生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)

1、第六章 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)主編：齊錦生 編委：孔德娟 齊錦生 許麗輝 楊崇輝 周秀霞 羅湘衡 君智煒 張曉玲 王芳實(shí)驗(yàn)室要求一、 實(shí)驗(yàn)課的目的1、加深理解：加深對(duì)生物化學(xué)基本理論的理解。2、掌握技術(shù)：掌握生物化學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)（四大基本技術(shù)：離心、電泳、層析、比色）及分子生物學(xué)的一些基本技術(shù)和方法。3、培養(yǎng)能力：培養(yǎng)學(xué)生的思維能力、動(dòng)手能力和表達(dá)能力。4、掌握精髓：科學(xué)的精髓是實(shí)事求是、敢于探索、善于創(chuàng)新的精神，要對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的一切反常現(xiàn)象進(jìn)行討論，并大膽提出自己的看法。二、 生化實(shí)驗(yàn)室規(guī)則和要求1、預(yù)習(xí)： 課前要預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)教材，了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒃?，熟悉操作?guī)程。2、秩序： 自覺(jué)遵守

2、紀(jì)律，維護(hù)教學(xué)秩序，不準(zhǔn)遲到、早退，保持安靜，嚴(yán)禁談笑打鬧，聽(tīng)從教師指導(dǎo)，未經(jīng)教師同意，不得隨意離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。3、整潔： 搞好實(shí)驗(yàn)環(huán)境和儀器的衛(wèi)生整潔，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面必須保持整潔，儀器藥品要井然有序，公用試劑用畢，應(yīng)立即蓋嚴(yán)放回原處，勿使藥品試劑撒在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和地面。實(shí)驗(yàn)完畢，需將藥品試劑排列整齊，儀器要洗凈倒置放好。固體廢物，如濾紙、棉花、血塊不得倒入水池中，以免堵塞下水道；一般性廢液可倒入水池中沖走，但強(qiáng)酸強(qiáng)堿或有毒有害溶液必須用水高度稀釋后，方可倒入水池中，同時(shí)放水沖走，以免腐蝕水管。全體同學(xué)由班長(zhǎng)安排輪流值日，負(fù)責(zé)當(dāng)天實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生、安全和一些服務(wù)性工作，經(jīng)教師驗(yàn)收合格后，方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。4、節(jié)約：

3、 使用儀器、藥品、試劑及各種物品必須厲行節(jié)約，并節(jié)約水電。應(yīng)特別注意保持藥品和試劑的純凈，嚴(yán)防混雜、亂用和污染。使用和洗滌儀器應(yīng)小心仔細(xì)，防止損壞，貴重儀器使用前應(yīng)熟悉使用方法，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，嚴(yán)禁隨意開(kāi)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)故障后應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師，不要自己動(dòng)手檢修，如有損壞按學(xué)校規(guī)定賠償。5、安全： 注意人身和國(guó)家財(cái)產(chǎn)安全是至關(guān)重要的，要時(shí)刻注意防火、防水、防電、防危險(xiǎn)品、防事故，以免發(fā)生意外。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙。使用乙醚、苯、乙醇、丙酮等易燃品時(shí)，不允許在電爐、酒精燈上直接加熱。實(shí)驗(yàn)中須遠(yuǎn)離火源，如有危險(xiǎn)發(fā)生，應(yīng)首先關(guān)掉電源；有機(jī)溶劑著火時(shí)，勿用水潑，以免擴(kuò)大燃燒面積，可用沙土、滅火器具滅之。用火時(shí)必

4、須嚴(yán)格做到：火著人在，人走火滅。用畢電器后及時(shí)切斷電源。加熱試劑、液體時(shí)，管口不要對(duì)人，要十分小心操作，避免灼傷人。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一切物品未經(jīng)本室負(fù)責(zé)教師批準(zhǔn)，嚴(yán)禁攜帶出室外，有毒物品尤其如此。借物必須辦理登記手續(xù)。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述一、 層析法層析是利用混合物各組分物理化學(xué)性質(zhì)（如：溶解度、吸附能力、電荷和分子量等）的差別，使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此將各組分分離。層析系統(tǒng)分為兩個(gè)相：固定相和流動(dòng)相。由于各組分受固定相的阻力和受流動(dòng)相的推力影響不同，各組分移動(dòng)速度也各異，從而使各組分得以分離。此法首先用于有色物質(zhì)的分離，故又稱(chēng)色層析法。層析法是近代生物化學(xué)最常用的分析法之一，此法可

5、以分離性質(zhì)極為相似、而用一般化學(xué)方法難以分離的各種化合物，如各種氨基酸、核苷酸、糖、蛋白質(zhì)等。層析法有多種類(lèi)型，根據(jù)所用兩組分不同分為以下幾類(lèi)：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析等；根據(jù)操作方式不同分為：柱層析、薄層層析和紙層析等。（一） 吸附層析法：吸附層析法（absorption chromatography）是混合物隨流動(dòng)相通過(guò)吸附劑時(shí)，由于吸附劑對(duì)不同物質(zhì)有不同的吸附力而使混合物分離的方法。吸附層析根據(jù)操作方式的不同，分為柱層析與薄層層析兩種。1、柱層析法：柱層析法是用一根玻璃管柱，下端鋪墊棉花或玻璃棉，管內(nèi)加吸附劑粉末，用一種溶劑潤(rùn)濕后，即成為吸附柱，如圖1中的（1

6、）。然后在柱頂部加入要分離的樣品溶液，如圖1中的（2）。假如樣品內(nèi)含兩種成分A和B，則二者被吸附在柱上端，形成色圈，如圖1中的（3）。樣品溶液全部溶入吸附柱中之后，接著就加入合適的溶劑洗脫，如圖6-0-1中的（4）。A與B就隨著溶劑的向下流動(dòng)而移動(dòng)。最后分離情況如圖1中的（5）所示。圖 6-0-1 二元混合物的柱層析示意圖在洗脫過(guò)程中，管內(nèi)連續(xù)發(fā)生溶解、吸附、再溶解、再吸附的現(xiàn)象。例如，被吸附后的A粒子被溶解（解吸作用）隨溶劑下移，但遇到新的吸附劑，又將A粒子吸附，隨后，新溶劑又使A粒子溶解下移。由于溶劑與吸附劑對(duì)A與B的溶解力與吸附力不完全相同，A與B移動(dòng)的速率也不同，經(jīng)一定時(shí)間，如此反復(fù)地

