第五講分子標(biāo)記技術(shù)與環(huán)境微生物多樣性分析1

1、第五講第五講 分子標(biāo)記技術(shù)與環(huán)境微分子標(biāo)記技術(shù)與環(huán)境微生物多樣性分析生物多樣性分析 廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNADNA或或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。 狹義的分子標(biāo)記概念只是指狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNADNA標(biāo)記，這種界定標(biāo)記，這種界定目前已經(jīng)被廣泛采納。目前已經(jīng)被廣泛采納。 蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子儲(chǔ)藏蛋白和同工酶及等位酶。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子儲(chǔ)藏蛋白和同工酶及等位酶。 利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)揭示利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)揭示DNADNA序列的變異，就序列的變異，就可以建立可以建立DNADNA水平上的遺傳標(biāo)記。水平上的遺傳標(biāo)記。一、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析一、限

2、制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（一）（一）RFLP分析的基本原理分析的基本原理 （Restriction fragment length polymorphism） 堿基的改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致生物個(gè)體或種堿基的改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致生物個(gè)體或種群之間群之間DNA片段酶切位點(diǎn)的變化，用限制性內(nèi)切酶片段酶切位點(diǎn)的變化，用限制性內(nèi)切酶切割改變的切割改變的DNA則產(chǎn)生長(zhǎng)短、種類、數(shù)目不同的限則產(chǎn)生長(zhǎng)短、種類、數(shù)目不同的限制性片段，通過(guò)對(duì)不同限制性片段的電泳分析，從而制性片段，通過(guò)對(duì)不同限制性片段的電泳分析，從而獲得微生物種群遺傳變異的有關(guān)信息。獲得微生物種群遺傳變異的有關(guān)信息。限制性內(nèi)切酶：專一的識(shí)別序

3、列內(nèi)（通常為限制性內(nèi)切酶：專一的識(shí)別序列內(nèi)（通常為46bp）的恒定位置堿基并在此位置切割的恒定位置堿基并在此位置切割DNA的酶。的酶。 如如BamH G GATC C C CTAG G Pst C TGCA G G ACGT CCATATG GATCCATCGAGCTTGTATACCTAG GTAGCTCGAA（二）限制性片段的長(zhǎng)度分布圖像（二）限制性片段的長(zhǎng)度分布圖像 分離提取分離提取DNA通過(guò)通過(guò)PCR擴(kuò)增目的擴(kuò)增目的DNA片片段段限制性內(nèi)切酶酶解限制性內(nèi)切酶酶解瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察拍照。紫外燈下觀察拍照。BamH I 酶切Hind酶切EcoR酶切123 1 2 3 M

4、（三）（三）限制性酶切產(chǎn)物與探針雜交的放射自顯影限制性酶切產(chǎn)物與探針雜交的放射自顯影限制性內(nèi)切酶酶解限制性內(nèi)切酶酶解瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)膜印轉(zhuǎn)膜印跡跡探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影觀察拍照觀察拍照BamH I 酶切Hind酶切EcoR酶切123 1 2 3 M* * *（四）（四）RFLP的應(yīng)用范圍的應(yīng)用范圍 為微生物群落水平的變異提供有用的遺傳標(biāo)記，為微生物群落水平的變異提供有用的遺傳標(biāo)記，屬內(nèi)種間的變異和科內(nèi)屬間的變異的研究成果表明屬內(nèi)種間的變異和科內(nèi)屬間的變異的研究成果表明RFLP的明顯差異性。的明顯差異性。 采用多個(gè)基因片段進(jìn)行采用多個(gè)基因片段進(jìn)行RFLP分析對(duì)于高層次

