3[1].水產(chǎn)微生物學(xué)與免疫學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)

1、水產(chǎn)微生物學(xué)與免疫學(xué)水產(chǎn)微生物學(xué)與免疫學(xué)2011年年3月月聯(lián)系電話：聯(lián)系電話13078553720Email：v第一章第一章 緒論緒論v第二章第二章 細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)v第三章第三章 病毒學(xué)基礎(chǔ)病毒學(xué)基礎(chǔ)v第四章第四章 其它類型微生物其它類型微生物v第五章第五章 免疫學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)基礎(chǔ)v第六章第六章 水生動(dòng)物病原水生動(dòng)物病原水產(chǎn)微生物學(xué)與免疫學(xué)水產(chǎn)微生物學(xué)與免疫學(xué)教學(xué)內(nèi)容教學(xué)內(nèi)容第一節(jié)第一節(jié) 病毒概述病毒概述第二節(jié)第二節(jié) 病毒結(jié)構(gòu)病毒結(jié)構(gòu)第三節(jié)第三節(jié) 病毒增殖病毒增殖第四節(jié)第四節(jié) 病毒致病病毒致病第五節(jié)第五節(jié) 病毒鑒定病毒鑒定第六節(jié)第六節(jié) 噬菌體和亞病毒噬菌體和亞病

2、毒第三章第三章 病毒學(xué)基礎(chǔ)病毒學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)第一節(jié) 病毒概述病毒概述一一. 人們對(duì)病毒的認(rèn)識(shí)過(guò)程人們對(duì)病毒的認(rèn)識(shí)過(guò)程二二. 病毒的概念和特點(diǎn)病毒的概念和特點(diǎn)三三. 病毒與其他微生物的區(qū)別病毒與其他微生物的區(qū)別墨墨西西哥哥流流感感疫疫情情 一、一、人們對(duì)病毒的認(rèn)識(shí)過(guò)程人們對(duì)病毒的認(rèn)識(shí)過(guò)程18921892：俄國(guó)：俄國(guó) 伊萬(wàn)諾夫斯基伊萬(wàn)諾夫斯基 首次發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒的感染因子能通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器。首次發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒的感染因子能通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器。18981898：荷蘭：荷蘭 貝哲林克貝哲林克 證實(shí)該致病因子可以被乙醇從懸液中證實(shí)該致病因子可以被乙醇從懸液中沉淀沉淀下來(lái)而不失去其感染性下來(lái)而不失去其感染性 但

3、用培養(yǎng)細(xì)菌的方法培養(yǎng)不出來(lái)；給這樣的病原體起名叫但用培養(yǎng)細(xì)菌的方法培養(yǎng)不出來(lái)；給這樣的病原體起名叫virusvirus。19351935：美國(guó)：美國(guó) 斯壇萊斯壇萊 從煙草花葉病病葉中提取出了病毒結(jié)晶，從煙草花葉病病葉中提取出了病毒結(jié)晶，又證實(shí)又證實(shí)了結(jié)晶中含核酸和了結(jié)晶中含核酸和 蛋白質(zhì)兩種成分，而只有核蛋白質(zhì)兩種成分，而只有核酸具酸具感染和復(fù)制能力，并因此而獲得諾貝爾獎(jiǎng)。感染和復(fù)制能力，并因此而獲得諾貝爾獎(jiǎng)。19521952：HersheyHershey和和ChaseChase證實(shí)噬菌體的遺傳物質(zhì)僅僅是證實(shí)噬菌體的遺傳物質(zhì)僅僅是DNADNA，開創(chuàng)了病毒分子生物學(xué)。，開創(chuàng)了病毒分子生物學(xué)。19

4、711971后：后： 陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各種亞病毒陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各種亞病毒類病毒、朊病毒和擬病毒類病毒、朊病毒和擬病毒。煙煙草草花花葉葉病病毒毒二、病毒的概念和特點(diǎn)二、病毒的概念和特點(diǎn)( (一一) )病毒的概念：病毒的概念： 是指一類體積極小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、只有一種核酸類型、只能在活的敏感細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型微生物。豬流感病毒豬流感病毒(50000倍倍) (二二) 病毒的特點(diǎn)病毒的特點(diǎn)：1. 1. 體積微小，能通過(guò)細(xì)菌濾器，需用體積微小，能通過(guò)細(xì)菌濾器，需用EMEM才能觀察到；才能觀察到；2. 2. 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不具有細(xì)胞形態(tài)，屬非細(xì)胞型微生物；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不具有細(xì)胞形態(tài)，屬非細(xì)胞型微生物；3. 3.

5、 主要成分為蛋白質(zhì)和核酸，且只有一種核酸：主要成分為蛋白質(zhì)和核酸，且只有一種核酸：RNARNA或或DNADNA；4. 4. 專性寄生，依靠宿主細(xì)胞的合成系統(tǒng)進(jìn)行增殖；專性寄生，依靠宿主細(xì)胞的合成系統(tǒng)進(jìn)行增殖；5. 5. 離體時(shí)能以無(wú)生命狀態(tài)存在，可保持其感染性；離體時(shí)能以無(wú)生命狀態(tài)存在，可保持其感染性；6. 6. 對(duì)一般抗生素不敏感，對(duì)干擾素敏感。對(duì)一般抗生素不敏感，對(duì)干擾素敏感。電子顯微鏡電子顯微鏡 三、病毒與其他微生物的比較三、病毒與其他微生物的比較 敏 感 性微 生 物種 類 結(jié) 構(gòu)在 無(wú) 活 細(xì)胞 的 培 養(yǎng)基 中 生 長(zhǎng)二 等 分 裂繁 殖核 酸 類 型 核 糖 體抗 生 素干 擾

6、素細(xì) 菌原 核 細(xì) 胞 型+DNA，RNA+-支 原 體原 核 細(xì) 胞 型+DNA，RNA+-立 克 次 體原 核 細(xì) 胞 型-+DNA，RNA+-衣 原 體原 核 細(xì) 胞 型-+DNA，RNA+-螺 旋 體原 核 細(xì) 胞 型-（+）+DNA，RNA+-真 菌真 核 細(xì) 胞 型+出芽、產(chǎn)生孢子DNA，RNA+-病 毒非 細(xì) 胞 型-DNA 或 RNA-+本節(jié)學(xué)習(xí)要點(diǎn)：本節(jié)學(xué)習(xí)要點(diǎn)： 1. 病毒的概念。 2. 病毒的特點(diǎn)病毒的特點(diǎn)。 3. 病毒與其他 微生物區(qū)別。一一. . 病毒的大小病毒的大小二二. . 病毒的形態(tài)病毒的形態(tài)三三. . 病毒的結(jié)構(gòu)病毒的結(jié)構(gòu)四四. . 病毒的組分病毒的組分第二節(jié)

7、第二節(jié) 病毒結(jié)構(gòu)病毒結(jié)構(gòu)第二節(jié)第二節(jié) 病毒結(jié)構(gòu)病毒結(jié)構(gòu)測(cè)定大小的單位是納米（nm，109)多數(shù)病毒的直徑在100nm以下；絕大多數(shù)病毒是能通過(guò)細(xì)菌濾器；須用電鏡才能觀察到其具體形態(tài)和大小。一、病毒的大小一、病毒的大小二、病毒的形態(tài)二、病毒的形態(tài) 病毒粒子的形態(tài)多種多樣，其中以球形或近球形多見，也有桿狀、絲狀、彈狀、磚形及蝌蚪形等。Sizes and Shapes of Viruses (Animal RNA Viruses)小RNA病毒 呼腸孤病毒 披膜病毒 正粘病毒冠狀病毒 副粘病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒 彈狀病毒Sizes and Shapes of Viruses (Animal DNA Viru

