外文翻譯---在酪干乳桿菌BL23的LDH基因分析：乳酸生產(chǎn)上的作用

1、.英語外文翻譯作業(yè)外文資料翻譯譯文：在酪干乳桿菌BL23的LDH基因分析：乳酸生產(chǎn)上的作用Juan Rico · María Jesús Yebra ·Gaspar Pérez-Martínez · Josef Deutscher ·Vicente Monedero收稿日期：2007年12月21日/接受日期：2008年1月13日/發(fā)表時間：2008年1月30日 ©學會工業(yè)微生物2008摘要：干酪乳桿菌是一種通過通過L-乳酸脫氫酶（LDH1）的作用促使糖發(fā)酵主要生產(chǎn)L-乳酸的乳酸菌。此外，D-乳酸的異構(gòu)體的

2、少量產(chǎn)生一個D-hydroxycaproate脫氫酶（HicD）的活動。LDH1是主要的L-乳酸生產(chǎn)酶，但突變它的基因并沒有消除L-乳酸的合成。一項稱作 “干酪乳桿菌基本法第二十三條草案的基因組序列”的調(diào)查揭示了相關(guān)的另外三個基因編碼乳酸脫氫酶旁系。為了研究這些基因?qū)θ虻倪@種微生物的貢獻，個體乳酸以及雙突變體（LDH1 LDH2，LDH1 LDH3，LDH1，LDH4和LDH1hicD）的生產(chǎn)，構(gòu)建了乳酸生產(chǎn)的上清培養(yǎng)評估。 LDH2，LDH3和LDH4基因乳酸生產(chǎn)中發(fā)揮的作用不大，因為他們的單一突變或在組合與LDH1缺失突變對L-乳酸合成的影響很小。LDH1突變體顯示D-乳酸產(chǎn)量增加，這是

3、可能通過活動HicD合成，因為它是在取消LDH1 hicD的雙突變。相反，可能是HicD，在沒有LDH1，LDH2，LDH3或LDH4活動的情況下通過酶譜分析檢測。此外，這些檢測發(fā)現(xiàn)存在額外的頻段表現(xiàn)出D-/L-lactate脫氫酶活性，這不能歸咎于任何所描述的基因。這些結(jié)果表明，L-BL23具有一個復雜的酶系統(tǒng)，能夠減少乳酸丙酮酸。關(guān)鍵詞：干酪乳桿菌、乳酸菌、Hydroxycaproate脫氫酶、乳酸脫氫酶、代謝工程簡介：糖代謝乳酸菌（LAB）的特點是通過乳酸脫氫酶的作用主要發(fā)酵生產(chǎn)乳酸產(chǎn)品，從而降低丙酮酸，乳酸。從生物技術(shù)的觀點來看乳酸的生產(chǎn)是非常重要的，因為它可以產(chǎn)生許多自然發(fā)酵的實驗室

4、資源，它可以用在食品，制藥和生物聚合物產(chǎn)業(yè)7。在乳酸菌干酪BL23，一些菌株已被廣泛用于遺傳，生理和生化研究，這兩個基因編碼的蛋白質(zhì)乳酸脫氫酶活性已被描述8，12，19。 LDH1基因編碼合成的L-LDH，而hicD編碼一個D-hydroxyisocaproate提供了D-乳酸脫氫酶。在這種細菌19上與突變株相關(guān)的L-乳酸和D-乳酸的形成表明突變株已在這兩個基因上建成。然而，干酪乳桿菌BL23顯示LDH1突變體仍然產(chǎn)生大量的L-乳酸D-乳酸。一個與其他實驗室刪除LDH基因相似的行為也有報道。在這個意義上說，基因突變從植物乳桿菌的L型和D型上開始編碼，使該生物體產(chǎn)生50的D型跟50L型的混合物，

