。尋找治療 gb 更安全有效的方法，并盡可能減少后遺癥是十分必要的，具有重大的社會意義。shh 信號通路（sonic hedgehog pathway, shh）的傳遞過程可以簡單總結(jié)四個部分：sonic hedgehog（shh 配體蛋白）- ptch（跨膜蛋白受體）- smo（跨膜蛋白）- gli（轉(zhuǎn)錄因子）的傳遞過程。gli 是該信號通路下游終末端的轉(zhuǎn)錄因子， 調(diào)控著下游 cyclind1、n-myc、ptch1、bcl-2 和 bax 等多個靶基因。gant61 是該通路下游的

12、gli 抑制劑，它主要與 gli1dna 結(jié)合，抑制 gli1、gli2 鋅指蛋白活性，從而拮抗 shh 信號通路 smo 下游 gli1 等轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。雖然多項研究表明 gant61 能夠明顯抑制腫瘤的生長增殖，促進腫瘤細胞的凋亡， 但 gant61 同樣也存在著一定的缺點，如何提高藥物的靶向運輸，提升治療效果，降低藥物的不良反應等一系列問題，都需要通過一種新型的載體材料來解決。1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析隨著新世紀生物材料科學的發(fā)展，功能化的納米材料在腫瘤的治療方面存在著廣闊的應用前景。通過構建納米藥物載體，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物精準的控制釋放，提高藥物的靶向運輸效率和治療效果，并且

13、能夠大大減少藥物的不良反應。同時，聚腺嘌呤(polya) 廣泛存在于生物體中，和生命的活動息息相關，尤其是在 rna 的轉(zhuǎn)錄和翻譯之中發(fā)揮著重要作用。而且，許多腫瘤細胞的 mrna 末端往往存在著過度表達(polya)尾端。很多研究發(fā)現(xiàn)，利用 mrna 末端的poly(a) 作為藥物靶點，其能夠通過與藥物的氫鍵特異結(jié)合，可以抑制 mrna 的翻譯， 從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。同時，由于氫鍵結(jié)合力介于共價結(jié)合和靜電吸附之間， 在一定的條件下(如低 ph、升溫)，其結(jié)合力將會下降。因此，利用 poly(a)能夠和藥物之間相互作用的特點進行裝載藥物，可能會成為一種新型的抗腫瘤藥物載體。因此，利用小分子

14、 gant61 化合物與腺嘌呤(a 堿基)氫鍵特異性結(jié)合，并在酸性環(huán)境下結(jié)合力將會下降的特點，同具有良好生物相容性、dna 酶切保護性以及易于生物修飾的二氧化硅納米顆粒相結(jié)合，研究一種基于(polya)和二氧化硅納米顆粒 (silica coated nanoparticles, sinps) 的，并且能夠通過腫瘤的酸性環(huán)境進行可控性的釋放抗腫瘤藥物，將是一種更新型、更有效、更安全和更有前景的治療方式，對膠質(zhì)瘤的治療過程具有重要意義。2. 項目的研究內(nèi)容、研究目標，以及擬解決的關鍵科學問題（ 此部分為重點闡述內(nèi)容）；2.1 研究內(nèi)容(1) 在體外分離培養(yǎng) doay 細胞，研究 gant61 對

15、膠質(zhì)瘤 doay 細胞增殖抑制的影響，通過流式細胞術檢測 gant61 對膠質(zhì)瘤的促凋亡作用， western blot 和qpcr 等實驗研究膠質(zhì)瘤中doay 細胞shh 信號通路中gli1、gli2、cyclind1、caspase3、caspase9、bax、bcl-2 等表達情況。(2) 成功構建 poly(a)化 gant61 納米顆粒。分別通過高分辨電鏡、高效液相色譜法檢測、cck8 法和激光共聚焦研究等實驗研究合成納米顆粒的表面特征、納米顆粒藥物的包封率和載藥量、細胞的抑制率和細胞的吞噬及釋放。(3) 制作膠質(zhì)瘤裸小鼠移植瘤模型， 使用構建成功的 poly(a) 化gant61