8、ses) 乳多空病毒 腺病毒 皰疹病毒HIVHSVTMV病毒大小與形態(tài)的研究方法病毒大小與形態(tài)的研究方法(1)(1)電子顯微鏡法：電子顯微鏡法：超薄切片或直接負(fù)染，電鏡下觀察其形態(tài)并測(cè)量其大小；(2)(2)超濾膜過(guò)濾法：超濾膜過(guò)濾法：通過(guò)不同孔徑的濾膜過(guò)濾，可估計(jì)病毒的大??；(3)(3)超速離心法：超速離心法：通過(guò)超速離心，測(cè)得其沉降系數(shù)，可計(jì)算病毒大小；(4)(4)電離輻射與電離輻射與X X線衍射法：線衍射法：主要用于研究病毒粒子的亞單位結(jié)構(gòu)等。電子顯微鏡電子顯微鏡 超濾系統(tǒng)超濾系統(tǒng)超速離心機(jī)超速離心機(jī)三、病毒的結(jié)構(gòu)三、病毒的結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)輔助結(jié)構(gòu)輔助結(jié)構(gòu)病病毒毒核芯(core)衣殼(

9、capsid)核衣殼(nucleocapsid)囊膜或包膜(membrane or envelope)其他輔助結(jié)構(gòu)，如腺病毒衣殼上觸 須樣纖維( (一一) )病毒的基本結(jié)構(gòu)病毒的基本結(jié)構(gòu)Enveloped Viruscapsidcapsid corecoreenvelopespikespikeNaked VirusNaked VirusCapsomere or capsomerTransmission Electron Micrograph of HIV-1 The nucleocapsid (arrows) can be seen within the envelope. 豬繁殖與呼吸綜合征

10、病毒結(jié)構(gòu)豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu) ( (二二) )病毒的對(duì)稱性病毒的對(duì)稱性三類典型形態(tài)的三類典型形態(tài)的病毒病毒廿面體對(duì)稱廿面體對(duì)稱的的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)( (球狀球狀) ) 螺旋對(duì)稱螺旋對(duì)稱的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)( (桿狀桿狀) ) 復(fù)合對(duì)稱復(fù)合對(duì)稱的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)( (蝌蚪狀蝌蚪狀) ) 五鄰體六鄰體二十面體對(duì)稱型病毒(1)二十面體對(duì)稱型病毒(2)Tobacco Mosaic Virus螺旋對(duì)稱型病毒(1)DNA或RNA殼粒螺旋對(duì)稱型病毒(2)T4 Bacteriophage復(fù)合對(duì)稱型病毒四、病毒的組分四、病毒的組分 病毒的主要成分為核酸病毒的主要成分為核酸(DNA(DNA或或RNA)RNA)和蛋白質(zhì)；有的病毒還

11、和蛋白質(zhì)；有的病毒還含有脂質(zhì)、糖類等其他組分。含有脂質(zhì)、糖類等其他組分。1 1、病毒的核酸、病毒的核酸一種病毒只含有一種核酸（一種病毒只含有一種核酸（DNA或或RNA）。）。 植物病毒絕大多數(shù)含植物病毒絕大多數(shù)含DNA；少數(shù)含；少數(shù)含RNA； 動(dòng)物病毒一部分含動(dòng)物病毒一部分含DNA，一部分含，一部分含RNA； 細(xì)菌病毒普遍含細(xì)菌病毒普遍含DNA，含，含RNA的極少。的極少。病毒的核酸類型極為多樣化：病毒的核酸類型極為多樣化： 病毒的病毒的DNA與與RNA均有單鏈和雙鏈：均有單鏈和雙鏈： dsDNA或或ssDNA， dsRNA或或ssRNA 病毒病毒DNA分子有分子有線狀線狀和和環(huán)狀環(huán)狀之分。之

12、分。病毒核酸還有病毒核酸還有正鏈正鏈()和和負(fù)鏈負(fù)鏈()的區(qū)分：的區(qū)分： 規(guī)定：將堿基序列與規(guī)定：將堿基序列與mRNA一致的核酸單鏈定為一致的核酸單鏈定為正鏈正鏈；將堿基序列與；將堿基序列與mRNA互補(bǔ)的核酸單鏈定為互補(bǔ)的核酸單鏈定為負(fù)鏈負(fù)鏈。因此，病毒核酸有以下因此，病毒核酸有以下6 種類型：種類型： () DNA大部分大部分DNA病毒病毒 () RNA動(dòng)物呼腸孤病毒動(dòng)物呼腸孤病毒 （）（）DNA 大腸桿菌大腸桿菌 X174噬菌體噬菌體 （）（）RNA所有單鏈所有單鏈RNA病毒病毒 （）DNA腺病毒腺病毒 （）RNA 流感病毒流感病毒 有的病毒只有一種蛋白質(zhì)，多數(shù)含有幾種蛋白質(zhì)。有的病毒只有

13、一種蛋白質(zhì)，多數(shù)含有幾種蛋白質(zhì)。 病毒蛋白質(zhì)的氨基酸組成與其他生物一樣，但不同病毒蛋白質(zhì)的氨基病毒蛋白質(zhì)的氨基酸組成與其他生物一樣，但不同病毒蛋白質(zhì)的氨基酸組成和含量各不相同。酸組成和含量各不相同。 病毒蛋白質(zhì)主要在構(gòu)成病毒的結(jié)構(gòu)、侵染與增殖過(guò)程中發(fā)揮作用。病毒蛋白質(zhì)主要在構(gòu)成病毒的結(jié)構(gòu)、侵染與增殖過(guò)程中發(fā)揮作用。2. 2. 病毒的蛋白質(zhì)病毒的蛋白質(zhì)病毒衣殼的功能：病毒衣殼的功能：A. 保護(hù)核酸免受核酸酶及理化因素的破壞；B. 具有與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)； 無(wú)囊膜病毒衣殼蛋白，能參與病毒的吸附、進(jìn)入，決定病毒的宿主嗜性。C. 衣殼蛋白具有良好的抗原性，能誘發(fā)宿主機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫

14、。 病毒的衣殼：病毒的衣殼：是由大量的同一的衣殼蛋白單體分子即蛋白亞基(protein subunit)以次級(jí)鍵結(jié)合構(gòu)成。3. 病毒的脂質(zhì)與糖類 主要構(gòu)成病毒的囊膜囊膜(membrane or envelope) 某些病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)成熟過(guò)程中，以出芽方式穿過(guò)核膜和或胞質(zhì)膜、空泡膜等釋放到宿主細(xì)胞外時(shí)，獲得的一種宿主細(xì)胞脂質(zhì)成分。 病毒的囊膜與其他生物膜相似，也是一種脂質(zhì)雙層膜；在囊膜形成時(shí)，宿主細(xì)胞的膜蛋白被病毒的囊膜蛋白取代。 在病毒囊膜的表面，常有一些向外凸出的突起，成為刺突(spike)。囊膜的功能：囊膜的功能： A. 病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜具有一定的同源性，易于親和與融合，輔助病毒的感