7、溶解與吸附，而形成兩個(gè)環(huán)帶，每一環(huán)帶是一種純物質(zhì)。如A與B有顏色可看到色層；如樣品無(wú)色，可用其它方法使之顯色，為進(jìn)一步鑒定，可將吸附柱從管中頂出來(lái)，用刀將各色層切開(kāi)，然后分別洗脫，現(xiàn)在多采用溶劑洗脫法，即連續(xù)加入溶劑，連續(xù)分段收集洗脫劑，直到各成分順序全部從柱中洗出為止。最常用的吸附劑是硅膠和氧化鋁。硅膠的吸附能力和含水量關(guān)系極大，硅膠吸水后，吸附能力下降，常用于分離非極性的和極性不強(qiáng)的有機(jī)物，如甘油脂、磷脂、膽固醇等。2、薄層層析法：薄層層析法是吸附劑在玻璃板上均勻地鋪成薄層，把要分析的樣品點(diǎn)加到薄層上，然后用適當(dāng)?shù)娜軇┱归_(kāi)，而達(dá)到分離、鑒定的目的。其優(yōu)點(diǎn)是：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易；層析展開(kāi)時(shí)間

8、短，分離時(shí)幾乎不受溫度的影響；可采用腐蝕性的顯色劑，且可以在高溫下顯色；分離效率高。薄板的制備：所用玻璃板表面必須光滑、清潔。根據(jù)制薄板的方法不同薄板可以分為軟板和硬板兩種。軟板即不加粘合劑，將吸附劑干粉直接均勻鋪在玻板上；制作簡(jiǎn)單方便，但是易被吹散。硬板即用粘合劑如水或其他液體，將吸附劑調(diào)成糊狀再鋪板，經(jīng)干燥后才能使用；制備雖然較繁瑣，但易于保存。具體制備方法如下：（1）軟板：選用一根直徑約為11.2cm的玻璃管，根據(jù)薄層的厚度在玻璃管兩端纏幾圈膠布，膠布的厚度按需要的薄層厚度而定。常用的厚度約為0.41mm左右。把干的吸附劑倒到玻璃板上，玻板的一端固定，防止推玻璃管時(shí)玻板移動(dòng)，然后將玻璃管

9、壓在玻板上，把吸附劑由一端推向另一端，即成薄板。要求：光滑、平整、厚度均勻。（2）硬板：將適當(dāng)調(diào)好的吸附劑倒在兩塊3mm玻板中間所夾的一塊2mm厚度的玻板上，然后用一塊邊緣光滑的玻片把吸附劑刮向一邊，即成厚度一定的薄板。下面介紹氧化鋁和硅膠硬板的制備方法。氧化鋁硬板：稱(chēng)取氧化鋁G25g（G表示石膏，這種氧化鋁中含5%鍛石膏），加水25ml，在燒杯中調(diào)成糊狀，鋪層，先在空氣中干燥，后置于200220烘箱中烤4小時(shí)即可使用。硅膠硬板：稱(chēng)取硅膠G30g，加水6090ml，在燒杯中調(diào)成均勻糊狀，立即鋪層，室溫內(nèi)干燥后置烘箱中烘干。此外，也可用淀粉或羧甲基纖維素鈉（CMC）作粘合劑制板。薄層層析的操作步

10、驟是：點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色。（二）分配層析：分配層析是利用混合物在二種或二種以上的不同溶劑中的分配系數(shù)不同而使物質(zhì)分離的方法。如用帶水的材料（載體）作為液相（固定相），加入與水不相混合或僅部分混合的溶劑（流動(dòng)相），則混合物各組分在兩相間發(fā)生不同的分配現(xiàn)象而逐漸分開(kāi)，形成色層。載體在分配層析中只起負(fù)擔(dān)固定相的作用，它們是一些吸附力小、反應(yīng)性弱的惰性物質(zhì)，如淀粉、纖維素粉、濾紙等。固定相除水外，還有稀硫酸、甲醇、仲酰胺等強(qiáng)極性溶液。流動(dòng)相則采用比固定相極性小或非極性的有機(jī)溶劑。紙層析是最廣泛應(yīng)用的一種分配層析。紙層析法以濾紙為載體，濾紙上吸附著水（約含20%22%）是經(jīng)常用的固定相，此類(lèi)有機(jī)溶劑如醇、

11、酚等為常用的流動(dòng)相。把欲分離的物質(zhì)加在紙的一端，使流動(dòng)溶劑經(jīng)此移動(dòng)，這樣就在兩相間發(fā)生分配現(xiàn)象。由于物質(zhì)分配系數(shù)的不同，就逐漸在紙上集中于不同的部位。在固定相中分配趨勢(shì)較大的成份，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度就慢；反之，在流動(dòng)相分配趨勢(shì)較小的成分，移動(dòng)速度就快。物質(zhì)在紙上移動(dòng)的速度可以用Rf表示： 色斑中心至原點(diǎn)中心的距離Rf = 溶劑前緣至原點(diǎn)中心的距離物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動(dòng)速率（Rf值）也恒定，因此，可以根據(jù)Rf值來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)。紙層析法按操作方法分成兩類(lèi)，即：垂直型和水平型。垂直型是將濾紙條懸起，使流動(dòng)相向上或向下擴(kuò)散；水平型是將圓形濾紙置于水平位，溶劑由中心向四周擴(kuò)散。垂

