REAL-TIME引物設(shè)計(jì)與是否跨內(nèi)含子的檢測(cè)方法

1、REAL-TIME 引物設(shè)計(jì)與是否跨內(nèi)含子的檢測(cè)方法1.丁香園子里最詳細(xì)的檢測(cè)引物是否跨內(nèi)含子的流程2.提供多圖顯示如何找到基因外顯子與內(nèi)含子3. 如何最簡(jiǎn)便設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物（利用primer-blast ）感謝隔壁的山西人提出這個(gè)問題，以及丁香園， google ，百度， PUBMED 提供解決問題的方法和線索供我 拼湊整理。問題一：如何在 pubmed 上找到目標(biāo)基因的 DNA 序列以及其內(nèi)含子和外顯子情況。步驟：打開NCBI主頁面，選GENE,輸入基因名稱-顯示出很多不同種但名字相同的基因（fig.1 ）-找到你要的種屬，打開 -顯示基因信息，找到 ”Genomic regions,

2、transcripts, and products ”點(diǎn),擊基因名稱， links 到geneback （ fig.2）-顯示了該基因 DNA的信息（fig.3）,可以看到這是基因組 DNA,從mRNA選項(xiàng)中可以 看到 JION 后面的是外顯子的位置，該基因一個(gè)共有 3 個(gè)內(nèi)含子， 4 個(gè)外顯子，以及外顯子的起至位置，為 了以后的操作，可以把這個(gè) DNA 序列和外顯子的起至位置記下來。Fig.100GEMIANKGi&APHCCSNCBLlinks2 NCBrmrez loeneEntrez GeneGnum*c rripofi, triHxcrvrts, and p«mft

3、uB聲t ?Hn>Wf HMfTM RX MeNi：OwwiM pH4*|nRwr*ftM 詢 UO>ELOrganpm fijpSfaia iTCgw*greuaUm*創(chuàng)也勺皿1-6*ir士.嗆fertiiwi#.左“”如加” <5AWj;屜/#曲利 卻序卿*申鳥 強(qiáng)旳甲.豪.Mko 亦0瞅n h 9li2; Sirtl(mlhUVAind) <5& to 4pq 匸 ” :* SC'3 i«r- Zt 1 + rj -T%r ，左即1|2C 下 |和(1 by RslsiaiiUB jJbbHJb T Prl-mi.il TSum 幗 ry

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6、?7; 5IR2JrkE prirtEin 1, mS2a, sirZ-hke1； sirtum 1 (silent mating tpe iDrmanon regulstion 2, hoinciQg) 1ChromcsoTDtt： 10. Lcaticn! IUAnnctitiQn: Chromoscme ID, NC_DOOa755 (627S1B09 .62301766. complement) 9en#IO: 037S9SIRTJsiriuin 1 Sus scraaOthftr Dfrtjnatk4nc: NAD-d即endent deacelylase sirtuin-1, si

7、rtuinlChfomvSAme; AAnnctrtion: Chromoscme 14. NC 01W58 1 (6S9921B 7001 ?900)G*ntlD: 751653FirrWfY rwiRiuhr MitnT，7*imhri!y，irsbp+ailFul Ppert(冠a |bi刪Gene0Fig.3FEATtmES sourceLacacion/Qu&Hf jetaK.11193/organisbi=rfRattus rwrvegicus" /moI type-genoaic D)fh" /srrKin*"&M/5srfd3ani

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9、“丄丄】科 1 為 5. J 舶億 5709”. SeSlUlGSe., 11193 /gsneir tl"/product=*Hsirtuin (silent bating type infotnticn reguicion 2 honoioj 1 (S. cerevisiae) /nateDeilvtd by autouat電d coiaputaMonal analysis using 9ene prediction uethad: E«JtRe£3eq»r,/tranacEipt id-"I：I 001107627*1/db丄滬Fiife