15、染作用；病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜具有一定的同源性，易于親和與融合，輔助病毒的感染作用； B. 病毒囊膜為脂質(zhì)雙層膜，對(duì)脂溶劑敏感，可作為鑒定病毒的一個(gè)指標(biāo)；病毒囊膜為脂質(zhì)雙層膜，對(duì)脂溶劑敏感，可作為鑒定病毒的一個(gè)指標(biāo)； C. 病毒囊膜蛋白能與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒的吸附與穿入；病毒囊膜蛋白能與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒的吸附與穿入； D. 病毒囊膜蛋白具有良好的抗原性，可刺激宿主機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答；病毒囊膜蛋白具有良好的抗原性，可刺激宿主機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答； E. 病毒囊膜蛋白還具有凝集動(dòng)物紅細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞融合等特性。病毒囊膜蛋白還具有凝集動(dòng)物紅細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞融合等特性。本節(jié)學(xué)習(xí)要點(diǎn)： 1

16、. 病毒的大小與形態(tài)。 2. 研究病毒大小與形態(tài)的方法。 3. 病毒的基本結(jié)構(gòu)與對(duì)稱性。 4. 病毒核酸的特點(diǎn)與類型 5. 病毒衣殼的功能。 6. 病毒囊膜的本質(zhì)與功能。第三節(jié)第三節(jié) 病毒增殖病毒增殖一、病毒增殖的特點(diǎn)與方式一、病毒增殖的特點(diǎn)與方式二、病毒的增殖過(guò)程二、病毒的增殖過(guò)程 (一) 吸附和穿入(adsorption and penetration) (二) 脫殼(uncoating) (三) 生物合成(biosynthesis) (四) 裝配與釋放(assembly and release)三、病毒的異常增殖現(xiàn)象三、病毒的異常增殖現(xiàn)象四、病毒增殖的干擾現(xiàn)象與干擾素四、病毒增殖的干擾現(xiàn)

17、象與干擾素一、病毒增殖的特點(diǎn)及方式一、病毒增殖的特點(diǎn)及方式 1. 1. 病毒增殖的特點(diǎn)病毒增殖的特點(diǎn) 隱蔽期隱蔽期 增殖期增殖期 無(wú)囊膜病毒：抑制宿主細(xì)胞的增殖，裂解釋放 有囊膜病毒：和宿主細(xì)胞共同增殖，“出牙”釋放 腫瘤病毒：整合到宿主細(xì)胞基因組，可傳到下一代 2. 2. 病毒增殖的方式病毒增殖的方式 自我復(fù)制自我復(fù)制X射線拍照的病毒射線拍照的病毒 二、病毒的增殖過(guò)程二、病毒的增殖過(guò)程 (一) 吸附和穿入(adsorption and penetration) (二) 脫殼(uncoating) (三) 生物合成(biosynthesis) (四) 裝配與釋放(assembly and re

18、lease)(一一) Adsorption and Penetration1. 病毒的吸附病毒的吸附(Adsorption) (1) 靜電吸附靜電吸附: 可逆，非特異的。在可逆，非特異的。在pH7時(shí)，病毒與宿主細(xì)胞均帶負(fù)時(shí)，病毒與宿主細(xì)胞均帶負(fù)電荷，不易接觸，但有電荷，不易接觸，但有Ca2+和和Mg2+等陽(yáng)離子的存在時(shí)，可降低負(fù)電荷，等陽(yáng)離子的存在時(shí)，可降低負(fù)電荷，促進(jìn)靜電吸附。促進(jìn)靜電吸附。 (2) 特異性吸附：特異性吸附：病毒與易感細(xì)胞上特異性受體相結(jié)合。病毒與易感細(xì)胞上特異性受體相結(jié)合。HIVHIV的吸附現(xiàn)象的吸附現(xiàn)象 2. 病毒的穿入病毒的穿入(Penetration) (1) 膜融合

19、：病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，將其內(nèi)部組分釋放 到細(xì)胞質(zhì)中，如HIV、NDV等艾滋病病毒的膜融合現(xiàn)象艾滋病病毒的膜融合現(xiàn)象 (2) 胞吞作用：多數(shù)病毒按此方式侵入；宿主細(xì)胞對(duì)流感病毒的胞吞現(xiàn)象宿主細(xì)胞對(duì)流感病毒的胞吞現(xiàn)象(3) 完整病毒穿過(guò)細(xì)胞膜的完整病毒穿過(guò)細(xì)胞膜的移位方式，如腺病毒（二）（二）uncoating噬菌體胞外脫殼噬菌體胞外脫殼2流感病毒的脫殼現(xiàn)象流感病毒的脫殼現(xiàn)象（三）（三） Biosynthesis病毒核酸復(fù)制病毒核酸復(fù)制1、病毒核酸的復(fù)制、病毒核酸的復(fù)制病毒核酸鏈接入寄主核酸鏈病毒核酸鏈接入寄主核酸鏈2 2、病毒核酸的轉(zhuǎn)錄、病毒核酸的轉(zhuǎn)錄l含含DNADNA的病毒的病毒: :D

20、NAmRNADNAmRNAl+DNA+DNA病毒病毒:+DNA:+DNADNAmRNADNAmRNAl含含RNARNA病毒病毒: :RNAmRNARNAmRNAl含含+RNA+RNA病毒病毒:+RNA:+RNARNAmRNARNAmRNAl含含-RNA-RNA病毒病毒:-RNA:-RNAmRNAmRNA艾滋病病毒艾滋病病毒(HIV)的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄 3 3、病毒蛋白的合成、病毒蛋白的合成（四）（四） assembly and release 噬菌體噬菌體大腸桿菌死亡并破裂，釋放出里面的病大腸桿菌死亡并破裂，釋放出里面的病毒，新一代病毒開始新的生命旅程毒，新一代病毒開始新的生命旅程2、病毒的釋放、病

21、毒的釋放( release )病病毒毒的的增增殖殖過(guò)過(guò)程程脊脊髓髓灰灰質(zhì)質(zhì)炎炎病病毒毒的的增增殖殖過(guò)過(guò)程程皰疹病毒的復(fù)制過(guò)程三、病毒的異常增殖現(xiàn)象三、病毒的異常增殖現(xiàn)象不完全復(fù)制不完全復(fù)制: : 可以合成部分或全部病毒成分，但不能正常裝配。缺陷病毒缺陷病毒(defective virus )： 基因組不完整的病毒體缺陷干擾顆粒缺陷干擾顆粒(defective interfering particles, DIP)：指缺陷病毒不能復(fù)制，但卻能 干擾同種成熟病毒進(jìn)入細(xì)胞。天然缺陷病毒：天然缺陷病毒：腺病毒伴隨病毒頓挫感染頓挫感染(abortive infection)：細(xì)胞條件不合適，病毒進(jìn)入細(xì)胞