12、直型使用較廣，按分配物質(zhì)的多寡，將濾紙截成長(zhǎng)條，在某一端距邊緣24cm處點(diǎn)樣，待干后，將點(diǎn)樣端邊緣與溶液接觸，在密蓋的玻璃缸內(nèi)進(jìn)行展開(kāi) 見(jiàn)圖6-0-1 圖6-0-2垂直紙層析上述方法只用一種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行一次展開(kāi)，稱(chēng)為單向?qū)游觥Ｈ绻麡悠烦煞州^多，而且彼此的Rf 值相近，單向?qū)游龇蛛x效果不佳，可用雙向?qū)游龇ǎ丛陂L(zhǎng)方形或方形濾紙的一角點(diǎn)樣，卷成圓筒形，先用第一種溶劑系統(tǒng)展開(kāi)，展開(kāi)完畢吹干后轉(zhuǎn)90º，再放于另一種溶劑系統(tǒng)中，向另一方向進(jìn)行第二次展開(kāi)，如此各成分分離較為清晰。見(jiàn)圖6-0-3 圖6-0-3（三）離子交換層析：離子交換層析法（ion exchange chromatography

13、 IEC）是利用離子交換劑對(duì)需要分離的各種離子有不同的親和力而達(dá)到分離的目的，這種柱層析稱(chēng)為離子交換層析。離子交換劑是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將帶電荷基團(tuán)引入惰性支持物上而形成。離子交換作用是指一溶劑中某一種離子與一固體中的另一種具有相同電荷的離子進(jìn)行相互位置的調(diào)換。由于各種離子所帶電荷的多少不同，它們對(duì)交換劑的親和力就有所差別。因此，在洗脫過(guò)程中，各種離子由固體柱上先、后下來(lái)的順序不同，從而可達(dá)到分離的目的。這種離子交換是定量完成的，因此測(cè)定溶液中由固體上交換下來(lái)的離子量，可知樣品中原有離子的含量，也可將吸附在交換劑上的樣品的成分用另一洗脫液洗脫下來(lái)，進(jìn)行定量測(cè)定。離子交換層析主要用于蛋白質(zhì)、多肽的分離

14、。核酸也是強(qiáng)極性分子，用離子交換層析也能得到很好的分離效果。離子交換劑種類(lèi)很多，根據(jù)交換劑上吸附的離子交換基團(tuán)不同，可分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑；根據(jù)惰性支持物不同，又有樹(shù)脂、纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠及瓊脂糖凝膠等種類(lèi)。目前大多采用的離子交換劑是合成離子交換劑，即離子交換樹(shù)脂，其分為兩大類(lèi)：分子中具有酸性基團(tuán)，能交換陽(yáng)離子的稱(chēng)為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；分子中具有堿性基團(tuán)，能交換陰離子的稱(chēng)為陰離子交換樹(shù)脂。按其解離性的大小，又可分為強(qiáng)弱兩種：磺酸基 （SO3H）強(qiáng)酸性 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 酚羥基（OH） 弱酸性 羧基 （COOH）強(qiáng)堿性 季胺基 （NR4）陰離子交換樹(shù)脂 伯胺基 （NH2）弱堿

15、性 仲胺基 （NHR） 叔胺基 （NR2）交換反應(yīng)舉例如下：R-SO3H+ + M+X R-SO3M + XH+R4NOH + HX R4NX- + HOH-離子交換樹(shù)脂的交換容量與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，這直接關(guān)系到合成過(guò)程。離子交換樹(shù)脂主要是根據(jù)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)（如硝化、磺化、氯甲基化和胺化等）及高分子合成反應(yīng)（如聚合及縮合）的基本原理進(jìn)行合成的。離子交換劑的母體聚合物有苯乙烯、酚醛及丙烯酸等。常見(jiàn)的聚苯乙烯樹(shù)脂由苯乙烯聚合，再加入二乙稀交聯(lián)：（方程式1）插入附件1在這個(gè)母體上引進(jìn)功能基就得到各種離子交換樹(shù)脂，如制備強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂時(shí)，即將母體加以磺化：（方程式2）插入附件2制備強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂時(shí)，先

16、將母體甲基化后，再加以胺化，即得：（方程式3）插入附件3這里，樹(shù)脂中二乙烯苯的含量決定了樹(shù)脂的交聯(lián)度大小，應(yīng)盡量選用交聯(lián)度高些，而且有較高的交換容量的樹(shù)脂。樹(shù)脂交換容量的單位為毫克當(dāng)量/克（干樹(shù)脂）或者毫克當(dāng)量/毫升（濕樹(shù)脂）。測(cè)定樹(shù)脂的交換容量方法：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：首先，用氫氧化鈉溶液通過(guò)已轉(zhuǎn)型為氫型的樹(shù)脂，將H+替換出來(lái)，其反應(yīng)式： RSO3H+NaCl RSO3Na+HCl再用酸堿滴定法測(cè)定流出液中鹽酸的當(dāng)量數(shù)，即可計(jì)算交換容量，即：HCl+NaOHNaCl+H2O而測(cè)定陰離子交換樹(shù)脂交換容量的反應(yīng)則為：R4NOH+NaClR4NCl+NaOHNaOH+HClNaCl+H2O離子交換纖維

17、素是30年來(lái)廣泛用于分離純化蛋白質(zhì)的離子交換劑。目前常用的離子交換纖維素列于下表：（表1）目前常用的離子交換纖維素離子交換劑游離基團(tuán)結(jié)構(gòu)陰離子交換劑強(qiáng)堿性TEAEGEQAE-Sephadex弱堿性DEAEPAB中等堿性AEECTEOLADBDBNDPEL三乙基氨基乙基胍基乙基二乙基（2-羥丙基）季胺二乙基氨基乙基對(duì)氨基苯甲基氨基乙基三乙醇胺經(jīng)甘油和多聚甘油鏈偶聯(lián)于纖維素的混合基團(tuán)（混合胺類(lèi)）苯甲基化的DEAE纖維素苯甲基化萘?；腄EAE纖維素聚乙烯亞胺吸附于纖維素或較弱磷?；睦w維素-OCH2CH2N（C2H5）3 NH-OCH2CH2NHC-NH2-C2H4N+ (C2H5) 2 CH2C