10、rxi：酋3”genelD: 3P975?Jf /dbxree,JRGD：nO8542,fctflttggctggcatgtgcac tccttccttc4,tgafaccac acgcaaffctc ettcaaaca cttccccccc gacaagcaccsctaatqgc atcicccttctCtttCCCLCttccattcct actccaaggc CttCCttCCL cctccttccc cccaciaggtaaata tccttccttc tCCCLLCLee ttesgetye問題二：如何在pubmed上找到目標(biāo)基因的 mRNA序列。步驟：打開NCBI主頁面，選GENE

11、,輸入基因名稱-顯示出很多不同種但名字相同的基因 -找到你要的 種屬，打開-顯示基因信息，找到 “mRNA and protein '前面那個(gè)nm*, 號(hào)碼（fig.4 ），把它記 下來（后面的blast要用）并點(diǎn)開-顯示這個(gè)基因的 mRNA信息（Fig.5），最后的ORIGIN是CDNA序列， 把它記下來，一會(huì) PRIMER的時(shí)候要用。Fig.4assembt/ (RnCelera)1,AjC_M008a.1ting*awtnw ,3Kl»55G怙陽也 F 昭TftStaVr*常 Y!hJtUGfX * 躋2.NW0010UW4Do'iloidaw$4751 JWS

12、WSGt 1狂*土 Vkiifr 2耐rrtRNA的總Fe勵(lì)玳詁Fig.5FEATURESaaurceLacaElan/Qual1 Clera1, . 540qeueCDS/Qri!mlaTL-r,afittu5 mE 訂亡駐 亡e 甘1 afiNA-'/dl:/ chEoaoaoBe =B|20a,"皿X施丄丄”1. . 640/dene=rrSicXl"/ genera jnunyii-rf S ie2/ncce®ws 1 rT-yin (silant ME-ing typie iniorciBEior regulation2 hatnolog) 1

13、(S. cecevislae)u/dt kref=FFGaieID: 305257r,/dbKref»pT.OT: 1 加姑 碇"! .5 出/gene-Sirrl11/ gWyntmyiL 亠 Sir 己斤XnGte=rir3ii:2a丄ph且7 airtuiti 1 (silent 且mg tpeinf口Emaxicn Eeoulatioa J hDiQlg)i 丄河/ccdon_staxt=l/pro duct-rrKAD - de pende 口 七 de a 匚匕七壬丄臼弓匕 airtu ui- 1M/pi 0 Le =Lel_id1M 了 L/dt xrefrr

14、G'I- 151&2Q92Tr/ 業(yè))ref-"Gene ID 1 辿即即r/dk-Kref=rrRU): K30匪貯曠/tTmalfitlCS-rr11Tim)PRTILKDLLPETIPPPELDDMTLMQIVliriLSEPPKEU<K RKE'INTIEDAVKLH|ECKKIIVLTSAGVSV5CGIPDFRSRDGIYAfi.LAVDFPDLPDPQ JUfFZi IEVTRKE' PRP FFRFAkCKKQHORIGIN161121181241301361421431541GDI日豈匚艮日二匚上匚tccatatact 歸口魁匸

15、匚x且 tg-tta.tcaa 匚ggntcctgrc tgctgTggec anaag-acccEL gg"gggraaaaa 3Cagtatgtctqtt 口口匚匚 q tttjttcagc ctjagaaacafi atcct tx覽呂 g gtjgaagttaG tcccg匸ggg日 ttcccgjetc agflECfitret cacacacaca 口匚匚匚口匸口£縣口atcracatcat 自且匚acctcatCtCCtCC&GC sficcaccaaa tacaegagtg tecccgact 匸 tcccegetcc tcaattxgc aflat

16、ccegca tvjacggaaac&ctaatgcjc tagtgCtgg gattggcacc Cgautggat. gcggaaaaaa caaBaegata cag且tx?吐&g已 tcaegccatg atagaaaaa ectcagcatt gcaatt匚tqg匚匸匸cattGGl丁曰Xc匚匚eg自呂 gaat-gacac agaaeagata al>agtt.Gtga atgfqcartE ttcgratattg cagEfittjgacL cat-gregcegccesttcttaa. tjgtggciaQrat- tT.3fiD3CaaL Gt.ggag