22、但不能復(fù)制。腺腺病病毒毒伴伴隨隨病病毒毒四、病毒增殖的干擾現(xiàn)象與干擾素四、病毒增殖的干擾現(xiàn)象與干擾素 1. 病毒增殖的干擾現(xiàn)象病毒增殖的干擾現(xiàn)象 當(dāng)兩種病毒同時(shí)感染同一細(xì)胞時(shí)，一種病毒的增殖可抑制了另一種病毒增殖。 產(chǎn)生原因： (1) 有干擾素(interferon，IFN)的存在； (2) 第一種病毒改變了細(xì)胞表面共用受體結(jié)構(gòu)； (3) 第一種病毒改變了細(xì)胞代謝途徑； (4) 第一種病毒抑制第二種病毒mRNA的轉(zhuǎn)譯(interferon，IFN)本節(jié)學(xué)習(xí)要點(diǎn)：本節(jié)學(xué)習(xí)要點(diǎn)： 1. 病毒增殖的特點(diǎn)。 2. 病毒增殖的基本過(guò)程。病毒增殖的基本過(guò)程。 3. 病毒的異常增殖現(xiàn)象。 4. 干擾素的概念

23、和作用。第四節(jié)第四節(jié) 病毒致病病毒致病一、病毒的細(xì)胞培養(yǎng)一、病毒的細(xì)胞培養(yǎng)二、病毒與細(xì)胞的相互作用二、病毒與細(xì)胞的相互作用三、病毒的致病機(jī)制三、病毒的致病機(jī)制一、病毒的細(xì)胞培養(yǎng)一、病毒的細(xì)胞培養(yǎng) SPF動(dòng)物或動(dòng)物或SPF雞胚，仍常用于培養(yǎng)病毒，但病毒的細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展最快，雞胚，仍常用于培養(yǎng)病毒，但病毒的細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展最快，重點(diǎn)介紹。重點(diǎn)介紹。 細(xì)胞細(xì)胞(包括組織器官包括組織器官)培養(yǎng)法培養(yǎng)法雞胚培養(yǎng)法雞胚培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培養(yǎng)法常見的病毒培養(yǎng)方法有常見的病毒培養(yǎng)方法有 1、病毒細(xì)胞培養(yǎng)、病毒細(xì)胞培養(yǎng) 概念概念：將適宜組織中的細(xì)胞分散，在培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，再接種病毒，讓病毒在細(xì)將適宜組

24、織中的細(xì)胞分散，在培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，再接種病毒，讓病毒在細(xì)胞中繁殖來(lái)培養(yǎng)病毒的方法。胞中繁殖來(lái)培養(yǎng)病毒的方法。用途用途：用于病毒學(xué)研究，如用于病毒學(xué)研究，如病毒病毒分離、病毒克隆純化、病毒病診斷及疫苗制備等。分離、病毒克隆純化、病毒病診斷及疫苗制備等。特點(diǎn)特點(diǎn)：一致性好，材料易得，易標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)，可重復(fù)性好。：一致性好，材料易得，易標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)，可重復(fù)性好。 可通過(guò)細(xì)胞病變判定病毒感染，也可結(jié)合免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒?？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞病變判定病毒感染，也可結(jié)合免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒。2、細(xì)胞培養(yǎng)類型、細(xì)胞培養(yǎng)類型 (1) 原代細(xì)胞原代細(xì)胞 動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶等消化、分散，獲得單個(gè)細(xì)胞懸液，再生長(zhǎng)

25、于培養(yǎng)器皿中。制備原代動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶等消化、分散，獲得單個(gè)細(xì)胞懸液，再生長(zhǎng)于培養(yǎng)器皿中。制備原代細(xì)胞，腎和睪丸最為常用，以來(lái)源于細(xì)胞，腎和睪丸最為常用，以來(lái)源于SPF胚胎或幼畜組織的細(xì)胞為好。胚胎或幼畜組織的細(xì)胞為好。 (2)傳代細(xì)胞系傳代細(xì)胞系 在體外培養(yǎng)液中可無(wú)限制分裂傳代的細(xì)胞。一般來(lái)源于腫瘤組織。有已建立的很多傳代細(xì)在體外培養(yǎng)液中可無(wú)限制分裂傳代的細(xì)胞。一般來(lái)源于腫瘤組織。有已建立的很多傳代細(xì)胞系，如胞系，如Hel6(人子宮癌細(xì)胞人子宮癌細(xì)胞)、Vero(非洲綠猴腎細(xì)胞非洲綠猴腎細(xì)胞)、PK-15(豬腎細(xì)胞豬腎細(xì)胞)等。等。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：傳代及培養(yǎng)方便，使用廣泛。傳代及培養(yǎng)方便，使

26、用廣泛。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：對(duì)有的病毒不敏感；傳代日久易被霉形體污染或?qū)τ械牟《静幻舾校粋鞔站靡妆幻剐误w污染或 病毒隱性感染；有致腫瘤的潛在危險(xiǎn)病毒隱性感染；有致腫瘤的潛在危險(xiǎn)豬甲狀腺細(xì)胞原代培養(yǎng)豬甲狀腺細(xì)胞原代培養(yǎng) C6:大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤成纖維細(xì)胞大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤成纖維細(xì)胞3、細(xì)胞培養(yǎng)的方法、細(xì)胞培養(yǎng)的方法 最常用的方法為最常用的方法為靜置培養(yǎng)靜置培養(yǎng)及及旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。還可用。還可用懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)或或微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)技術(shù)等。技術(shù)等。 (1) 靜置培養(yǎng)靜置培養(yǎng)：將消化分散的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶將消化分散的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶(管管)或培養(yǎng)板或培養(yǎng)板(孔孔)，封閉，靜置于恒溫，封閉，靜置于恒溫

27、箱內(nèi)，數(shù)天后細(xì)胞可生成貼壁的單層細(xì)胞。如用細(xì)胞培養(yǎng)板，一般需培養(yǎng)在含箱內(nèi)，數(shù)天后細(xì)胞可生成貼壁的單層細(xì)胞。如用細(xì)胞培養(yǎng)板，一般需培養(yǎng)在含5的的CO2條件條件下。哺乳動(dòng)物及禽類的細(xì)胞培養(yǎng)溫度一般為下。哺乳動(dòng)物及禽類的細(xì)胞培養(yǎng)溫度一般為37。 (2) 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：與靜置培養(yǎng)相同，不同之處是要培養(yǎng)的細(xì)胞不斷緩慢旋轉(zhuǎn)與靜置培養(yǎng)相同，不同之處是要培養(yǎng)的細(xì)胞不斷緩慢旋轉(zhuǎn)(5-10rpm)，經(jīng)過(guò)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，細(xì)胞可在培養(yǎng)瓶一段時(shí)間，細(xì)胞可在培養(yǎng)瓶(管管)的四壁長(zhǎng)滿單層。此法的產(chǎn)量高，適用于疫苗生產(chǎn)。的四壁長(zhǎng)滿單層。此法的產(chǎn)量高，適用于疫苗生產(chǎn)。靜置培養(yǎng)靜置培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) (3) 懸浮培養(yǎng)懸浮

28、培養(yǎng)：通過(guò)攪拌使細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，井補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和校正通過(guò)攪拌使細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，井補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和校正pH，使之生長(zhǎng)或維持存，使之生長(zhǎng)或維持存活。適用某些不需貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞系，如活。適用某些不需貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞系，如NS1(一種骨髓瘤細(xì)胞系一種骨髓瘤細(xì)胞系) 。 (4) 微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)：是在懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合微載體的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。微載體是直徑是在懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合微載體的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。微載體是直徑35-100um微小顆粒，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，細(xì)胞可貼附其上長(zhǎng)成單層。由于微載體數(shù)量較大，所獲得的微小顆粒，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，細(xì)胞可貼附其上長(zhǎng)成單層。由于微載體數(shù)量較大，所獲得的細(xì)胞數(shù)也比上述常規(guī)方法增加，