5、分析對(duì)于高層次分類群的系統(tǒng)學(xué)研究是可行的。分類群的系統(tǒng)學(xué)研究是可行的。二、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性二、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)技術(shù)(Random amplified polymorphism DNA, RAPD)（一）基本原理（一）基本原理 以非限制性的隨機(jī)寡核苷酸鏈為引物，通常以非限制性的隨機(jī)寡核苷酸鏈為引物，通常10個(gè)隨機(jī)排列的寡核苷酸構(gòu)成個(gè)隨機(jī)排列的寡核苷酸構(gòu)成1條隨機(jī)引物鏈。由條隨機(jī)引物鏈。由于目的基因組序列于目的基因組序列DNA通常都是很長(zhǎng)的大分子通常都是很長(zhǎng)的大分子DNA，寡核苷酸引物有足夠的機(jī)會(huì)與模板寡核苷酸引物有足夠的機(jī)會(huì)與模板DNA同同源堿基配對(duì)結(jié)合，延伸源堿基配對(duì)結(jié)合，延伸 擴(kuò)增擴(kuò)增

6、2個(gè)緊鄰結(jié)合點(diǎn)間的個(gè)緊鄰結(jié)合點(diǎn)間的DNA片段，擴(kuò)增的片段與目的基因組有同源序列。片段，擴(kuò)增的片段與目的基因組有同源序列。擴(kuò)增后有擴(kuò)增后有4種結(jié)果：種結(jié)果：1、沒(méi)有擴(kuò)增帶出現(xiàn)；說(shuō)明引物鏈與目的基因組、沒(méi)有擴(kuò)增帶出現(xiàn)；說(shuō)明引物鏈與目的基因組DNA沒(méi)有同源區(qū)；沒(méi)有同源區(qū)；2、不同測(cè)試標(biāo)本中，都產(chǎn)生相同大小的、不同測(cè)試標(biāo)本中，都產(chǎn)生相同大小的DNA擴(kuò)增譜擴(kuò)增譜帶；說(shuō)明這些測(cè)試樣本為同一物種。帶；說(shuō)明這些測(cè)試樣本為同一物種。3、不同測(cè)試樣本，產(chǎn)生相同或不相同的譜帶。說(shuō)明、不同測(cè)試樣本，產(chǎn)生相同或不相同的譜帶。說(shuō)明測(cè)試樣本間具有同源性，可依據(jù)公式計(jì)算其相關(guān)性。測(cè)試樣本間具有同源性，可依據(jù)公式計(jì)算其相關(guān)性。

7、4、不同測(cè)試標(biāo)本，產(chǎn)生的帶形完全不同。、不同測(cè)試標(biāo)本，產(chǎn)生的帶形完全不同。 可用于鑒可用于鑒別不同的物種。這些擴(kuò)增后的別不同的物種。這些擴(kuò)增后的DNA譜帶稱為隨機(jī)擴(kuò)譜帶稱為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性增多態(tài)性DNA（RAPD）。）。（二）（二）RAPD的操作程序的操作程序1、模板、模板DNA的制備的制備 RAPD只需少量的只需少量的DNA模板，對(duì)模板，對(duì)DNA提取的質(zhì)量提取的質(zhì)量要求也不高。模板量從要求也不高。模板量從10ng25ng均可觀察到多態(tài)性。均可觀察到多態(tài)性。2、隨機(jī)引物的選擇、隨機(jī)引物的選擇 隨機(jī)引物系列已商品化，研究物種不同（如微生隨機(jī)引物系列已商品化，研究物種不同（如微生物、動(dòng)植物），對(duì)引物

8、并無(wú)要求。物、動(dòng)植物），對(duì)引物并無(wú)要求。3、DNA擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng) DNA聚合酶的用量聚合酶的用量 反應(yīng)體積為反應(yīng)體積為25l時(shí)，時(shí)，0.8U的的Taq酶較合適。太多酶較合適。太多 易產(chǎn)生非特異性條帶，太少影響反應(yīng)產(chǎn)量。易產(chǎn)生非特異性條帶，太少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 退火溫度的選擇退火溫度的選擇 一般采用較低的退火溫度或降落一般采用較低的退火溫度或降落PCR退火溫度。退火溫度。 脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸 一般用約一般用約0.6mol/L的濃度。的濃度。 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù) 循環(huán)數(shù)影響循環(huán)數(shù)影響PCR最終產(chǎn)量，常采用兩步法。最先最終產(chǎn)量，常采用兩步法。最先5個(gè)循環(huán)后，條件不變?cè)傺h(huán)個(gè)循環(huán)后，條件不變?cè)?/p>