5、從來沒有導致乳酸生產(chǎn)3的完全缺失。 1乳酸乳桿菌sakei的突變，在缺乏D-乳酸脫氫酶活性酸菌的條件下，將導致具有強烈降低L型和D型的乳酸的菌株生產(chǎn)（D異構(gòu)體在消旋活動的作用下能夠轉(zhuǎn)換成L Dlactate）但仍然產(chǎn)生少量的乳酸15。最后乳酸菌的發(fā)酵在ldhL 、ldhD雙基因剔除的情況下仍然能夠合成乳酸1。 EVorts已作出建設(shè)在一個aVected或乳酸菌菌株上的幾個的identiWed LDH基因，因為它們可以用在通過非消旋，光發(fā)酵等途徑生產(chǎn)活性乳酸1。此外，代謝工程戰(zhàn)略應(yīng)用于NADH氧化再加上一個替代的丙酮酸的代謝，導致附加代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生4，6，13，17。然而，已知的缺失乳酸脫氫酶基

6、因的結(jié)合酶活性的表達并不總是能夠降低丙酮酸suYcient改道對其他分子比如signiWcant丙酮酸XOW乳酸diVerent的影響。由于這些原因，一個更好的涉及乳酸合成酶的研究將成為必要。在嘗試探索的基因負責殘留在干酪乳桿菌乳酸生產(chǎn)BL23的LDH1突變體，我們探索其是否存在額外的LDH基因突變以及在eVects乳酸生產(chǎn)上新發(fā)現(xiàn)的LDHs的基因組。材料和方法：菌株和生長條件：在這項研究中干酪乳桿菌菌株的使用在表1中列出。他們生長在MRS培養(yǎng)基（Oxoid公司）或MRS基本培養(yǎng)基中，每公升含：蛋白胨10克，肉類提取物8克，酵母提取物4克，吐溫80，1毫升，K2HPO42克;檸檬酸銨2克; M

7、gSO4.7H2O，0.2克;MnSO4.4H2O，0.05克，并輔以0.2（W / V）葡萄糖，在37下靜置。大腸桿菌DH5是作為一個克隆宿主，在LB培養(yǎng)基中37條件下攪拌生長，對于選擇干酪乳桿菌的轉(zhuǎn)化體，將5克/毫升的紅霉素加入培養(yǎng)基中。氨芐青霉素則用在100克/毫升大腸桿菌中。質(zhì)粒和突變株的構(gòu)建：pRV300質(zhì)粒11用于興建綜合載體內(nèi)部碎片的L.casei，LDH2，LDH3，LDH4。一個519 bp的片段從LDH2 ampliWed PCR結(jié)合寡核苷酸5-GATTCCCTACCTTACACG和5-TCTCAATGATGCCATAAGC與EcoRV分為pRV300消化的克隆，給予pRV

8、ldh2。一505 bp的LDH3內(nèi)部片段是與5-GTG ampliWed TTATTTCCGCGGTC和5-GCTTAGCCTGATAAA與SMAI消化TCTTC和克隆到pRV300給pRVldh3。 LDH4的437 bp的片段，ampliWed 5-TCTCAATTCAGCGATGGC和5-CTACATCATCAGATGCG和克隆到EcoRV消化pRV300來給pRVldh4。要構(gòu)建的PRV LDH1質(zhì)粒攜帶融合5和 3的LDH1區(qū)域，500 bp的片段相應(yīng)LDH13下游地區(qū)與寡核苷酸5-CGACACCGAGA ampliWed ATTTCTGTG和5-ACATGGATGGTCAATAT

9、GGC并克隆到pRV300用EcoRI消化（作出鈍的Klenow DNApolI的片段）。另外有500 bp的5LDH1在上游區(qū)域與寡核苷酸 ampliWed 5-CGGGGTACCGTCGTTTGGCCAAGCCATC和 5-TTCAAGCAAGCTTCCAATAAC并克隆到上述質(zhì)粒PSTI（消化鈍與Klenow酶）?？寺『匈|(zhì)粒與導致在正確的方向碎片被identiWed限制分析，并命名為PRVLDH1。 PCR的進行與展開高精度聚合酶（Roche）從桿菌屬BL23染色體DNA。 PCR產(chǎn)物凝膠puriWed的gfx-PCR puriWcation試劑盒（GE醫(yī)療機構(gòu)）。限制性內(nèi)切酶，DNA