29、用于規(guī)?；?xì)胞或疫苗生產(chǎn)。細(xì)胞數(shù)也比上述常規(guī)方法增加，用于規(guī)?；?xì)胞或疫苗生產(chǎn)。懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)二、病毒與細(xì)胞的相互作用二、病毒與細(xì)胞的相互作用 病毒與宿主細(xì)胞之間作用的表現(xiàn)形式各異。病毒基因往往能誘導(dǎo)、模病毒與宿主細(xì)胞之間作用的表現(xiàn)形式各異。病毒基因往往能誘導(dǎo)、模擬或封閉宿主細(xì)胞的功能。反之，宿主細(xì)胞防御系統(tǒng)也能封閉病毒的增殖。擬或封閉宿主細(xì)胞的功能。反之，宿主細(xì)胞防御系統(tǒng)也能封閉病毒的增殖。 1、病毒與細(xì)胞相互作用的類型、病毒與細(xì)胞相互作用的類型 宿主細(xì)胞感染病毒發(fā)生的變化有宿主細(xì)胞感染病毒發(fā)生的變化有殺細(xì)胞反應(yīng)殺細(xì)胞反應(yīng)非殺細(xì)胞反應(yīng)非殺細(xì)胞反應(yīng)細(xì)胞死亡細(xì)胞死亡：殺細(xì)胞

30、、細(xì)胞病變、細(xì)胞裂解殺細(xì)胞、細(xì)胞病變、細(xì)胞裂解生產(chǎn)性變化生產(chǎn)性變化：細(xì)胞存活、允許病毒增殖、分泌釋放細(xì)胞存活、允許病毒增殖、分泌釋放非生產(chǎn)性變化非生產(chǎn)性變化：細(xì)胞存活、阻斷病毒復(fù)制細(xì)胞存活、阻斷病毒復(fù)制轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：病毒基因與細(xì)胞基因整合，可致腫瘤病變病毒基因與細(xì)胞基因整合，可致腫瘤病變具體表現(xiàn)為具體表現(xiàn)為細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解2 2、病毒引致的殺細(xì)胞變化、病毒引致的殺細(xì)胞變化 某些病毒接種培養(yǎng)的單層細(xì)胞后，第一輪感染產(chǎn)生的子代病毒將蔓延感染某些病毒接種培養(yǎng)的單層細(xì)胞后，第一輪感染產(chǎn)生的子代病毒將蔓延感染鄰近的細(xì)胞，最終感染所有細(xì)胞。感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱之為鄰近的細(xì)胞，最終感染所有細(xì)胞。感染導(dǎo)致的細(xì)胞損

31、傷稱之為細(xì)胞病變細(xì)胞病變(CPE)。CPE可在光學(xué)顯微鏡下觀察，是病毒學(xué)檢測(cè)及研究的常規(guī)手段之一。通常用可在光學(xué)顯微鏡下觀察，是病毒學(xué)檢測(cè)及研究的常規(guī)手段之一。通常用CPE作為指標(biāo)來(lái)判定病毒的毒力，即計(jì)算病毒的半數(shù)細(xì)胞感染量作為指標(biāo)來(lái)判定病毒的毒力，即計(jì)算病毒的半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。 細(xì)胞病變細(xì)胞病變(CPE)包括包括涉及細(xì)胞膜的涉及細(xì)胞膜的CPE（細(xì)胞膜融合）、（細(xì)胞膜融合）、涉及細(xì)胞骨架的涉及細(xì)胞骨架的CPE、病毒引致的細(xì)胞凋亡與壞死病毒引致的細(xì)胞凋亡與壞死 。正常細(xì)胞正常細(xì)胞CPE3、空斑形成、空斑形成 將將1010倍梯度稀釋的病毒樣本接種吸附于倍梯度稀釋的病毒樣本接種吸附于單

32、層細(xì)胞單層細(xì)胞，而后在細(xì)胞上覆蓋一層，而后在細(xì)胞上覆蓋一層含營(yíng)養(yǎng)液的瓊脂含營(yíng)養(yǎng)液的瓊脂，以防止游離的病毒通過(guò)營(yíng)養(yǎng)液擴(kuò)散，但病毒可在細(xì)胞間傳遞。以防止游離的病毒通過(guò)營(yíng)養(yǎng)液擴(kuò)散，但病毒可在細(xì)胞間傳遞。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)，進(jìn)行染色，原先感染病毒的細(xì)胞及病毒擴(kuò)散的周圍細(xì)胞會(huì)經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)，進(jìn)行染色，原先感染病毒的細(xì)胞及病毒擴(kuò)散的周圍細(xì)胞會(huì)形成一個(gè)近似圓形的斑點(diǎn)，類似固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，稱為形成一個(gè)近似圓形的斑點(diǎn)，類似固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，稱為空斑或蝕斑空斑或蝕斑（細(xì)胞病變）。（細(xì)胞病變）。 一個(gè)空斑可能由一個(gè)以上病毒顆粒感染所致，因此可將獲得的單個(gè)空斑一個(gè)空斑可能由一個(gè)以上病毒顆粒感染所致，因此

33、可將獲得的單個(gè)空斑制作懸液，梯度稀釋后再作空斑，最終可獲得只含一個(gè)病毒顆粒及其子代的制作懸液，梯度稀釋后再作空斑，最終可獲得只含一個(gè)病毒顆粒及其子代的空斑，這就是空斑，這就是病毒克隆病毒克隆。借助空斑技術(shù)不僅可。借助空斑技術(shù)不僅可純化病毒純化病毒，還對(duì)病毒定量，定，還對(duì)病毒定量，定量單位稱為量單位稱為空斑形成單位空斑形成單位(PFU)。 通過(guò)通過(guò)PFUPFU計(jì)數(shù)及計(jì)數(shù)及PFUPFU減數(shù)試驗(yàn)，可滴定血清效價(jià)、測(cè)定干擾素活性等。減數(shù)試驗(yàn)，可滴定血清效價(jià)、測(cè)定干擾素活性等。通過(guò)通過(guò)PFU計(jì)數(shù)及計(jì)數(shù)及PFU減數(shù)試驗(yàn)減數(shù)試驗(yàn)4 4、包涵體、包涵體 包涵體包涵體是某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，可

34、通過(guò)固定染色后在是某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，可通過(guò)固定染色后在光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)。包涵體光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)。包涵體位置位置(核內(nèi)或胞漿核內(nèi)或胞漿)、數(shù)量數(shù)量(單個(gè)或多個(gè)單個(gè)或多個(gè))、大小大小(較大或較較大或較小小)、形態(tài)形態(tài)(圓形或無(wú)規(guī)律形態(tài)圓形或無(wú)規(guī)律形態(tài))和和染色性染色性嗜酸嗜酸(伊染成粉紅色染成粉紅色)或或嗜堿嗜堿(蘇木精染成藍(lán)蘇木精染成藍(lán)色色)，因病毒的種類而異，可用于診斷。，因病毒的種類而異，可用于診斷。巨細(xì)胞病毒包涵體狂犬病毒包涵體 5、病毒引致的非殺細(xì)胞變化、病毒引致的非殺細(xì)胞變化 非殺細(xì)胞病毒的感染通常引致持續(xù)感染，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝并無(wú)大礙，非殺細(xì)胞病毒的感染通常引致