18、HCH3 OH- OCH2CH2N（C2H5）2-OCH2CH2N H2陽(yáng)離子交換劑弱堿性CM中等酸性P強(qiáng)酸性SESP- Sephadex羧甲基磷酸磺酸乙基磺酸丙基-OCH2C OOH O-O-POH OH O-OCH2CH2-SOH O O-OC3H6-SOH O常用離子交換樹(shù)脂某些物理化學(xué)性質(zhì)表（表2）插入附件4 -1、2、3各類(lèi)常用離子交換樹(shù)脂型號(hào)對(duì)照表（表3）插入附件5離子交換介質(zhì)在純化步驟中的選擇（表4）插入附件6離子交換層析介質(zhì)的技術(shù)數(shù)據(jù) (表5) 插入附件71、2（四）凝膠層析（分子篩層析）凝膠層析（gel filtration）又稱(chēng)分子篩層析、排阻層析或凝膠滲透色譜，主要是根據(jù)

19、混合物中各種分子的分子量不同，通過(guò)固定相凝膠時(shí)，分子的擴(kuò)散速度各異，使大小不同的分子得到分離和純化。它不僅用于大分子物質(zhì)的分離，也可用于分子量測(cè)定以及蛋白質(zhì)樣品除鹽等。所謂凝膠是一類(lèi)具有三維空間多孔性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)。在洗脫過(guò)程中，分子量最大的物質(zhì)由于不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙而最先流出；分子量最小的物質(zhì)因能鉆入網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，而最后流出；分子量介于最大和最小之間的物質(zhì)，流出的順序在最大分子量物質(zhì)之后，而在最小分子量物質(zhì)之前。所以，各組分的洗脫順序與其分子量成正比。（圖6-0-4）插入附件8凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，是含有大量液體的柔軟而富于彈性的物質(zhì)。吸水量大于7.

20、5g/g的凝膠稱(chēng)軟膠，吸水量小于7.5g/g的凝膠稱(chēng)為硬膠。根據(jù)凝膠物質(zhì)的來(lái)源可分為天然凝膠和人工合成凝膠兩類(lèi)。、天然凝膠：主要是一些糖類(lèi)物質(zhì)，如淀粉、瓊脂及瓊脂糖等。淀粉凝膠應(yīng)用較早，但因其理化性質(zhì)不夠穩(wěn)定，洗脫時(shí)的阻力較大，洗脫時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)影響了它的應(yīng)用。瓊脂來(lái)源于一種海藻，是由D-半乳糖和L-半乳糖所組成的多聚糖。它能分離分子量較高的物質(zhì)。其缺點(diǎn)是帶有大量的電荷（主要是磺酸基，其次為羧基），層析時(shí)常需用較高離子強(qiáng)度的洗脫液，使洗脫物含有一定量鹽分，而影響產(chǎn)品的純度。瓊脂糖凝膠（sepharose）應(yīng)用較多，它又稱(chēng)生物凝膠（biogelA），由瓊脂糖溶液冷卻后，通過(guò)分子間氫鍵，自發(fā)凝集成束

21、，形成穩(wěn)定的珠狀凝膠。穩(wěn)定性較差，工作pH值范圍在49之間，40以上易老化，不能高壓和冰凍，其機(jī)械強(qiáng)度取決于瓊脂糖的含量。它有2B、4B、6B三個(gè)級(jí)別，含瓊脂糖的濃度分別為2%、4%、6%。Sepharose結(jié)構(gòu)開(kāi)放，排阻極限比Sephadex大，分離范圍廣泛，適用于DNA大片段分離。各種型號(hào)瓊脂糖凝膠的的性質(zhì)及生產(chǎn)廠(chǎng)商見(jiàn)下表。（表6）瓊脂糖凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù)名稱(chēng)、型號(hào)凝膠內(nèi)瓊脂糖%含量（W/ W）排阻的下限(Mr)分級(jí)分離的范圍（Mr）生產(chǎn)廠(chǎng)商Sagavac 10Sagavac 8Sagavac 6Sagavac 4Sagavac 21086422.5×1057×1052&#

22、215;10615×106150×1061×104 2.5×1052.5×104 7×1055×104 2×1062×105 15×1065×105 15×107Seravac Laboratories ,Maidenhead,EnglandBio-GelA-0.5MBio-GelA-1.5MBio-GelA-5MBio-GelA-15MBio-GelA-50MBio-GelA-150M10864210.5×1061.5×1065×10615&#

23、215;10650×106150×106<1×104 2.5×106<1×104 7×1061×104 2×1064×104 15×1061×105 15×106 1×106 15×106Bio-Pad Laboratories,California,U.S.A2、人工合成的凝膠：常用的有葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩大類(lèi)。葡聚糖凝膠又稱(chēng)交聯(lián)葡聚糖凝膠，英文名稱(chēng)為Dextrak，商品名稱(chēng)為Sephadex，由許多右旋葡萄糖單位通過(guò)1,6-糖苷鍵聯(lián)

24、結(jié)成鏈狀結(jié)構(gòu)，再由交聯(lián)劑1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷（CH2-CH-CH2CL，又稱(chēng)氯醇）交聯(lián)而形成多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子化合物。其基本結(jié)構(gòu)如圖： （ 圖5)插入附件9在合成凝膠時(shí)，調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的配比，可以獲得具有不同大小網(wǎng)眼的葡聚糖凝膠。G表示交聯(lián)度，G越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密，吸水性差，膨脹也小，適用于分離小分子物質(zhì)；G越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)疏松，吸水量大，適用分離大分子物質(zhì)。商品凝膠的型號(hào)采用“吸水量”的10倍數(shù)字表示，例如，每g凝膠吸水量為2.5g即定為G25型。各種型號(hào)葡聚糖凝膠的性質(zhì)見(jiàn)下表。（表7）各種型號(hào)葡聚糖凝膠的性質(zhì)型號(hào)分離范圍（分子量）吸水量g/g干凝膠膨脹體積ml/g干凝膠浸泡時(shí)間（小

25、時(shí)）蛋白質(zhì)多糖20-25090-1000G-10G15G25G50G75G100G150G200<700<15001000500015003000300070000400015000050004000005000800000<700<15001005000500100001000500001000100000100015000010002000001.0±.011.5±0.22.5±0.25.0±0.37.5±0.510±1.015±1.520±2.0232.53.5469111215152

