基于Staphylococcus_省略_縮酶在大腸桿菌合成稀有酮糖的研究_李子杰pdf

1、研究報(bào)告DOI: 10 13995 / j cnki 11 1802 / ts 201508002基于 Staphylococcus carnosus 來源的 D-果糖-1，6-二磷酸 醛縮酶在大腸桿菌合成稀有酮糖的研究*李子杰，賀貝貝，高曉冬( 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)摘要 將 Staphylococcus carnosus 來源的 FruAS. car 醛縮酶基因 fda 和大腸桿菌來源的 YqaB 磷酸酶基因 yqaB 分別插入到表達(dá)質(zhì)粒 CDFDuet-1 得到重組質(zhì)粒 CDF-fda-yqaB，并轉(zhuǎn)化該重組質(zhì)粒到大腸桿菌 B

2、L21Star( DE3) 。以同時(shí)過量表達(dá) FruAS. car 醛縮酶和 YqaB 磷酸酶的大腸桿菌 BL21Star ( DE3) / CDFDuet-1-fda-yqaB 作為發(fā)酵菌株， 以葡萄糖為碳源通過糖酵解途徑在胞內(nèi)生成供體磷酸二羥基丙酮，分別在培養(yǎng)基中添加丙醛、丁醛為受體，進(jìn)行 相應(yīng)稀有酮糖的合成，從而成功地將羥醛縮合反應(yīng)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)，酮糖產(chǎn)物用 HPLC 檢測并進(jìn)行純化和1 H NM 鑒定。最后，以13 C 同位素全標(biāo)記的葡萄糖為碳源，添加丙醛為受體進(jìn)行了同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了產(chǎn)物從DHAP 而來的 3 個(gè)碳原子最終來自葡萄糖。關(guān)鍵詞醛縮酶; 磷酸酶; 稀有酮糖; 大腸桿

3、菌醛縮酶介導(dǎo)的羥醛縮合反應(yīng)是合成手性 C-C 鍵1 3，的最重要方法之一。對(duì)于醛縮酶來說 磷酸二羥基丙酮( DHAP) 依賴型醛縮酶研究最為廣泛。該類醛縮酶催化 DHAP 供體分子與醛受體分子的羥醛縮合反應(yīng)，醛縮酶能夠決定產(chǎn)物中兩個(gè)新生成的立體中心的構(gòu)型4，并且不受底物的結(jié)構(gòu)或立體化學(xué)的影 響5。D-果糖-1，6-二磷酸醛縮酶( FruA) 活性高、能夠以多種醛作為受體，是應(yīng)用最為廣泛的 DHAP 依賴型醛縮酶。FruA 對(duì) DHAP 分子的專一性要求非常 高6，由于 DHAP 成本昂貴并且穩(wěn)定性較差，不利于 產(chǎn)物的大量制備6 8。在前期工作中，基于“一釜四酶法”的策略，以外 消旋的 DL-3

4、-磷酸甘油作為起始底物在磷酸甘油氧 化酶的作用下生成 DHAP，同時(shí)與 FruAS. car 醛縮酶 ( Staphylococcus carnosus 來源) 催化的羥醛縮合反應(yīng)，9偶聯(lián) 制備了多種酮糖 。雖然能夠避免直接使用DHAP，在一定程度上節(jié)約了成本，但沒能從根本上 實(shí)現(xiàn) DHAP 的大量合成問題。在本研究中，以便宜 的底物葡萄糖作為碳源，通過糖酵解途徑在同時(shí)表達(dá)FruAS. car 醛縮酶和 YqaB 磷酸酶大腸桿菌工程菌胞內(nèi) 產(chǎn)生 DHAP，并分別在培養(yǎng)基中添加醛受體丙醛、丁第一作者: 博士，副教授( 高曉冬教授為通訊作者，E-mail: xdgao jiangnan edu c

5、n) 。* 國家 自 然 科 學(xué) 基 金 ( 21302069 ) ; 中 國 博 士 后 科 學(xué) 基 金 ( 2014M551500)收稿日期: 2015 03 31，改回日期: 2015 05 12醛合成相應(yīng)的稀有酮糖。1 材料與方法1. 1 質(zhì)粒和菌株CDFDuet-1 質(zhì)粒和大腸桿菌 BL21Star ( DE3 ) ，Novagen 公司; pKK-fda 質(zhì)粒由 Fessner 教授提供; 大腸桿菌 MG1655 和 DH5 本實(shí)驗(yàn)室保存; 用于基因擴(kuò) 增的引物在上海生工合成( 表 1) 。表 1本研究所用引物Table 1 Primers used in this study引物