9、循環(huán)2030個(gè)。個(gè)。（三）（三）RAPD在微生物分類鑒定中的應(yīng)用在微生物分類鑒定中的應(yīng)用 常采用培養(yǎng)特性、表型特征、生理生化特點(diǎn)等傳統(tǒng)常采用培養(yǎng)特性、表型特征、生理生化特點(diǎn)等傳統(tǒng)分類鑒別方法來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類，但這些傳統(tǒng)方法不分類鑒別方法來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類，但這些傳統(tǒng)方法不能完全準(zhǔn)確、可靠地鑒別不同的型或亞型。能完全準(zhǔn)確、可靠地鑒別不同的型或亞型。 有實(shí)驗(yàn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增鑒別了有實(shí)驗(yàn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增鑒別了20種不同血清型沙門種不同血清型沙門氏菌，證明氏菌，證明RAPD對(duì)沙門氏菌基因分型完全適用。對(duì)沙門氏菌基因分型完全適用。 RAPD與限制性內(nèi)切酶分析法同時(shí)鑒別比較與限制性內(nèi)切酶分析法同時(shí)鑒別比較2株金

10、株金黃色葡萄球菌，兩者所得結(jié)果完全一致，可區(qū)別出每黃色葡萄球菌，兩者所得結(jié)果完全一致，可區(qū)別出每個(gè)分離株。個(gè)分離株。三、三、DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（Single strand conformation polymorphism, SSCP）（一）基本原理一）基本原理 單鏈單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來(lái)維持的。當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少來(lái)維持的。當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變?？臻g構(gòu)象有地影響其空

11、間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變?？臻g構(gòu)象有差異的單鏈差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，小不同。因此，通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開(kāi)。可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開(kāi)。 （二）操作程序二）操作程序1、PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)備產(chǎn)物的準(zhǔn)備 進(jìn)行進(jìn)行PCR時(shí)，設(shè)計(jì)的引物特異性要強(qiáng)，這樣才能保證擴(kuò)時(shí)，設(shè)計(jì)的引物特異性要強(qiáng)，這樣才能保證擴(kuò)增出特異的產(chǎn)物。增出特異的產(chǎn)物。 2、PCR產(chǎn)物單鏈凝膠電泳產(chǎn)物單鏈凝膠電泳電泳裝置電泳裝置凝膠配制凝膠配制上樣緩沖液及變性劑上樣緩沖液及變性劑 有用甲酰

12、胺的，也有用有用甲酰胺的，也有用FicollFicoll的，也有用氫氧化甲基的，也有用氫氧化甲基汞的。汞的。電泳溫度電泳溫度 可室溫，也可加溫；可恒溫，也可變溫。可室溫，也可加溫；可恒溫，也可變溫。（三）三）PCR-SSCP的優(yōu)缺點(diǎn)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)單，技術(shù)容易掌握，操作簡(jiǎn)單，技術(shù)容易掌握，PCR產(chǎn)物變性后無(wú)需處產(chǎn)物變性后無(wú)需處 理可直接電泳。理可直接電泳。 實(shí)驗(yàn)步驟少，周期短，最快可在實(shí)驗(yàn)步驟少，周期短，最快可在4小時(shí)內(nèi)完成。小時(shí)內(nèi)完成。 成本低，所用試劑均價(jià)廉。成本低，所用試劑均價(jià)廉。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 不能確定變異的位置；不能確定變異的位置； 檢測(cè)存在假陰性；檢測(cè)存在假陰性； 對(duì)于大