26、02030304033332472727211113555 由上表可見(jiàn)，SephadexG值越大，吸水量越大，分離范圍（分子量）越大聚丙烯酰胺凝膠其商品名為生物凝膠P（Bio-Gel P），是用丙稀酰胺（acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺（N，Nmethylene bisacrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Bis）在催化劑的作用下聚合而成。其結(jié)構(gòu)式如下：（方程式4）張龍翔 P90聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：（1）化學(xué)聚合：催化劑多采用過(guò)硫酸銨（ammonium persulfare，AP）或過(guò)硫酸鉀，此外還需要一種脂肪族叔胺作為加速劑，最有效的加速劑為N，N，N，N四甲基

27、乙二胺（N，N，N，Ntetramethyl ethylenediamine，TEMED），其次為三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile,DMPN）。在叔胺的催化下，由過(guò)硫酸胺形成氧的自由基，后者又使單體形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。因?yàn)槭灏芬幱谧杂蓧A狀態(tài)下才有效，所以在低pH時(shí)，常會(huì)延遲聚合作用。分子氧阻止鏈的延長(zhǎng)，防礙聚合作用，一些金屬也能抑制聚合。冷卻可以使聚合速度變慢，通常控制這些因素使聚合在一小時(shí)內(nèi)完成，以便使凝膠的性質(zhì)穩(wěn)定。（2）光聚合：通常用核黃素作催化劑，不一定加TEMED即能聚合，但加入則可加速聚合。光聚合通常需要有痕量氧存在，核黃

28、素經(jīng)光解形成無(wú)色基，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合作用，但過(guò)量的氧會(huì)阻止鏈長(zhǎng)的增加，應(yīng)該避免過(guò)量的氧存在。光聚合通常用日光燈或普通鎢絲燈泡作光源，直接日光或室內(nèi)強(qiáng)散射光也可以。用核黃素進(jìn)行光聚合的優(yōu)點(diǎn)是：核黃素的用量很低（1mg/100ml）；通過(guò)光照可以預(yù)定聚合時(shí)間，但光聚合的凝膠孔較大，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變小，不太穩(wěn)定，所以用它制備大孔凝膠較適合?；瘜W(xué)聚合的凝膠孔徑較小，因而采用過(guò)硫酸胺TEMED催化系統(tǒng)制備小孔凝膠（分離膠），而且各次制備的重復(fù)性好。凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系：凝膠濃度與被分離物的分子量大小的關(guān)系，大至范圍如表：(表8) Mr范圍與凝膠濃度的關(guān)系Mr的范圍

29、適用的凝膠濃度% 蛋白質(zhì) <104 1 4×104 4×1041×105 1 5×105 >5×10520301520101551025 核酸 <104 104105 1052×106152051022.6 聚丙烯酰胺凝膠的機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性、透明、相對(duì)的化學(xué)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的，沒(méi)有吸附和電滲作用。原料成分要采用高純度制品，通過(guò)改變濃度和交聯(lián)度，可以控制孔徑變動(dòng)在極廣泛的范圍，并且制備凝膠的重復(fù)性好，由于純度高及不溶性，因此還適于少量樣品的制備，不致污染樣品。（表9）聚丙烯酰

30、胺凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù)型號(hào)排阻的下限（Mr）分級(jí)分離的范圍（Mr）膨脹后的床體積ml/g干凝膠所需最少時(shí)間（室溫，小時(shí)）Bio-gel-P-2Bio-gel-P-4Bio-gel-P-6Bio-gel-P-10Bio-gel-P-30Bio-gel-P-60Bio-gel-P-100Bio-gel-P-150Bio-gel-P-200Bio-gel-P-3001600360046001000030000600001000001500002000003000002002000500-40001000-50005000-1700020000-5000030000-7000040000-100000500

31300000100000-4000003.85.88.812.414.919.019.0 24.034.040.02-42-42-42-410-1210-1224244848下面幾張表列出凝膠層析介質(zhì)的一些性能指標(biāo)，供讀者參考。表10 各種凝膠所允許的最大操作壓凝膠建議的最大靜水壓（cmH2O）*SeohadexG-10G-15G-25G-50Seohadex G-75Seohadex G-100Seohadex G-150Seohadex G-200Bio-GelP-2P-4P-6P-10P-30P-60Bio-Gel-P-100Bio-Gel-P-150Bio

32、-Gel-P-200Bio-Gel-P-300Sepharose2B4BBio-GelA-0.5MA-1.5MA-5MBio-Gel A-15MBio-Gel A-50MBio-Gel A-150M100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)50(49.03 Pa)35(34.32 Pa)15(14.71 Pa)10(9.806 Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)60(58.83Pa)30(29.42Pa)20(19.61Pa)

33、15(14.71Pa)1*(0.9806Pa)1(0.9806Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)90(88.25Pa)50(49.03Pa)30(29.42Pa)* 每cm凝膠濃度 * 1 cmH2O=0.9806Pa（表11、）見(jiàn)附件10 （表12）見(jiàn)附件11-1、2下面介紹幾種染料的性能及染色原理：1、氨基黑10B（amino black 10B）C22H13O12N6S3Na3, Mr=715, max=620630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料。但用氨基黑染SDS-蛋白質(zhì)時(shí)效果不好。另外，氨基黑染

34、不同蛋白質(zhì)時(shí)的著色度不等、色調(diào)不一（有藍(lán)、黑、棕等），作同一凝膠柱的掃描時(shí)誤差較大，需要對(duì)各種蛋白質(zhì)作出本身的蛋白質(zhì)染料量（吸收值）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。（方程式5）插入分子式 張龍翔P912、考馬斯亮藍(lán)G250，又名Xylene brilliant cyanin G。比考馬斯亮藍(lán)R250多二個(gè)甲基。Mr=854, max=590610nm。染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。優(yōu)點(diǎn)在于它在二氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染色蛋白而幾乎無(wú)本底色。所以常用于需要重復(fù)性好和穩(wěn)定的染色，適于作定量分析。3、考馬斯亮藍(lán)R250（Coomassive brilliant blue R250），C45H44O7