10、的modiWcation酶和T4連接酶為New England Biolabs公司和Roche公司生產(chǎn)。干酪乳桿菌菌株的轉(zhuǎn)化pRVldh2，pRVldh3，pRVldh4和pVBhic19通過GenePulser儀（BioRad公司）和MRS平板轉(zhuǎn)化紅霉素。通過與相應(yīng)的寡核苷酸和DNA聚合酶鏈反應(yīng)轉(zhuǎn)化在正確的位點整合測試。構(gòu)建LDH1缺陷菌株，干酪乳桿菌BL23通過克隆選擇轉(zhuǎn)化為PRVLDH1和耐紅霉素。一些克隆體在含有紅霉素的MRS培養(yǎng)基上生長約200代沒有產(chǎn)生抗生素，稀釋過后培養(yǎng)的菌種亦是如此。 BL249（LDH1）被選定為第二應(yīng)變基因重組導致質(zhì)粒切除留下缺失性的LDH1，經(jīng)PCR co

11、nWrmed執(zhí)行從敏感紅霉素克隆的DNA的分離。有機酸和葡萄糖的測定干酪乳桿菌細胞培養(yǎng)初期在輔以0.2葡萄糖的MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。有機酸上清液用JASCO PU-2080Plus HPLC系統(tǒng)，耦合紫外檢測器（210 nm），以及使用Rezex ROAOrganic色譜柱進行測定。色譜法在50°C與5 mM的硫酸作為溶劑，XOW速率 0.6毫升/分鐘的條件下進行。 D-乳酸和L-乳酸的同分異構(gòu)體的比例來自R-Biopharm公司的D-/L-lactic酸性試劑盒上（德國達姆施塔特公司）。目前在生長培養(yǎng)基中的糖的測定方法來自R-Biopharm公司的D-葡萄糖試劑盒。表1菌株和質(zhì)粒乳酸

12、脫氫酶酶譜分析細胞成倍生長在10毫升的MRS培養(yǎng)基中的干酪乳桿菌野生型和突變株通過離心回收，用100毫摩爾的Tris-HCl 在pH值7.4條件下在同一buVer中加入 1毫摩爾 硫代-1 ,4-threitol 0.5毫摩爾phenylmethylsulphonyl的xuoride洗滌?；蝿硬Ａе槭辜毎淮蚱疲河妹阅鉈eadbeater（直徑0.1毫米）（Biospec）在12000轉(zhuǎn)4°C條件下離心10分鐘去除細胞碎片。細胞的提取物被加到了6的非變性PAG和稀釋的90V中，在加入100mM pH值6.8的三乙醇胺buVer，0.75 mM的NAD+，0.1毫克/毫升硝基四氮唑，0

13、.02毫克/毫升的phenazyne methosulfate，或者200mM的L-乳酸或200mM的有50的D-乳酸50的L-乳酸的混合物的凝膠電泳培養(yǎng)后檢測乳酸脫氫酶活性。在第二個用含有10的PAG電泳進行檢測0.05SDS。凝膠浸泡60分鐘，在2的Triton X-100中消除SDS并轉(zhuǎn)移到一個含有100mM三乙醇胺buVer pH值6.8，10mM果糖-4,6 - 二磷酸，1mMNADH和25mM丙酮酸鈉的途徑，培養(yǎng)60分鐘后，凝膠用清水沖洗30分鐘置于含有0.25毫克/毫升硝基四唑和0.02毫克/毫升phenazyne methosulfate中培養(yǎng)。蛋白質(zhì)的頻段為在一個黑暗背景下的

14、清晰條帶證明了NADH的氧化酶活性。核苷酸加入編號本文報道的核苷酸序列已在EMBL數(shù)據(jù)庫存依次加入數(shù)字序號AM886174，AM886175，AM886176和AM886177。結(jié)論LDH的同源基因存在于干酪乳桿菌BL23的基因組干酪乳桿菌，除了先前描述的乳酸脫氫酶BL23 8，19，在研究LDH同源性BLAST搜索干酪BL23基因組草圖（96的序列覆蓋率）呈現(xiàn)三個額外的推測LDHs的基因編碼。 “三個額外的LDHs（LDH2，LDH3和LDH4）百分比49%，31%和24，當與干酪乳桿菌BL23LDH1酶相比。 LDH2具有乳酸/蘋果酸脫氫酶的同源性，而LDH3是相似的L-hydroxyis