35、持續(xù)感染，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝并無(wú)大礙，但同時(shí)還生產(chǎn)并釋放子代病毒顆粒。除少數(shù)例外，大多持續(xù)感染的細(xì)胞發(fā)生但同時(shí)還生產(chǎn)并釋放子代病毒顆粒。除少數(shù)例外，大多持續(xù)感染的細(xì)胞發(fā)生慢性漸進(jìn)性變化，最終死亡慢性漸進(jìn)性變化，最終死亡。 6、病毒的干擾現(xiàn)象、病毒的干擾現(xiàn)象 主要是由干擾素介導(dǎo)。主要是由干擾素介導(dǎo)。 干擾素并無(wú)病毒特異性干擾素并無(wú)病毒特異性，例如副粘病毒感染誘導(dǎo)的干擾素對(duì)披膜病毒，例如副粘病毒感染誘導(dǎo)的干擾素對(duì)披膜病毒感染完全有效。干擾素在分泌部位或經(jīng)循環(huán)至全身。通常在病毒感染早期感染完全有效。干擾素在分泌部位或經(jīng)循環(huán)至全身。通常在病毒感染早期即在第一批子代病毒釋放之時(shí)產(chǎn)生于從而對(duì)相鄰細(xì)胞及機(jī)體產(chǎn)

36、生保護(hù)作用。即在第一批子代病毒釋放之時(shí)產(chǎn)生于從而對(duì)相鄰細(xì)胞及機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。病毒與宿主細(xì)胞相互作用的結(jié)果可引致宿主的臨床和病理變化。病毒與宿主細(xì)胞相互作用的結(jié)果可引致宿主的臨床和病理變化。三、三、 病毒的致病機(jī)制病毒的致病機(jī)制病毒對(duì)組織器官包括免疫器官等的損傷病毒對(duì)組織器官包括免疫器官等的損傷宿主對(duì)病毒入侵產(chǎn)生的相應(yīng)變化宿主對(duì)病毒入侵產(chǎn)生的相應(yīng)變化 病毒對(duì)動(dòng)物的致病機(jī)制包病毒對(duì)動(dòng)物的致病機(jī)制包括括 (1)對(duì)宿主組織和器官的直接損傷對(duì)宿主組織和器官的直接損傷 某些殺細(xì)胞性病毒對(duì)細(xì)胞直接損傷引致機(jī)體的臨床癥狀和病理變化。某些殺細(xì)胞性病毒對(duì)細(xì)胞直接損傷引致機(jī)體的臨床癥狀和病理變化。 1、病毒感染對(duì)

37、寄主組織器官的損傷、病毒感染對(duì)寄主組織器官的損傷 病毒致病的嚴(yán)重程度與其在組織細(xì)胞引致的病變程度并無(wú)直接關(guān)系。病毒致病的嚴(yán)重程度與其在組織細(xì)胞引致的病變程度并無(wú)直接關(guān)系。病毒引起的細(xì)胞和組織損傷是否會(huì)產(chǎn)生臨床疾病因器官而異。病毒引起的細(xì)胞和組織損傷是否會(huì)產(chǎn)生臨床疾病因器官而異。 對(duì)呼吸道上皮的損傷：對(duì)呼吸道上皮的損傷： 呼吸道病毒最初入侵并損傷上皮細(xì)胞，逐步損壞呼吸道粘膜的保護(hù)層，呼吸道病毒最初入侵并損傷上皮細(xì)胞，逐步損壞呼吸道粘膜的保護(hù)層，暴露出越來(lái)越多的上皮細(xì)胞。感染后期當(dāng)上皮細(xì)胞損壞時(shí)，纖毛停止擺動(dòng)。暴露出越來(lái)越多的上皮細(xì)胞。感染后期當(dāng)上皮細(xì)胞損壞時(shí)，纖毛停止擺動(dòng)。呼吸道表面上皮的退化性

38、變化非常迅速，但能迅速再生。呼吸道表面上皮的退化性變化非常迅速，但能迅速再生。 對(duì)消化道上皮的損傷：對(duì)消化道上皮的損傷： 病毒對(duì)消化道的感染多數(shù)呈潛伏期短，沒(méi)有任何前驅(qū)癥狀。輪狀病毒病毒對(duì)消化道的感染多數(shù)呈潛伏期短，沒(méi)有任何前驅(qū)癥狀。輪狀病毒等感染后相鄰腸絨毛有時(shí)發(fā)生融合，腸道吸收面積減少，導(dǎo)致腸腔中粘液等感染后相鄰腸絨毛有時(shí)發(fā)生融合，腸道吸收面積減少，導(dǎo)致腸腔中粘液積累并腹瀉。細(xì)小病毒感染損傷分化中的腸腺上皮。積累并腹瀉。細(xì)小病毒感染損傷分化中的腸腺上皮。 (2) 無(wú)組織器官損傷時(shí)所致的病理變化無(wú)組織器官損傷時(shí)所致的病理變化 某些病毒感染引起的某些病毒感染引起的損傷不明顯損傷不明顯，感染細(xì)胞

39、仍能低效地執(zhí)行正?；虻停腥炯?xì)胞仍能低效地執(zhí)行正?；虻陀谡＜?xì)胞功能，不表現(xiàn)臨床癥狀，但此時(shí)喪失了系統(tǒng)自身平衡必需的特于正常細(xì)胞功能，不表現(xiàn)臨床癥狀，但此時(shí)喪失了系統(tǒng)自身平衡必需的特定功能，導(dǎo)致機(jī)體定功能，導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂功能紊亂。 (3) 易致細(xì)胞繼發(fā)感染的組織和器官損傷易致細(xì)胞繼發(fā)感染的組織和器官損傷 某些病毒感染，還易使動(dòng)物發(fā)生繼發(fā)感染。如馬發(fā)生流感時(shí)，使某些病毒感染，還易使動(dòng)物發(fā)生繼發(fā)感染。如馬發(fā)生流感時(shí)，使鏈球菌和其他細(xì)菌侵入肺，引發(fā)肺炎，而細(xì)菌分泌的蛋白酶又能裂解鏈球菌和其他細(xì)菌侵入肺，引發(fā)肺炎，而細(xì)菌分泌的蛋白酶又能裂解病毒的血凝素，激活病毒的感染；輪狀病毒和冠狀病毒感染易使腸道

40、病毒的血凝素，激活病毒的感染；輪狀病毒和冠狀病毒感染易使腸道發(fā)生大腸桿菌的繼發(fā)感染，導(dǎo)致嚴(yán)重的腹瀉。發(fā)生大腸桿菌的繼發(fā)感染，導(dǎo)致嚴(yán)重的腹瀉。 2、病毒的持續(xù)性感染、病毒的持續(xù)性感染 多數(shù)病毒感染都有程度不等的慢性表現(xiàn)，如犬瘟熱病毒感染的某多數(shù)病毒感染都有程度不等的慢性表現(xiàn)，如犬瘟熱病毒感染的某些犬在急性疾病階段結(jié)束后，病毒在他內(nèi)能數(shù)月或數(shù)年持續(xù)存在，引些犬在急性疾病階段結(jié)束后，病毒在他內(nèi)能數(shù)月或數(shù)年持續(xù)存在，引起某些器官的遲發(fā)性病理變化。病毒的持續(xù)感染在急性癥狀轉(zhuǎn)輕或轉(zhuǎn)起某些器官的遲發(fā)性病理變化。病毒的持續(xù)感染在急性癥狀轉(zhuǎn)輕或轉(zhuǎn)化為亞臨床后，還可引起輕微的慢性疾病?；癁閬喤R床后，還可引起輕微的