35、N3S2Na, Mr=824, max=560590nm。染色靈敏度比氨基黑5倍，但蛋白質(zhì)濃度超出一定范圍時(shí)，對(duì)高濃度蛋白的染色不合乎Beer定律，用作定量分析時(shí)，要注意這點(diǎn)。（方程式6）插入分子式 張龍翔P924、1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalene sulfonic acid，ANS）本身無(wú)熒光，但與蛋白質(zhì)結(jié)合后則產(chǎn)生熒光。將凝膠放在此染料溶液浸13分鐘，用長(zhǎng)波紫外燈照射時(shí)，產(chǎn)生黃色熒光，可顯示蛋白質(zhì)100g，如果不明顯，可將凝膠取出暴露于空氣或鹽酸氣中，或浸沒(méi)在3mol/L鹽酸中幾秒至2分鐘，使表面蛋白質(zhì)稍變性，然后再用ANS染色，這樣可顯示蛋白質(zhì)20g

36、。這樣的染色優(yōu)點(diǎn)是可保留凝膠內(nèi)部的酶和抗體的活性?？蓪⒃搮^(qū)帶切下來(lái)進(jìn)行酶活力測(cè)定；也可直接把凝膠搗碎研細(xì)，用作抗原來(lái)注射動(dòng)物，聚丙稀酰胺不影響抗體的產(chǎn)生。（五）親和層析法：生物體中許多高分子化合物具有與某些對(duì)應(yīng)的專(zhuān)一分子可逆結(jié)合的特性，例如，酶、蛋白與輔酶，抗原與抗體、酶與酶抑制劑、激素與受體等體系，都具有這種特性。生物高分子與配體之間形成可解離的專(zhuān)一絡(luò)合物的能力稱(chēng)為親和力。根據(jù)這種具有親和力的生物高分子與配基間可逆性結(jié)合和解離的原理而建立的層析技術(shù)稱(chēng)為親和層析（affinity chromatography）。親和層析的優(yōu)點(diǎn)是：在溫和條件下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，效率高。親和層析在分離、純化的效率上

37、可以說(shuō)是最佳的方法。親和層析是由吸附層析發(fā)展起來(lái)的，它相對(duì)于建立在物理化學(xué)原理（如分子顆粒大小、分子帶電荷狀況等）的分離方法而言，可稱(chēng)為“生物專(zhuān)一吸附”的層析分離方法。在親和層析過(guò)程中，被分離的生物分子在一定條件下，有選擇性地即高度特異性地被結(jié)合到共價(jià)偶聯(lián)的不溶性載體的配基親和吸附劑上，然后改變?cè)袟l件，如選用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、底物、輔助因子，或采用不同pH的緩沖液、高濃度鹽，變性劑等，又可有選擇性地從親和吸附配基上把要分離的物質(zhì)洗脫下來(lái)。通過(guò)親和層析，被分離物質(zhì)的純度有時(shí)一次即可提高幾倍、十幾倍甚至幾百倍，活化回收率也是非常高的。親和層析法的基本過(guò)程如下：1、偶聯(lián)：將欲分離的高分子物質(zhì)X（如抗原

38、）的配基L（如抗體）在不影響其生物功能的情況下與水不溶性的載體相結(jié)合（稱(chēng)為固相化或固定化），制成親和吸咐劑或免疫吸附劑。2、裝柱：在層析柱內(nèi)裝入固相化的配基親和吸附劑（稱(chēng)為親和柱）。3、親和吸附：含有高分子物質(zhì)X的混合液（如粗勻漿提取液或血清等），在有利于配基和高分子之間形成復(fù)合物的條件下，進(jìn)入親和吸附劑的層析柱。混合液中只有能與配基形成復(fù)合物的高分子X(jué)被吸附，而所有不能形成復(fù)合物的雜質(zhì)則直接流出。親和柱進(jìn)一步用緩沖液洗滌，以盡可能地除去非親和吸附的物質(zhì)。4、洗脫：改變洗脫條件，促使親和吸附劑高分子復(fù)合物解離而釋放出高分子的物質(zhì)X，便得到欲純化的活性物質(zhì)。5、再生：將欲分離、純化的生物大分子從

39、親和吸附劑中洗脫的過(guò)程，就是再生的過(guò)程。再生后的親和吸附劑可直接用于又一周期的純化工作。用親和層析法分離大分子化合物可用下圖表示：（圖6、7）張龍翔P372從理論上說(shuō)，親和層析可以用來(lái)純化各種酶、抗原、抗體、維生素結(jié)合蛋白、傳遞蛋白、激素和藥物的受體、核酸、多酶系統(tǒng)以至完整的細(xì)胞。固定化的配基也可用來(lái)探討生物體內(nèi)大分子和配基間的作用方式。這種固相吸附劑還可作為生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能研究的工具。下面對(duì)親和層析法中的幾個(gè)需要注意的問(wèn)題進(jìn)行分析討論：首先，載體的選擇。使親和物一方固相化的水不溶性化合物稱(chēng)為載體。其應(yīng)具備下述特性：1、高度親水。使固相吸附劑易與水溶液中的生物高分子接近。2、惰性載體。載

40、體的非專(zhuān)一性吸附應(yīng)盡可能小。3、具有相當(dāng)量的化學(xué)基團(tuán)可供活化或化學(xué)改變。4、有較好的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性，能經(jīng)得起配基固定化和親和柱層析時(shí)可能采用的各種條件（如pH、離子強(qiáng)度、溫度、變性劑和去污劑）的影響。5、具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過(guò)，從而增加配基的有效濃度。6、有良好的機(jī)械性能，為使親和柱有較好的流速，載體最好是均一的珠狀顆粒。常用的載體有纖維素，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠。（表13）珠狀凝膠分離范圍珠狀凝膠分離范圍（Mr）瓊脂糖:Sephaarose 2BSephaarose 4BSephaarose 6B聚丙烯酰胺:Bio-gel-p-300Bio-gel-p-1