17、ct.gg- HTgctcgccc gtettttagr gcarMtttg- tctgttctnt問題三：如何設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物（利用 primer-blast ）1 ）打開 primer-blast 網(wǎng)站（ /tools/primer-blast/ ）2） 將mRNA編號(hào)（nm*）輸入序列框中，real time PCR 般產(chǎn)物長(zhǎng)度為 80150bp也可以超一點(diǎn)，但是會(huì)影響擴(kuò)增效率，這樣就不能用ddCT法計(jì)算了，酌情考慮。溫度在5563和GC含量在40% 60%，兩條鏈不要差太遠(yuǎn)。點(diǎn)擊 GET primer詳細(xì)的設(shè)計(jì)方法可以參看 3）會(huì)得

18、到若干條引物（ fig。 6），紅條中的黃圈標(biāo)記的小白色缺口是內(nèi)含子所在的位置，跨過小缺口就是跨 了內(nèi)含子。根據(jù)下面列出的引物具體的溫度 GC 含量之類的再進(jìn)行選擇4） 將初步選擇的引物用PRIMER 5 驗(yàn)證引物二聚體，發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，方法見下個(gè)問題 “問題四：用 PRIMER 5 查找已知引物的產(chǎn)物位置 ”引物設(shè)計(jì)原則見： Fig。 60丄 RittUI ftQiinv-tdCUf siituia (filtntinjting typertgullti$ft 2 hoEobg) 1 ($t Ctr>tvifi4«*l (Siftl, mRNAT4 inputdtnpliiTt

19、no thtr tArfetf wtrt fdund In ftlKttdNCfilrlp Rtftrtnc eqmtnctfkMMd to RAnuf.j ir ； / * z 色問題四：如何利用 MRNA序列和DNA序列，用PRIMER 5查找已知引物的產(chǎn)物位置，并確定其是否跨內(nèi)含子1）找到目的引物的 DNA序列和MRNA （cdna ）序列，以問題三中用 primer-blast設(shè)計(jì)的第8條引物為例（fig。7）awe r rlnxi<H tn.E k*alWlg |>j >n k -!日飾咽擰曇E Mi-fr ATScr 蘋EfF>i lFMHMrMOMpnMT

20、WW盲 E N TT*> MT HAATMW*CCTATCCflT«!W1TW+HFs- Meu-Fn1nw-wSMS-a? W* «oo*Pi Irna i p山 TIhmk-ii IMZi肝 Z 5 " *Vpl 4NmTtai04HUrwprcn»VrmCCTATCr#T+fCCTrO*iL01PCEEtMHW+5eajwL 亠Fdrhri i plf El"N Wrd H+歸art3«Tn打咖P4fr4f>pnwwM $ W.w； C啊杠fl棉 I* 4n um1 lH i.1 WJ - 1 £ J1i

21、<Jti t«ruM2W2'E-nc-BUH*MSFiJhirii pilr 5Ur-NwiWaaKHFrarwepfiwMtccla ibaftFhha料<jf*kMd? ftthii*ag«fcjwwrQ TH GC TT+4* & r !： GJW TWTZ2K9».!Tin<卩i irnvi pd if 1DhrrhMXHvTrtPC*cpmwpniwdu 皿亡F址帕、T£帕* MHulT亡4MAtt也HJCflV.«"WST-IHHRW WW-JH*2） 打開PRIMER 5，將CDNA序列貼入-點(diǎn)擊primer-顯示 primer primer 界面-點(diǎn)擊左上方的 “ S” 再點(diǎn)擊EDIT primer -顯示 EDIT primer界面，在 “5,3,"框中貼入已知的 Forward primer，點(diǎn)擊as is，顯 示序列已被貼入-點(diǎn)擊analyze,再點(diǎn)擊primer-顯示輸入的序列和已知 CDNA良好配對(duì)，點(diǎn)擊 0K-顯 示“primer primer界面”點(diǎn)擊左上方的