6、序列CDF-fda-F5-GCGCGGATCCGAACCAAGAACAATT-3 ( BamHI)CDF-fda-5-GCGCCTGCAGTTAAGCTTTGTTTACTGAA-3( PstI)CDF-yqaB-F5-GCGCCATATGTACGAGCGTTATGCAGGTT-3( NdeI)CDF-yqaB-5-TATACTCGAGCAGCAAGCGAACATCCACG-3( XhoI)1. 2 酶、試劑和培養(yǎng)基DNA 聚合酶從 Invitrogen 公司購買; 限制性內(nèi)切 酶和 T4 連接酶購于寶生物公司; 鏈霉素、M9 無機(jī)鹽、 鹽酸硫胺素購自 Sigma-Aldrich; 硅膠購自 E

7、MDChemicals 公司。LB 液體培養(yǎng)基( g / L) : 胰蛋白胨 10，酵母提取物5，NaCl 10，121 濕熱滅菌 20 min; M9 培養(yǎng)基( g / L) :Na2 HPO4 6，KH2 PO4 3，NaCl 0. 5，NH4 Cl 1，MgSO4 0. 12， CaCl2 0. 011 1，硫胺素 0. 001，ZnSO4 0. 003 2。1. 3 CDF-fda-yqaB 重組質(zhì)粒的構(gòu)建以質(zhì)粒 pKKfda 為模板，使用 CDF-fda-F 和 CDF-2015 年第 41 卷第 8 期( 總第 332 期) 7食品與發(fā)酵工業(yè)FOOD AND FEMENTATION

8、 INDUSTIESfda- 分別作為上下游引物通過 PC 擴(kuò)增基因 fda;以大腸桿菌 MG1655 為模板，以 CDF-yqaB-F 和 CDF-yqaB- 分別作為上下游引物擴(kuò)增基因 yqaB; 使用限制性內(nèi)切酶 BamHI，PstI 分別對(duì) fda 基因片段和 CDF-Duet-1 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化 DH5，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，得到重組質(zhì)粒 CDF-fda; 使用限制性內(nèi)切酶NdeI，XhoI 分別對(duì) yqaB 片段以及質(zhì)粒 CDF-fda 進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性轉(zhuǎn)化子，得到重組質(zhì)粒CDF-fda-yqaB。1. 4 稀有酮糖的制備表達(dá)質(zhì)粒 CDF-fda-yqaB 轉(zhuǎn)

9、化 BL21Star( DE3) 感受態(tài)細(xì)胞得到 BL21Star( DE3) / CDF-fda-yqaB 重組菌株。將 LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的該重組菌株的培養(yǎng)液以 1 50 的比例轉(zhuǎn)接到以 5 g / L 葡萄糖為碳源、鏈霉素終濃度為 100 g / mL 的 M9 培養(yǎng)基中( 2 L) ，在37 ，225 r / min 條件下培養(yǎng)。當(dāng)測得菌液 OD600 為0. 8 1. 0 時(shí)，調(diào)整溫度為 30 后，加入過濾滅菌終濃度為 1 mmol / L 的 IPTG。IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá) 2 3 h 后，加入終濃度為 30 mmol / L 丙醛( 過濾除菌) 。在發(fā)酵過程中，當(dāng)葡萄糖或丙

10、醛的量不足時(shí)，適當(dāng)補(bǔ)加，并用 NaOH 溶液來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的 pH，使其維持在7. 0 左右。當(dāng)在培養(yǎng)基中添加丁醛作為醛受體( 加入丁醛的終濃度為 40 mmol / L) ，發(fā)酵流程參考丙醛為醛受體的發(fā)酵。當(dāng)產(chǎn)物的量沒有顯著增加時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵過程約為 40 h。1. 5 稀有酮糖的分離和純化發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心( 4 000 g，20 min，4) ，將上清液轉(zhuǎn)移到燒瓶中進(jìn)行減壓濃縮。濃縮產(chǎn)物用硅膠純化，流動(dòng)相為二氯甲烷 甲醇為20 1 ( v / v) ，流出液按照先后順序進(jìn)行依次收集，首先初步判定目的產(chǎn)物位于哪些離心管中，然后以二氯甲烷 甲醇 20 1( v / v)為展開劑

11、并以體外合成的相應(yīng)酮糖產(chǎn)物作為對(duì)照，通過TLC 檢測來確定含有目的產(chǎn)物的洗脫液。收集目標(biāo)洗 脫液，濃縮、干燥、稱重，用1 H-NM 檢測純度。1. 6 同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液以 1 /50 的比例轉(zhuǎn)接 到以 5 g / L 13 C 全標(biāo)記葡萄糖作為碳源，鏈霉素終濃度為 100 g / mL 的 M9 培養(yǎng)基中( 100 mL) 。整個(gè)發(fā)酵過程參照 1. 4。當(dāng)葡萄糖利用完全且產(chǎn)物的量沒有顯著變化時(shí)終止發(fā)酵。產(chǎn)物的分離純化參照 1. 5， 并用13 C NM 檢測。1. 7 分析方法HPLC 檢測條件如下: 色譜柱型號(hào)為 Bio-adHPX-87H( 300 mm ×