41、504×1073×1074×1065×1051.5×105其次，配基的選擇。作為理想的配基，它首先必須對(duì)欲純化的大分子具有很高的親和力。另外，小分子配基必須具備可修飾的功能基團(tuán)，通過(guò)這些基團(tuán)與載體形成共價(jià)鍵。這些共價(jià)鍵的形成應(yīng)不致嚴(yán)重地?fù)p害配基與欲純化蛋白質(zhì)的親合力，用于親和層析的配基有酶的底物類(lèi)似物、效應(yīng)物、酶的輔助因子及抗體（或抗原）等。第三，幾種類(lèi)型的免疫吸附劑。把抗原或抗體用共價(jià)鍵或其它方式連接在固相載體上，用以分離和純化相應(yīng)的抗體或抗原的方法稱(chēng)為免疫吸附法，固相化的抗原或抗體稱(chēng)為免疫吸附劑，根據(jù)載體的性質(zhì)不同，配基和載體的連接方式大體

42、可分為三種類(lèi)型。1、使配基吸附在某些載體的表面。常用的載體有皂土、玻璃粉（或微球）、石英粉、羥基磷灰石、氧化鋁、硬脂酸鋇等。其優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，條件溫和。其缺點(diǎn)：吸附不穩(wěn)定而影響被分離物質(zhì)的純度。2、使配基網(wǎng)絡(luò)在某些載體化合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。常用的載體有聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠等。此方法使用的條件也很溫和；只要凝膠的交聯(lián)度和配基分子大小選配合適，就可得到效果很好的免疫吸附劑。3、使配基通過(guò)共價(jià)鍵和載體結(jié)合。常用的載體有瓊脂糖、纖維素交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺及多孔玻璃等，此種方法適用于大分子化合物及小分子化合物。由于與載體化學(xué)的結(jié)合，因此增強(qiáng)了配基對(duì)pH、離子強(qiáng)度及溫度耐受力。它也是目

43、前親和層析方法中最廣泛采用的一種類(lèi)型。4、使用偶聯(lián)劑直接把配基的許多分子彼此連接起來(lái)。這樣的偶聯(lián)劑有戊二醛、氯甲酸乙酯，乙基丁烯二酸酐，環(huán)已基碳二亞胺等。但如果條件掌握不好，很易引起生物大分子的失活。第四、親和層析條件的選擇1、吸附：生物大分子的親和純化最好采用柱層析法。親和柱所用的平衡緩沖液其組成、pH和離子強(qiáng)度都應(yīng)選擇配基與生物大分子之間的作用最強(qiáng)、最有利于形成復(fù)合物的條件。上柱的樣品應(yīng)該溶于親和柱的平衡緩沖液中，并在上柱前對(duì)緩沖液透析平衡。2、洗滌：樣品通過(guò)親和柱后，連續(xù)用大量緩沖液洗去無(wú)親和力的生物大分子，且還常用不同的緩沖液洗滌，這樣可進(jìn)一步除去非專(zhuān)一吸附的物質(zhì)，而在親和柱上只留下有

44、專(zhuān)一作用的親和物。3、洗脫：洗脫正好與吸附相反，所選取的條件應(yīng)該能減弱純化對(duì)象與吸附柱之間的相互作用，使得復(fù)合物完全解離。通過(guò)改變緩沖液的條件，如改變pH、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑的濃度等，有選擇性地從載體上把被分離物洗脫下來(lái)。4、親和柱的再生：當(dāng)洗脫結(jié)束后，連續(xù)用大量洗脫劑徹底洗滌親和柱，然后再用平衡緩沖液使親和柱充分平衡，經(jīng)過(guò)這樣處理，親和柱可反復(fù)使用。下面各表列出一些親和層析介質(zhì)的技術(shù)數(shù)據(jù)，供讀者參閱。（表14）張龍翔P503507（十三）親和層析介質(zhì)的技術(shù)數(shù)據(jù)16。綜上所述，五種層析技術(shù)在分離各種化合物時(shí)各有其優(yōu)越之處，也有不足之處。因此，應(yīng)根據(jù)具體分離化合物的種類(lèi)及要求，選擇不同的層析方法

45、及層析介質(zhì)，以達(dá)到迅速、準(zhǔn)確地分離目的。現(xiàn)就如何選擇層析介質(zhì)，列表如下，供讀者參閱。（表15）張龍翔P497（七）如何選擇層析介質(zhì)。 P498按純化步驟選擇層析介質(zhì)。（表16）二、比色和分光分析法（孔德娟）（一）原理光線(xiàn)的本質(zhì)是電磁波的一種，有與電磁波和X線(xiàn)類(lèi)同的性質(zhì)。光線(xiàn)有不同的波長(zhǎng)，肉眼可見(jiàn)彩色光稱(chēng)為可見(jiàn)光，波長(zhǎng)范圍在400750nm，小于400nm的光線(xiàn)稱(chēng)為紫外線(xiàn)，大于750nm的光線(xiàn)稱(chēng)為紅外線(xiàn)，如表所示。（表17）見(jiàn)書(shū)P19 當(dāng)光線(xiàn)通過(guò)透明溶液介質(zhì)時(shí)，其輻射能量一部分被吸收，一部分被透過(guò)，所以光線(xiàn)射出溶液介質(zhì)之后，光能減少。例如，可見(jiàn)光通過(guò)有色溶液介質(zhì)后，或紅外線(xiàn)通過(guò)多種氣體后均被吸收

46、部分光能。這種光能的吸收和透過(guò)可用于某些物質(zhì)的定量分析。 分光分析所依據(jù)的定律是Lambert 和Beer定律1. Lambert 式定律：一束單色光通過(guò)透明溶液介質(zhì)時(shí)，光能被吸收一部分，被吸收光能的量與溶液介質(zhì)厚度有一定比例關(guān)系。見(jiàn)圖6-0-8 即： dI 1 dI 1 = - adl 將此式積分得： = - adl I 10 I 10I=I0eal(1)式式中I0 為入射光強(qiáng)度 I為通過(guò)溶液介質(zhì)后的光強(qiáng)度 l 為溶液介質(zhì)的厚度 為自然對(duì)數(shù)的底2.718 a 為溶液介質(zhì)的吸收系數(shù)（1）式可改寫(xiě)為: I0Ln = al（2）式 I（2）式換算成常用對(duì)數(shù)式， 即： I0Ln ×0.43