13、于對(duì)于大于300bp的的DNA片段，隨著長(zhǎng)度增加，檢測(cè)片段，隨著長(zhǎng)度增加，檢測(cè)的靈敏性逐漸降低。的靈敏性逐漸降低。四、擴(kuò)增性限制性酶切片段分析及其應(yīng)用四、擴(kuò)增性限制性酶切片段分析及其應(yīng)用（Amplified ribosomal dNA restriction analysis,ARDRA) （一）一）ARDRA的基本原理的基本原理 ARDRA是基于是基于PCR選擇性擴(kuò)增選擇性擴(kuò)增rDNA片段，再對(duì)片段，再對(duì)rDNA片段進(jìn)行限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。片段進(jìn)行限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。 主要操作步驟：主要操作步驟： 提取總提取總DNA； 以總以總DNA為模板，擴(kuò)增為模板，擴(kuò)增rDNA基因的

14、保守序列；基因的保守序列； 選擇多種有四對(duì)堿基識(shí)別位點(diǎn)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；選擇多種有四對(duì)堿基識(shí)別位點(diǎn)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切； 瓊脂糖凝膠電泳；瓊脂糖凝膠電泳； 對(duì)對(duì)ARDRA診斷譜帶進(jìn)行系統(tǒng)分析及計(jì)算機(jī)聚類。診斷譜帶進(jìn)行系統(tǒng)分析及計(jì)算機(jī)聚類。 （二）二）ARDRA的操作程序的操作程序1、樣品中總、樣品中總DNA的分離的分離 可用直接法和間接法?？捎弥苯臃ê烷g接法。2、選取專一引物進(jìn)行、選取專一引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增rDNA片段片段 原核生物原核生物16S rDNA含含1500bp，可以進(jìn)行有關(guān)系可以進(jìn)行有關(guān)系統(tǒng)發(fā)育的研究。統(tǒng)發(fā)育的研究。3、限制性酶切擴(kuò)增產(chǎn)物、限制性酶切擴(kuò)增產(chǎn)物 選擇選擇25個(gè)合適的限

15、制內(nèi)切酶對(duì)個(gè)合適的限制內(nèi)切酶對(duì)16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聯(lián)合酶切。物進(jìn)行聯(lián)合酶切。4、瓊脂糖凝膠電泳分離、瓊脂糖凝膠電泳分離5、對(duì)、對(duì)ARDRA譜帶進(jìn)行分析譜帶進(jìn)行分析 根據(jù)譜帶結(jié)果計(jì)算出樣品（菌株）間的根據(jù)譜帶結(jié)果計(jì)算出樣品（菌株）間的DNA片段片段同源性（同源性（F），），計(jì)算方法為：計(jì)算方法為： F = 2 NXY /（NX + NY） NXY表示這表示這2個(gè)樣品共有的片段數(shù)目。個(gè)樣品共有的片段數(shù)目。 NX表示表示X樣品有而樣品有而Y樣品沒(méi)有的片段數(shù)。樣品沒(méi)有的片段數(shù)。 NY表示表示Y樣品有而樣品有而X樣品沒(méi)有的片段數(shù)。樣品沒(méi)有的片段數(shù)。 然后再根據(jù)然后再根據(jù)F值進(jìn)行計(jì)算機(jī)聚類分