12、 7. 8 mm，氫型陽離子交換柱) ，流動(dòng)相為 5 mmol / L H2 SO4 ，流速為 0. 5 mL / min，柱溫 為 60 ，示差檢測器檢測。2 結(jié)果和討論2. 1 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 CDF-fda-yqaB首先驗(yàn)證重組質(zhì)粒 CDF-fda 是否構(gòu)建成功，通過BamHI，PstI 雙酶切能夠檢測到 fda 基因( 888 bp) 大 小的片段 ( 圖 1-a) ，表明 fda 基因片段已經(jīng)插入到CDFDuet-1 質(zhì)粒中并對(duì) fda 基因進(jìn)行測序。為了驗(yàn)證 表達(dá)質(zhì)粒 CDF-fda-yqaB 是否構(gòu)建成功，經(jīng)過 BamHI，XhoI 雙酶切能夠檢測到大約 1 600 bp 大小

13、的片段( 圖 1-b) ，根據(jù)基因 fda 和 yqaB 的大小，可以推斷yqaB 基因已經(jīng)成功插入到質(zhì)粒 CDF-fda 并進(jìn)一步對(duì)yqaB 基因進(jìn)行測序。1 DNA marker; 2 CDF-fda 質(zhì)粒 BamHI，PstI 雙酶切;3 DNA marker; 4 CDF-fda-yqaB 質(zhì)粒 BamHI，XhoI 雙酶切圖 1 重組質(zhì)粒 CDF-fda-yqaB 的構(gòu)建Fig. 1 Construction of the recombinant plasmidCDF-fda-yqaB2. 2 醛縮酶 FruAS. car 和磷酸酶 YqaB 在大腸桿菌中 的表達(dá)使用重組表達(dá)質(zhì)粒 C

14、DF-fda-yqaB 在大腸桿菌BL21Star( DE3) 同時(shí)過量表達(dá)醛縮酶 FruAS. car 和磷酸 酶 YqaB。理論上，F(xiàn)ruAS. car 和 YqaB 蛋白的分子質(zhì)量 分別為 32. 855 kDa 和 20. 78 kDa。從 SDS-PAGE 圖來看( 圖 2) ，這兩種蛋白的大小基本上與理論值一致，從而說明醛縮酶 FruAS. car 和磷酸酶 YqaB 成功得 到了表達(dá)。2. 3 以丙醛( 丁醛) 為醛受體發(fā)酵制備稀有酮糖在前期體外實(shí)驗(yàn)中，利用醛縮酶 FruAS. car 分別以 丙醛、丁醛等受體合成了 D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮 糖、D-蘇式-5，6，7-

15、三脫氧-2-庚酮糖等稀有酮糖9。在體外實(shí)驗(yàn)中，酸性磷酸酶( AP) 常用來脫磷酸化得 到相應(yīng)酮糖9，由于 AP 的最適 pH 偏酸性，不適合在82015 Vol. 41 No. 8 ( Total 332)1 蛋白 Marker; 2 未誘導(dǎo)全細(xì)胞; 3 誘導(dǎo) 10 h 后全細(xì)胞圖 2 SDS-PAGE 檢測 FruAS. car 和 YqaB 的表達(dá)Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the expression ofFruAS. car and YqaB大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的脫磷酸化。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)來源于大腸桿菌的磷酸酶 YqaB 在中性 pH( 生理?xiàng)l件 下) 具有較強(qiáng)的

16、磷酸酶活性10。首先在體外實(shí)驗(yàn)中研究 YqaB 磷酸酶對(duì)底物 D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖-1-磷酸和 D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖 1-磷酸的脫磷酸化作用，通過 TLC 檢測發(fā)現(xiàn)該磷酸酶可以脫掉相應(yīng)酮糖-1-磷酸的磷酸基團(tuán)得到相應(yīng)的酮糖( 未顯示結(jié)果) 。為了在大腸桿菌合成如上兩種稀有酮糖，以 BL21Star ( DE3) / CDF-fda-yqaB 作為發(fā)酵菌株，以廉價(jià)的葡萄糖作為碳源，分別在培養(yǎng)基中添加丙醛、丁醛作為醛受體，進(jìn)行相應(yīng)酮糖的合成。為了檢測是否有目標(biāo)酮糖產(chǎn)物的生成，對(duì)發(fā)酵液上清進(jìn)行HPLC 檢測，并分別以體外合成純化的兩種稀有酮糖 作為對(duì)照。由圖 3