16、納米顆粒頸內(nèi)動脈注射移植裸小鼠膠質(zhì)瘤進行動物實驗， westernblot、免疫組化及 qpcr 等實驗研究膠質(zhì)瘤中shh 信號通路中gli1、gli2、cyclind1、caspase3、caspase9、bax、bcl-2 等表達情況。2.2 研究目標(1) 在體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤 doay 細胞，研究 shh 信號通路靶向抑制劑gant61 對膠質(zhì)瘤 doay 細胞增殖抑制的影響。(2) 合成 poly(a)化 gant61 納米顆粒，分別通過高分辨電鏡、高效液相色譜法檢測、cck8 法和激光共聚焦研究等實驗研究合成納米顆粒的表面特征、納米顆粒藥物的包封率和載藥量、細胞的抑制率和細胞的吞噬及釋

17、放。(3) poly(a)化 gant61 納米顆粒靶向治療裸鼠膠質(zhì)瘤，再使用免疫組化、westen blot 和 qpcr 檢測膠質(zhì)瘤中 shh 信號通路中相關蛋白和基因的表達情況。2.3 擬解決的關鍵科學問題1、在體外構建建立 poly(a)化 gant61 納米顆粒合成，目前我們已經(jīng)進行了相關的研究。2、使用透射電子顯微鏡、電泳、高效液相色譜儀等方法檢測納米顆粒的形貌、電位、穩(wěn)定性、載藥量、包封率以及考察 gant61 在不同 ph 值溶液的釋放行為。再通過激光共聚焦掃描儀考察細胞對顆粒的吞噬以及吞噬后顆粒的定位。3、建立裸鼠的膠質(zhì)瘤模型具有一定的技術困難，本課題組已經(jīng)在前期準備工作中進

18、行了初步的研究。3. 擬采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技術路線、實驗手段、關鍵技術等說明）；3.1 研究方案（1） 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)在體外分離培養(yǎng) doay 細胞，膠質(zhì)瘤 doay 細胞株在含 10% 胎牛血清的 dmem 培養(yǎng)基于 37、5%co2 恒溫孵箱進行貼壁培養(yǎng)，每 23 天根據(jù)細胞生長的密度和培養(yǎng)液酸堿度的變化更換培養(yǎng)液，當細胞匯合度達 80 90%時進行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)時根據(jù)細胞生長情況進行 1:2 或 1:4 的傳代。實驗前用臺盼藍染色法鑒定細胞活力在 98%以上。（2） shh 信號通路抑制劑 gant61 對膠質(zhì)瘤 doay 細胞的靶向抑制作用。研究 shh

19、信號通路抑制劑 gant61 對膠質(zhì)瘤 doay 細胞增殖抑制的影響，通過流式細胞術檢測 gant61 對膠質(zhì)瘤的促凋亡作用，并使用 qpcr、westerblot 及免疫熒光進行分別檢測shh 信號通路中相關蛋白的表達情況：gli1、 gli2、cyclind1、bcl-2、bax 及 caspase3 等。（3） 構建 poly(a)化 gant61 納米顆粒采用反向微乳法合成羧基化二氧化硅納米顆粒(coohsinps)。將環(huán)己烷 7 ml、正己醇 ml 以及表面活性劑 triton x-100 2ml 混合均勻后，加入 500 l 超純水于常溫下攪拌 30 min，再將 100 l 氨水

20、和 100 l teos 加入到微乳液體系中，連續(xù)攪拌 24 h。然后加入 60l 羧基硅烷化試劑 (cptes)，于室溫下繼續(xù)攪拌反應 24 h 后，破乳、離心分離顆粒，獲得 coohsinps 顆粒。采用 edcnhs 交聯(lián)方法將poly(a)修飾到cooh-sinps 表面。取2mg coohsinps 分散于1 ml mes 緩沖液中，加入 nhs 和 edc，在上述混合液中再加入 nmol poly(a)，于室溫下振蕩 8h 后離心收集顆粒，用超純水洗滌 3 次，即得到poly(a)-sinps，采用瓊脂糖凝膠電泳法考察 poly(a)是否成功修飾在二氧化硅納米顆粒表面。取 2 mg

21、 poly(a)sinps 顆粒分散在 1ml 50 m/l gant61 溶液中， 于室溫中振蕩 1 h 后離心收集顆粒，用超純水洗滌 3 次，即得到 poly(a)化gant61 納米顆粒。（4） cck8 法 poly(a)化 gant61 納米顆粒的生物相容性以及對癌細胞殺傷效果。doay 細胞培養(yǎng)生長狀態(tài)良好時，消化細胞制成單細胞懸液。細胞計數(shù)后以2×104 細胞接種于 96 孔板，37、5%co2 培養(yǎng)過夜。第二天，更換新鮮的 dmem培養(yǎng)基，并分別設置不同濃度的 poly(a)化 gant61 納米顆粒組、poly(a)-sinps 組、gant61 組及空白對照組，分