47、43=0.4343×al I I010g =0.4343×al I I0 則 10g = kl（3）式 I式中K為吸光系數(shù)。2. Beer 定律： 以溶液中溶質(zhì)濃度的變化代替溶液厚度的改變，光能的吸收與濃度改變有類(lèi)同的關(guān)系。即一束單色光通過(guò)溶液介質(zhì)時(shí)，光波被溶液介質(zhì)吸收一部分，吸收多少與溶液中溶液介質(zhì)濃度有一定比例關(guān)系。依據(jù)Lambert 氏定律中同樣的推導(dǎo)，可得出下式： I0 10g kc(4)式 I式中c為溶液介質(zhì)的濃度。Lambert 定律與Beer定律合并， 即(3) 和(4) 式合并為： I0 10g = kcl(5)式I I0 I0令A(yù)=10g T= I ， I

48、 則 A=kcl （6）式 A=-10T式中A 為 光密度（又稱(chēng)吸光度）， T為透光度。（6）式為L(zhǎng)ambert-Beer定律的物理表示式，其含義為：一束單色光通過(guò)溶液后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。 （二）光電比色法 利用溶液的顏色深淺來(lái)測(cè)定溶液中物質(zhì)含量的方法，稱(chēng)為比色法。用光電池和檢流計(jì)代替眼睛進(jìn)行比色分析，又稱(chēng)光電比色法。光電比色法測(cè)定的條件是在可見(jiàn)光范圍，并要求測(cè)定為有色物，或經(jīng)過(guò)一定的化學(xué)處理使無(wú)色的測(cè)定物質(zhì)變成有色化合物或者使其所處的溶液變成有色液，與經(jīng)同樣處理的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液在光電比色計(jì)上進(jìn)行比色，求出各自的光密度（吸光度），經(jīng)計(jì)算即可求出被測(cè)物的含量

49、。 比色分析較常見(jiàn)的儀器為光電比色計(jì)和分光光度計(jì)。（三）分光光度法采用適當(dāng)?shù)墓庠?、棱鏡和適當(dāng)?shù)墓庠唇邮芷鳌？墒菇橘|(zhì)濃度測(cè)定范圍不僅僅局限于可見(jiàn)光，尚可擴(kuò)大到紫外光區(qū)和紅外光區(qū)。經(jīng)單色器（棱鏡）得到的光源雖說(shuō)不是純的單色光，但波長(zhǎng)范圍更狹窄，也更符合Lambert-Beer定律，使靈敏度大為提高。 以不同波長(zhǎng)的單色光作為入射光，測(cè)定某一介質(zhì)溶液的光密度。然后以入射光的不同波長(zhǎng)為橫軸，各相應(yīng)的光密度為縱軸作圖，可得到溶液介質(zhì)的吸收光譜曲線(xiàn)。不同的物質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)不同，其吸收曲線(xiàn)也有其特殊形狀，許多動(dòng)、植物組織中所含組分用化學(xué)方法不易分離，此組分可借助于分光光度法測(cè)定出不同的光譜曲線(xiàn)，用于確定幾種組分

50、的性質(zhì)和含量，此法的優(yōu)點(diǎn)是光電比色法不可 比擬的。由于分光光度計(jì)波長(zhǎng)范圍較大（2001000nm） ,故既可用于可見(jiàn)光，也可用于紫外光或紅外光的分光測(cè)定。又由于分光光度法可利用物質(zhì)特有的吸光譜曲線(xiàn)進(jìn)行定性定量，因此，測(cè)定物質(zhì)既可為有色物，也可是無(wú)色物，從而使測(cè)定手續(xù)簡(jiǎn)化，標(biāo)本用量也可減少。 目前，學(xué)生實(shí)驗(yàn)室多用722型或UV-9100型分光光度計(jì)，其基本結(jié)構(gòu)如圖 所示： （圖6-0-9） 圖9 722型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖此儀器的最大特點(diǎn)為受光器不是光電池,而是光電管。光電管的陰極表面（光電面）有一層對(duì)光靈敏的物質(zhì)，當(dāng)光射到光電管后，會(huì)發(fā)射出光電子，此光電子向陽(yáng)極移動(dòng)，形成光電流。光電管靈敏度

51、雖比光電池小，但經(jīng)光電管出來(lái)的光電流可以放大，而經(jīng)光電池出來(lái)的光電流不易放大，并且光電池易疲乏，故較高級(jí)的分光光度計(jì)均采用光電管作為出射光線(xiàn)受光器。722型分光光度計(jì)的使用方法：接通電源, 打開(kāi)比色箱蓋，使檢流計(jì)指針處于”0”位，預(yù)熱10分鐘，用波長(zhǎng)調(diào)節(jié)器選用所需的波長(zhǎng)。將空白或?qū)φ找杭皽y(cè)定液分別裝入比色杯內(nèi)，擦干后置于比色盒中，再放入比色箱內(nèi)，放妥蓋好。此時(shí)空白溶液對(duì)在光路上，光電管感光。旋轉(zhuǎn)光量調(diào)節(jié)器，使檢流計(jì)指針正確地指在透光度“100%”或光密度“0”上。輕輕拉動(dòng)比色槽滑桿，使其他比色杯依次處于光路上，同時(shí)光密度。使用時(shí)可根據(jù)不同波長(zhǎng)、光量分別選用放大器靈敏度擋，使空白液能很好地用光量調(diào)節(jié)器使光密度調(diào)整到“0”。其靈敏度范圍是 第一擋×1倍，第二擋×10倍，第三擋×20倍。（四）計(jì)算1利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算被測(cè)物含量：用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物與測(cè)定管同樣處理，讀取光密度，再根據(jù)（6）式計(jì)算： A1=k1c1l1 A2=k2c2l2式中A1、 A2 分別為已知濃度標(biāo)準(zhǔn)管和未知濃度測(cè)定管光密度。C1 、c2 分