15、ocaproate細菌脫氫酶。在LDH4中，序列在80左右開始的氨基酸的同源性為L型LDHs，而WRST N-末端氨基酸只共享1 signiWcant，N-末端的二級乳酸脫氫酶的同源性從乳酸乳球菌（LDH-2）。對LDHs序列的推斷發(fā)現(xiàn)，類似于LDH1，LDH2和LDH3蛋白質(zhì)進行守恒的NADH結(jié)合域中含有典型的G-X - G - X - X G紋路（X為任意氨基酸圖1示意圖4-diVerent LDH基因檢測干酪乳桿菌基本法第二十三條連同他們的基因組范圍內(nèi)?；液袑?yīng)序列潛水員從L-干酪ATCC334。莖環(huán)代表假定的轉(zhuǎn)錄終結(jié)酸）。此外，催化的M-G-E-H型的G- D/E - S/T位點的研究

16、，其中H是催化組氨酸，同時也表現(xiàn)在LDH2和LDH3中，從而支持了潛在的乳酸脫氫酶的假設(shè)編碼。 LDH4的酶是展示以LDH1的最低相似性和保持上述最差的序列。為了分配假定的設(shè)想，對新的蛋白質(zhì)的遺傳背景其相應(yīng)的基因進行了研究（圖1）。正如前面描述，LDH1是monocistronic基因并沒有位于它旁邊的基因碳代謝。 LDH2是通過divergently轉(zhuǎn)錄GDH基因編碼在Xanked五肽尾的NADP依賴谷氨酸脫氫酶在三肽尾由基因編碼假定的氨基酸酸和羧酸轉(zhuǎn)運。雖然LDH2似乎也是monocistronic的基因，但LDH2擁有在一些二元酸反應(yīng)步驟的脫氫作用證明它是合理的。 LDH3是Xanked

17、編碼基因假定的脫乙?；?，膜蛋白和ADPribose焦。 LDH4是位于在3肽尾一個丙酮酸diVerent亞基編碼基因簇脫氫酶復合體，似乎形成一個操縱子一個保護假設(shè)蛋白和編碼假定基因古型果糖-1，6-二磷酸酶的inositolmonophosphatase種群。雖然丙酮酸脫氫酶是復雜的，因為它涉及在好氧條件下將丙酮酸的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成乙酰輔酶A的化合物，果糖-1,6-二磷酸酶在糖質(zhì)新生途徑，因此沒有與LDH有明確的聯(lián)系?？傊?，基因組內(nèi)新的LDH基因沒有允許建立可能的假設(shè)細胞的作用。進行了類似的搜索使用研究干酪ATCC334的完整的基因組序列14，新提出的干酪乳桿菌型應(yīng)變，揭示了相同的額外LDH基

18、因的發(fā)生。遺傳結(jié)構(gòu)是相同的DNA攜帶的LDHs菌株除外：（1）在ATCC334中，GDH基因（LSEI_0635）相鄰LDH2和公認的脯氨酸iminopeptidase基因（LSEI_2604）接近LDH3的是假；（2）IS3相關(guān)插入元素，是目前在ATCC與334， LPDA與LDH4之間;（3）基因編碼推測PADR在BL23的缺失似乎是從ATCC 334開始;（4）基因編碼的一種應(yīng)激反應(yīng)膜在ATCC334（LSEI_1313）GTP酶是一個BL23的假基因（圖1）。構(gòu)建不同LDH突變及其乳酸生產(chǎn)效果在以前的工作，LDH1構(gòu)建插入突變一個非復制的質(zhì)粒攜帶一個內(nèi)部片段基因19。為了產(chǎn)生一個穩(wěn)定的

19、突變并避免抗生素抗性標記的存在，L.干酪基本法第二十三條轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PRV LDH1，其中進行的5和3 LDH1 Xanking地區(qū)。后WRST單交叉融合，是一個穩(wěn)定的突變選擇進行了第二次重組事件，從而導致了LDH1完整的染色體缺失。時相比，野生型，新的刪除突變（株BL249）表現(xiàn)出類似的行為以前插入突變BL176：培養(yǎng)上清總是達到了較高的Wnal pH值，它產(chǎn)生的CO2粗提取物中葡萄糖和L-LDH活性降低95（數(shù)據(jù)未顯示）。隨后，LDH2，LDH3，LDH4和hicD基因滅活LDH1背景提供四個雙突變（表1）。在以類似的方式，在LDH2，LDH3和LDH4在干酪乳桿菌的野生型基因被滅活，發(fā)出三個