22、別設置加了相應量細胞培養(yǎng)液、藥物和 cck-8 溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育，每孔于加藥后 24h、48h 加入 cck-8 溶液 10l，并終止反應，用酶標儀測定 450nm 處吸光度值，用所測得的 a450 計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(對照組 a450 值-實驗組 a450 值)/對照組 a450 值×100%。上述實驗分別在 1 天、1 周、2 周和 3 周檢查。（5） 激光共聚焦研究 poly(a)化 gant61 納米顆粒的細胞吞噬與釋放研究為了考察 poly(a)化 gant61 納米顆粒被細胞吞噬后的定位情況以及在細胞內(nèi)部的釋放行

23、為。將 doay 細胞接種于激光共聚焦皿內(nèi)，然后將培養(yǎng)皿放入 37， 5c02 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 h 后，加入熒光化 poly(a)化 gant61 納米顆粒納米顆粒繼續(xù)孵育 5 h 后去除上清，用 d-hanks 清洗，然后利用 lysotracker green 溶 液對細胞中的溶酶體進行標記，采用激光共聚焦顯微鏡對細胞進行成像觀察載體 在細胞中定位情況。隨后將皿放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，再進行激光共聚焦成像來考察顆粒在細胞內(nèi)的釋放行為。（6） 高分辨光鏡及掃描電鏡觀察 poly(a)化 gant61 納米顆粒首先用顯微鏡觀察 poly(a)化 gant61 納米顆粒表面形態(tài)特

24、征，繼而用toshiba800s 掃描電鏡,電壓 20kv，每一規(guī)格測量 300 個微球直徑，計算微球平均直徑。（7） 高效液相色譜法檢測藥物包封率和載藥量的測定分別精密稱取 poly(a)化 gant61 納米顆粒 5mg 置 10ml 量瓶中，加二氯甲烷適量溶解，用甲醇稀釋至刻度，過濾，取過濾液 100l 稀釋到 ，取 20l 溶液注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算載藥量和包封率。微球的載藥量= (微球中藥物含量/微球重量)*100，包封率=（微球中藥物含量/投藥量)*100。檢測微球中剩余的 gant61 量，從而計算出不同時段釋放藥物量，繪制釋放曲線。7、建立膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤模型裸鼠

25、麻醉后立體定向下(矢狀縫旁開 ，冠狀縫前 1mm，深 5mm)緩慢勻速(10 分鐘)將 10l 膠質(zhì)瘤 doay 細胞（1×106）注射到裸鼠右側(cè)額葉。移植后 1 周、2 周、4 周處死動物，測定各組腫瘤體積并進行 he 染色觀察形態(tài)學、壞死及 mvp 情況，測定腫瘤體積。使用構建成功的 poly(a)化 gant61 納米顆粒在裸鼠膠質(zhì)瘤模型制作成功后 3 天進行頸內(nèi)動脈移注射。8、免疫組化處死裸鼠后，同時腫瘤組織石蠟切片行免疫組化實驗。根據(jù) poly(a) 化gant61 納米顆粒組、poly(a)化納米顆粒組、gant61 組及空白對照組進行分組。分別檢測 shh 信號通路中相

26、關蛋白的表達情況：gli1、gli2、cyclind1、bcl-2、bax 及 caspase3 等。將石蠟切片進行脫水固定后，分別加入上述各種抗體在 37 孵育 30min。再經(jīng)二抗(1：100)在 37下孵育 30min 后，在顯微鏡下觀察并拍照記錄。8、western blot處死裸鼠后，同時提取腫瘤組織行 western blot 實驗。根據(jù) poly(a)化gant61 納米顆粒組、poly(a)化納米顆粒組、gant61 組及空白對照組進行分組。分別檢測 shh 信號通路中相關蛋白的表達情況：gli1、gli2、cyclind1、bcl-2、bax 及 caspase3 等。提取細