41、慢性疾病。 (1) 持續(xù)性感染的類型持續(xù)性感染的類型 持續(xù)性感染引起宿主的疾病復(fù)發(fā)，并能引致免疫病理疾病，還與腫瘤持續(xù)性感染引起宿主的疾病復(fù)發(fā)，并能引致免疫病理疾病，還與腫瘤的形成有關(guān)。病毒能在經(jīng)免疫的動(dòng)物體內(nèi)以持續(xù)性感染的方式存活，成為的形成有關(guān)。病毒能在經(jīng)免疫的動(dòng)物體內(nèi)以持續(xù)性感染的方式存活，成為傳染源，具有流行病學(xué)上的重要性。傳染源，具有流行病學(xué)上的重要性。 病毒持續(xù)性感染可分為三種類型：病毒持續(xù)性感染可分為三種類型： 持續(xù)性感染持續(xù)性感染：發(fā)病或不發(fā)病，：發(fā)病或不發(fā)病，感染后持續(xù)排毒感染后持續(xù)排毒，可發(fā)生免疫病理病或腫瘤病。，可發(fā)生免疫病理病或腫瘤病。 潛伏感染潛伏感染：又名隱性感染，

42、除非激活，一般：又名隱性感染，除非激活，一般并不能發(fā)現(xiàn)感染性病毒并不能發(fā)現(xiàn)感染性病毒。 慢性感染慢性感染：傳染性病毒在一個(gè)很長(zhǎng)的臨床前階段：傳染性病毒在一個(gè)很長(zhǎng)的臨床前階段逐漸增多逐漸增多，最終導(dǎo)致緩慢、，最終導(dǎo)致緩慢、漸漸 進(jìn)性致死疾病進(jìn)性致死疾病。 3. 病毒感染對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷病毒感染對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷 病毒可感染免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，感染細(xì)胞的類型因病毒的種類而異。病病毒可感染免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，感染細(xì)胞的類型因病毒的種類而異。病毒感染免疫細(xì)胞導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的損傷，從而加重疾病，或使宿主易于再感毒感染免疫細(xì)胞導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的損傷，從而加重疾病，或使宿主易于再感染另一種病毒，后者稱為雙重感染。染另一種病

43、毒，后者稱為雙重感染。本節(jié)學(xué)習(xí)要點(diǎn)：本節(jié)學(xué)習(xí)要點(diǎn)： 1. 細(xì)胞培養(yǎng)的概念、類型和方法； 2. 病毒與細(xì)胞相互作用的類型； 3. CPE、空斑與包涵體的概念、空斑與包涵體的概念； 4. 病毒的致病機(jī)制。第五節(jié)第五節(jié) 病毒鑒定病毒鑒定一、病料的采集與運(yùn)送一、病料的采集與運(yùn)送二、病毒的培養(yǎng)二、病毒的培養(yǎng)三、病毒的純化三、病毒的純化四、病毒的鑒定四、病毒的鑒定一、病料的采集與運(yùn)送一、病料的采集與運(yùn)送v從動(dòng)物體內(nèi)存在病毒最多的器官或組織采取病料。從動(dòng)物體內(nèi)存在病毒最多的器官或組織采取病料。v注意采集病料的時(shí)間，以癥狀剛出現(xiàn)時(shí)為佳。注意采集病料的時(shí)間，以癥狀剛出現(xiàn)時(shí)為佳。v檢查抗體時(shí)，則采取發(fā)病初期和恢復(fù)

44、期血清，以了解抗體滴度的變化。檢查抗體時(shí)，則采取發(fā)病初期和恢復(fù)期血清，以了解抗體滴度的變化。v保存與運(yùn)送，由于病毒對(duì)外界因素特別是很敏感，因此，必須放在保護(hù)液中，保存與運(yùn)送，由于病毒對(duì)外界因素特別是很敏感，因此，必須放在保護(hù)液中，并在低溫下保存或寄送。并在低溫下保存或寄送。v收集病料必須無(wú)菌操作，如有污染，可用通過(guò)濾器、加抗生素或高速離心法收集病料必須無(wú)菌操作，如有污染，可用通過(guò)濾器、加抗生素或高速離心法除去細(xì)菌，方可使用。除去細(xì)菌，方可使用。動(dòng)物接種動(dòng)物接種雞胚接種雞胚接種組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)三大培養(yǎng)方法三大培養(yǎng)方法器官培養(yǎng)移植培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) 二、病毒的培養(yǎng)二、病毒的培養(yǎng)

45、 1010日齡雞胚結(jié)構(gòu)日齡雞胚結(jié)構(gòu)雞胚接種雞胚接種 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 原代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)三、病毒的純化三、病毒的純化 是從病毒感染的宿主機(jī)體組織、體液、分泌物或病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中提取病毒粒子、除去非病毒成分的過(guò)程。 沉淀法沉淀法層析法層析法紅細(xì)胞吸附法紅細(xì)胞吸附法電泳法電泳法超速離心法超速離心法超濾法超濾法純化病毒方法純化病毒方法超濾系統(tǒng)超濾系統(tǒng)超速離心機(jī)超速離心機(jī)二、病毒的鑒定1 1、病毒的鑒定方法、病毒的鑒定方法 可通過(guò)以下方法確證病毒的存在： 形態(tài)學(xué)觀察 檢查包涵體 細(xì)胞病變 檢測(cè)某病毒抗原或特異性抗體2、病毒的鑒定過(guò)程、病毒的鑒定過(guò)程(1) 對(duì)病毒宿主

46、范圍及感染表現(xiàn)進(jìn)行鑒定 病毒一般都有自己相當(dāng)專一的宿主范圍和感染表現(xiàn)。(2) 對(duì)病毒的理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定 病毒大小與形態(tài)、核酸類型、對(duì)理化因子的敏感性。(3) 對(duì)病毒的血細(xì)胞凝集性質(zhì)進(jìn)行鑒定 病毒血凝譜及溫度、酸堿度對(duì)血凝特性的影響。(4) 對(duì)抗病毒血清或病毒抗原進(jìn)行鑒定 沉淀試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、ELISA、中和試驗(yàn)等。(5) 對(duì)病毒的核酸或基因進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定 PCR鑒定、PAGE電泳、核酸酶切分析與序列測(cè)定等。(1) 病毒感染單位病毒感染單位(IU) 能夠引起宿主細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的病毒最小劑量能夠引起宿主細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的病毒最小劑量(2) 病毒效價(jià)或毒力病毒效價(jià)或毒力 指單位體積病毒懸液