16、析。值進(jìn)行計(jì)算機(jī)聚類分析。 如果得到的電泳圖譜中條帶較多，可以應(yīng)用計(jì)算如果得到的電泳圖譜中條帶較多，可以應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)所獲得的遺傳距離矩陣進(jìn)行聚類分析，得出機(jī)軟件對(duì)所獲得的遺傳距離矩陣進(jìn)行聚類分析，得出反映菌株間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的聚類分析樹(shù)狀圖譜。反映菌株間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的聚類分析樹(shù)狀圖譜。（三）三）ARDRA技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用1 1、從環(huán)境中發(fā)現(xiàn)新種屬微生物、從環(huán)境中發(fā)現(xiàn)新種屬微生物 1997年有人應(yīng)用年有人應(yīng)用ARDRA技術(shù)并結(jié)合化學(xué)、生技術(shù)并結(jié)合化學(xué)、生理學(xué)方法，在獲得理學(xué)方法，在獲得25株能降解烯丙嗎啡的微生物株能降解烯丙嗎啡的微生物中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新種。中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新種。2、微生物的分類與

17、鑒定、微生物的分類與鑒定 1994年，有人用年，有人用ARDRA技術(shù)對(duì)技術(shù)對(duì)48株根瘤菌株株根瘤菌株進(jìn)行分析，并將結(jié)果與其他分類學(xué)方法進(jìn)行了比進(jìn)行分析，并將結(jié)果與其他分類學(xué)方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)較，發(fā)現(xiàn)ARDRA法所得到的基因型與法所得到的基因型與16S rRNA測(cè)序測(cè)序所得結(jié)果一致。所得結(jié)果一致。五、擴(kuò)增的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)五、擴(kuò)增的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù) (Amplified fragment length polymorphism)（一）基本原理一）基本原理 基因組基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶完全消化后，在限經(jīng)限制性內(nèi)切酶完全消化后，在限制性片段兩端連接上人工接頭作為擴(kuò)增的模板。設(shè)制

18、性片段兩端連接上人工接頭作為擴(kuò)增的模板。設(shè)計(jì)的引物與接頭和酶切位點(diǎn)互補(bǔ)，并在計(jì)的引物與接頭和酶切位點(diǎn)互補(bǔ)，并在3端加上端加上23個(gè)堿基，因此在基因組被酶切后的無(wú)數(shù)片段中，個(gè)堿基，因此在基因組被酶切后的無(wú)數(shù)片段中，只有一小部分限制性片段被擴(kuò)增。只有一小部分限制性片段被擴(kuò)增。GAATTCCTTAAGTTAAAATT5335AATTC GTAATTTAA55TAAATTCTTAAGTTAAAATTEcoR 和Mse酶切EcoR接頭Mse接頭5 EcoR引物 + AC + Mse引物5AATTCATTAAGTGTTAACAATT5EcoR引物 + AACCAT +Mse引物5AATTCAACTTAAG

19、TTGTTGTTAAAACAATT變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離與檢測(cè)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離與檢測(cè)（二）操作程序二）操作程序1、限制性消化與接頭連接、限制性消化與接頭連接 酶切后基因組酶切后基因組DNA產(chǎn)生產(chǎn)生EcoR- EcoR片段，片段，Mse- Mse片段片段和和EcoR-Mse片段。由于引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增策略的巧妙使用使得片段。由于引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增策略的巧妙使用使得EcoR-Mse片段的擴(kuò)增占優(yōu)勢(shì)。片段的擴(kuò)增占優(yōu)勢(shì)。 擴(kuò)增產(chǎn)物小于擴(kuò)增產(chǎn)物小于1kb，適于在聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離。適于在聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離。2、PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 分兩步，第一步預(yù)擴(kuò)增，用連好接頭的限制性片段作模板，分兩步，第一步預(yù)擴(kuò)增，用連好接頭的限制性片段作模板，用各有一個(gè)選擇堿基的引物對(duì)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。用各有一個(gè)選擇堿基的引物對(duì)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。 第二步，預(yù)擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)稀釋第二步，預(yù)擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)稀釋20倍后作為選擇性擴(kuò)增的模板。倍后作為選擇性擴(kuò)增的模板。3、擴(kuò)增產(chǎn)物的分離與檢測(cè)、擴(kuò)增產(chǎn)物的分離與檢測(cè) 在在5%或或6%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離。變性