27、胞總蛋白，bca 法測定蛋白濃度。取 50g 蛋白質(zhì)， 與 2×sd s 上樣緩沖液 1:1 混合，100變性 10min。置冰上 2min，進行 12% sds-page 膠電泳。電泳完畢后，切膠、轉(zhuǎn)膜。pvdf 膜用 20ml 封閉液(含 5 脫脂奶粉的 pbs-t)室溫孵育 1h，棄封閉液，加入兔抗人多克隆抗體(1:1000)，4 孵育過夜后洗膜，加入 hrp 標記的抗兔二抗(1:4000)孵育后洗膜。加入 ecl 化學發(fā)光顯色試劑，反應 5min，x 線膠片曝光后，顯影、定影，以 -actin 作為內(nèi)對照。9、qpcr 實驗檢測 shh 信號通路表達情況。處死裸鼠后，同時提取

28、腫瘤組織 mrna 行 qpcr 實驗。根據(jù) poly(a)化gant61 納米顆粒組、poly(a)化納米顆粒組、gant61 組及空白對照組進行分組。分別檢測 shh 信號通路中相關蛋白的表達情況：gli1、gli2、gyclind1、bcl-2、bax 及 gaspase3 等。daoy 細胞進行上述分組干預后，收集腫瘤組織，trizol 法提取各組腫瘤組織的總 rna，進行逆轉(zhuǎn)錄成 cdna；取各分組 cdna 2l，配制成 real-time pcr 反應體系進行擴增。采用 real-timepcr 相對定量的方法，比較各組目的基因與管家基因 -actin 的 ct 值，采用 2-c

29、t 方法，得出各組目的基因的相對表達量。結(jié)果使用 bio-rad cfx manager 自動計算，采用 spss 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。3.2 技術路線 1gant61(polya)尾端二氧化硅納米顆粒poly (a) 化 gant61納米顆粒瓊脂糖凝膠 激光共聚焦研究 高效液相色譜法 高分辨光鏡及掃描電鏡 cck8 法空白對照組gant61 組poly(a)化納米顆粒組poly(a)化gant61 納米顆粒組裸鼠doay 細胞培養(yǎng)技術路線 2免疫組化westernblot試驗 qpcr 流式細胞術4. 本項目的特色與創(chuàng)新之處；1、研究 shh 信號傳導通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的機制，研究

30、 gli1 和cyclind1 在膠質(zhì)瘤中的異常表達及意義2、研究 poly(a)化 gant61 納米顆粒抑制膠質(zhì)瘤的增殖生長，分析其抑制腫瘤生長的機制及原因，為進一步高效治療膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。3、通過裸鼠膠質(zhì)瘤模型檢驗 poly(a)化 gant61 納米顆粒對腫瘤的抑制及促凋亡作用，為臨床治療膠質(zhì)瘤提供新型的、更安全及更高效的治療方案。5. 年度研究計劃及預期研究結(jié)果（包括擬組織的重要學術交流活動、國際合作與交流計劃等）。5.1 年度研究計劃：培養(yǎng) doay 細胞，完成 shh 信號通路靶向抑制劑gant61 對膠質(zhì)瘤 doay 細胞增殖抑制的影響。（在前期工作中已初步完成）：構建 p

31、oly(a)化 gant61 納米顆粒，研究納米顆粒穩(wěn)定性、載藥量、包封率以及釋放等情況。進一步研究 poly(a)化 gant61 納米顆粒對膠質(zhì)瘤 doay 細胞的增殖抑制作用，并撰寫論文 1-2 篇。：制作裸鼠膠質(zhì)瘤動物模型，進行裸鼠膠質(zhì)瘤模型頸內(nèi)動脈注 poly(a)化 gant61 納米顆粒，研究 poly(a)化 gant61 納米顆粒對膠質(zhì)瘤的增殖抑制作用。撰寫論文 2-3 篇，申請專利，并進行資料總結(jié)、結(jié)題和成果鑒定等。5.2 預期研究結(jié)果:通過本項目的實施，我們預計 shh 信號通路靶向抑制劑能夠抑制 mb 的發(fā)生發(fā)展，影響相關基因、蛋白的表達，從而影響腫瘤增殖生長。利用該結(jié)果，使我們能夠進一步闡明 mb 中 shh 信號通路的發(fā)生機理，并使用納米材料，高效、準確的靶向腫瘤治療，對于臨床上早期治療 mb，減少后遺癥具有重要的理論意義和實際應用價值。國內(nèi)權威學術刊物發(fā)表論文 1 篇，sci 收錄 1 篇。培養(yǎng)碩士研究生