47、的感染單位數(shù)目指單位體積病毒懸液的感染單位數(shù)目(3) 半數(shù)致死量半數(shù)致死量(LD50)(4) 半數(shù)感染劑量半數(shù)感染劑量(ID50)(5) 半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量(TCID50)3、病毒的定量指標(biāo)、病毒的定量指標(biāo)本節(jié)學(xué)習(xí)要點(diǎn)：本節(jié)學(xué)習(xí)要點(diǎn)： 1. 病毒感染病料的采集與送檢； 2. 病毒的培養(yǎng)方法； 3. 病毒的純化方法； 4. 病毒的鑒定方法、鑒定過(guò)程與定量指標(biāo)。第六節(jié)第六節(jié) 噬菌體和亞病毒噬菌體和亞病毒一、噬菌體一、噬菌體(bacteriophage, phage) 病毒種類很多，根據(jù)病毒寄生的對(duì)象可分：病毒種類很多，根據(jù)病毒寄生的對(duì)象可分： 植物病毒植物病毒 動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒

48、微生物病毒微生物病毒 噬菌體：噬菌體：是病毒中的一種，一般把侵染是病毒中的一種，一般把侵染細(xì)菌、放線菌的病毒叫噬菌體細(xì)菌、放線菌的病毒叫噬菌體(把侵染真菌的把侵染真菌的病毒叫噬真菌體病毒叫噬真菌體)。 噬菌體在自然界廣泛存在，噬菌體在自然界廣泛存在，1995年共報(bào)年共報(bào)道了道了4000余種。余種。 ( (一一) ) 噬菌體的結(jié)構(gòu)噬菌體的結(jié)構(gòu)以以大腸桿菌大腸桿菌T4噬菌體噬菌體為例為例頭部：頭部：廿面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，由蛋白廿面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，由蛋白 質(zhì)衣殼構(gòu)成，內(nèi)含一條質(zhì)衣殼構(gòu)成，內(nèi)含一條DNADNA。頸部：頸部：薄盤狀，附頸須。薄盤狀，附頸須。尾鞘尾鞘：長(zhǎng)長(zhǎng)95nm, 95nm, 衣殼粒螺旋對(duì)衣殼粒螺

49、旋對(duì) 稱；可伸縮。稱；可伸縮。 尾髓尾髓: :中空，中空，DNADNA可由此進(jìn)入細(xì)胞?？捎纱诉M(jìn)入細(xì)胞?；寤? : 六角形盤狀物，其上有刺六角形盤狀物，其上有刺 突、尾絲。突、尾絲。刺突刺突: : 有吸附功能。有吸附功能。尾絲尾絲: : 有識(shí)別吸附功能。有識(shí)別吸附功能。大腸桿菌大腸桿菌T4T4噬菌體構(gòu)造噬菌體構(gòu)造( (二二) ) 噬菌體的類型噬菌體的類型根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系，可分為：根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系，可分為： 烈性噬菌體烈性噬菌體(virulent phase)： 指感染宿主細(xì)胞后，能夠使宿主細(xì)胞裂解的噬菌體指感染宿主細(xì)胞后，能夠使宿主細(xì)胞裂解的噬菌體. 溫和噬菌體溫和噬菌體(tem

50、perate phase)： 噬菌體感染細(xì)胞后，將其核酸整合到宿主核噬菌體感染細(xì)胞后，將其核酸整合到宿主核DNA上，上， 并隨宿主并隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行復(fù)制，在一般情況下，不的復(fù)制而進(jìn)行復(fù)制，在一般情況下，不 引起寄主細(xì)胞裂解的噬菌體。引起寄主細(xì)胞裂解的噬菌體。1、烈性噬菌體、烈性噬菌體(virulent phase) 烈性噬菌體的繁殖過(guò)程一般分為五個(gè)階段：烈性噬菌體的繁殖過(guò)程一般分為五個(gè)階段： 即即吸附、侵入、復(fù)制、裝配和釋放吸附、侵入、復(fù)制、裝配和釋放。 將少量烈性噬菌體與大量宿主細(xì)胞混合后，將此混合液與將少量烈性噬菌體與大量宿主細(xì)胞混合后，將此混合液與4545左右的瓊脂培養(yǎng)基左右的瓊

51、脂培養(yǎng)基(1%)(1%)在培養(yǎng)皿中充分混勻，然后倒入含底層瓊脂培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中充分混勻，然后倒入含底層瓊脂培養(yǎng)基(2%)(2%)的平板培養(yǎng)，經(jīng)數(shù)小的平板培養(yǎng)，經(jīng)數(shù)小時(shí)至?xí)r至1010余小時(shí)后，在平板表面布滿宿主細(xì)胞的菌苔上，可以用肉眼看到一個(gè)個(gè)透余小時(shí)后，在平板表面布滿宿主細(xì)胞的菌苔上，可以用肉眼看到一個(gè)個(gè)透亮不長(zhǎng)菌的小圓斑亮不長(zhǎng)菌的小圓斑, ,即即噬菌斑噬菌斑(plaque)。 一個(gè)噬菌斑一般由一個(gè)噬菌體形成，可用于檢測(cè)、分離和純化噬菌體。一個(gè)噬菌斑一般由一個(gè)噬菌體形成，可用于檢測(cè)、分離和純化噬菌體。 若將噬菌體按一定倍數(shù)稀釋，通過(guò)噬菌斑計(jì)數(shù)，可測(cè)知一定體積內(nèi)的噬菌斑形成若將噬菌體按一定倍數(shù)稀

52、釋，通過(guò)噬菌斑計(jì)數(shù)，可測(cè)知一定體積內(nèi)的噬菌斑形成單位單位(plaque forming units, pfu(plaque forming units, pfu) )數(shù)目，即噬菌體的數(shù)量。數(shù)目，即噬菌體的數(shù)量。噬菌斑噬菌斑(plaque)噬菌斑噬菌斑(plaque)溫和噬菌體溫和噬菌體(temperate phase)： 指一些噬菌體感染細(xì)胞后，將其核酸整合指一些噬菌體感染細(xì)胞后，將其核酸整合(附著附著)到宿主的核到宿主的核DNA上，并且可上，并且可以隨宿主以隨宿主DNA的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，在一般情況下，不引起寄主細(xì)胞裂解。的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，在一般情況下，不引起寄主細(xì)胞裂解。原噬菌體或前

53、噬菌體原噬菌體或前噬菌體(prophase)： 即整合在宿主核即整合在宿主核DNA上噬菌體的核酸。上噬菌體的核酸。 溶原性細(xì)菌溶原性細(xì)菌(lysogenic bacterium)： 指在核染色體上整合有原噬菌體的細(xì)菌。可進(jìn)行正常生長(zhǎng)繁殖指在核染色體上整合有原噬菌體的細(xì)菌。可進(jìn)行正常生長(zhǎng)繁殖,而不被裂解。而不被裂解。2 2、溫和噬菌體與溶源性細(xì)菌、溫和噬菌體與溶源性細(xì)菌溶原性細(xì)菌的特點(diǎn)：溶原性細(xì)菌的特點(diǎn)： 可穩(wěn)定遺傳：可穩(wěn)定遺傳：子代細(xì)菌都含有子代細(xì)菌都含有原噬菌體，均具有溶原性。原噬菌體，均具有溶原性。 可自發(fā)裂解：可自發(fā)裂解：溫和噬菌體的核酸也可從宿主溫和噬菌體的核酸也可從宿主DNA上脫落下上脫落下 來(lái)，恢復(fù)原來(lái)的狀態(tài)，進(jìn)行大量的復(fù)