17、可以看到，D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖能夠被檢測到( 如箭頭所示) ; 由圖 4 可以看 到，D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖能夠被檢測到( 如 箭頭所示) 。從而說明分別以丙醛、丁醛為受體，能 夠分別在大腸桿菌中合成相應(yīng)的稀有酮糖。當(dāng)在培養(yǎng)基中添加丙醛作為醛受體，對(duì)于 2 L 的發(fā)酵，發(fā)酵上清液經(jīng)過硅膠純化，能夠制備 D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖( 300 mg) ; 當(dāng)在培養(yǎng)基中添加 丁醛作為醛受體( 2 L) ，發(fā)酵液經(jīng)過純化，能夠制備D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖( 321 mg) 。純化后的 酮糖產(chǎn)物用1 H NM 進(jìn)行確認(rèn)，如圖 5 所示?？傮w上來

18、說，以丙醛、丁醛為醛受體的發(fā)酵，分離純化后得到相應(yīng)稀有酮糖的產(chǎn)量比較低，分析其可能的原因如下: 由 FruAS. car 醛縮酶體外合成實(shí)驗(yàn)可以推斷，和 D-甘油醛相比，F(xiàn)ruAS. car 醛縮酶對(duì)丙醛、丁醛的活性比較 低; YqaB 磷酸酶對(duì) D-果糖-1-磷酸具有較高的磷酸酶研究報(bào)告圖 3 HPLC 檢測在大腸桿菌中合成 D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖Fig. 3 HPLC analysis of the production of 5，6-dideoxy-D-threo-2-hexulose in E. coli圖 4 HPLC 檢測在大腸桿菌中合成 D-蘇式-5，6，7-三脫氧

19、-2-庚酮糖Fig. 4 HPLC analysis of the production of 5，6，7-trideoxy-D-threo-heptulose活性，而對(duì) D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖-1-磷酸和 D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖-1-磷酸脫磷酸基團(tuán)的活性比較低; 丙醛、丁醛對(duì)大腸桿菌菌體生長具有抑制作用。為了提高產(chǎn)量，一方面對(duì)調(diào)節(jié) DHAP 合成的 上游基因過量表達(dá)，同時(shí)敲除 DHAP 的代謝支路在 胞內(nèi)積累 DHAP 的量; 另一方面對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu) 化，比如優(yōu)化丙醛、丁醛加入的量等。2. 4 同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)經(jīng)過羥醛縮合反應(yīng)得到的稀有酮糖包含兩部分， 第 1

20、，2，3 位的碳原子來源于供體 DHAP，其余碳原子來源于醛受體。為了證實(shí)產(chǎn)物從 DHAP 而來的 3 個(gè)碳原子最終從葡萄糖而來，以 BL21Star ( DE3) / CDF-fda-yqaB 作為工程菌，以13 C 同位素全標(biāo)記的葡萄糖作為唯一碳源并在培養(yǎng)基中添加丙醛進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過分離純化得到 D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖( 25 mg) 。通過對(duì)酮糖產(chǎn)物進(jìn)行13 C NM 分析檢測，可以得知產(chǎn)物的 1 位碳對(duì)應(yīng)著位于 65 ppm位置的峰，產(chǎn)物的 2 位碳對(duì)應(yīng)著位于 210 ppm 位置的峰，產(chǎn)物的 3 位碳對(duì)應(yīng)著 76 ppm 位置的峰( 圖 6) ，從而證明推斷。

21、2015 年第 41 卷第 8 期( 總第 332 期) 9食品與發(fā)酵工業(yè)FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES圖 5 純化后產(chǎn)物1 H NM 鑒定Fig. 5 Characterization of products afterpurification by 1 H NM圖 6 13 C NM 分析同位素標(biāo)記的產(chǎn)物Fig.6 13C NM analysis of the product from the isotope experiment3 結(jié)論以過量表達(dá) FruAS. car 醛縮酶和 YqaB 磷酸酶的大腸桿菌工程菌作為發(fā)酵菌株，以便宜的葡萄糖為碳源，通過糖酵解途

22、徑在胞內(nèi)產(chǎn)生 DHAP，分別在培養(yǎng)基中添加丙醛或丁醛作為受體，進(jìn)行了相應(yīng)稀有酮糖D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖和 D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖的合成，從而成功地將 FruA 醛縮酶催化的羥醛縮合反應(yīng)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)。具有重要意義的是在磷酸酶 YqaB 作用下，羥醛縮合產(chǎn)物能夠在胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)脫磷酸生成沒有磷酸基團(tuán)的酮糖，有利于產(chǎn)物穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到胞外，便于分離和純化，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了磷酸基團(tuán)在胞內(nèi)的再次利用。然而由于酮糖產(chǎn)量相對(duì)較低，擬采用分子生物學(xué)的方法提高胞內(nèi) DHAP水平和優(yōu)化發(fā)酵條件來提高產(chǎn)量。此外，同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)了酮糖產(chǎn)物從 DHAP 而來的 3 個(gè)碳原子最終是從葡萄糖而來

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