20、diVerent單突變體（表1）。為了研究上eVect的diVerent突變?nèi)樗嵘a(chǎn)，所有菌株生長在含0.2葡萄糖和乳酸的MRS培養(yǎng)基上測得完成后對葡萄糖的利用。表2中可以看到，LDH1突變對主要乳酸生產(chǎn)的影響，以減少乳酸總額的37的增幅，對D-乳酸進行了觀察。 LDH2，LDH3和LDH4單突變體的表現(xiàn)像野生型（數(shù)據(jù)未顯示）。此外，結(jié)合LDH2，LDH3或LDH4突變及LDH1缺失沒有產(chǎn)生明確一個總的eVect乳酸生產(chǎn)，雖然，D-/L-lactate比例上升超過雙重LDH1 LDH2和LDH1 LDH4相比單LDH1的突變。這些結(jié)果表明，在沒有LDH1的條件下，要么LDH2或LDH4，Hic

21、D或其它的D-乳酸產(chǎn)酶可能減少丙酮酸率較高（見表2）。有趣的是，增加的D-乳酸生產(chǎn)LDH1應(yīng)變在LDH1 hicD雙突變中完全消失。這種conWrmed，在LDH1缺失的條件下，HicD酶是負責輸送丙酮酸以實現(xiàn)D-乳酸的生產(chǎn)。正如前面觀察，LDH1突變導致增加生產(chǎn)丙酮酸和葡萄糖發(fā)酵過程中的醋酸19。然而，在hicD突變過程中，小野生型的D-乳酸的生產(chǎn)仍在觀察。乳酸脫氫酶的酶譜檢測活動的乳酸LDH2，LDH3和LDH4突變的低eVect，合成促使我們尋找額外的存在LDH活性存在于干酪乳桿菌BL23，我們試圖將粗提取物進行酶譜分析檢測。在1 WRST一系列的實驗，細胞提取物的幾株被裝上非變性凝膠和

22、氧化的能力乳酸，加上減少的色基板四氮唑藍（圖2）。 A頻段展現(xiàn)出D-乳酸脫氫酶活性，并為缺失在hicD突變體被明確檢測（圖2a），這表明它是產(chǎn)物的hicD基因。相反，其余的突變并沒有產(chǎn)生1 diVerent的則帶proWle，因此，沒有蛋白帶可以分配到產(chǎn)物或LDH1，LDH2，LDH3或LDH4。單體LDH2，LDH3或LDH4突變株攜帶像野生型（數(shù)據(jù)未顯示）的表現(xiàn)。允許使用1 D-/L-lactate混合物簡單檢測圖2 diVerent干酪乳桿菌株對本地凝膠LDH酶譜分析。50:50混合的D-和L-乳酸開發(fā)出一種凝膠，B膠開發(fā)L-乳酸。箭頭指向參展乳酸脫氫酶的蛋白條帶活動。樂隊相應(yīng)的HicD

23、酶被標記面板A.菌株是“基本法”第二十三條（野生型）; BL249（LDH1）; BL274（LDH1hicD）; BL189（hicD）; BL252（LDH1 LDH2）; BL271（LDH1 LDH3）BL273（LDH1 LDH4）帶凝膠與Llactate培養(yǎng)時缺失而且被分配到一個額外的酶展現(xiàn)的D-乳酸脫氫酶（箭頭1圖2A）。此外，帶L-乳酸脫氫酶活動檢測所有凝膠軌道。這個在任何的LDH突變過程中沒有消失的頻段是增加攜帶LDH1缺失株的信號，提示它對應(yīng)酶的活性，這是誘導后LDH1突變（箭頭2圖2a，b）的。類似結(jié)果也存在于含有或缺乏果糖1,6-二磷酸的過程中，這是LDH1激活（數(shù)據(jù)未

24、顯示）。在第二組實驗中，細胞提取物在SDS-PAGE和SDS被去除之后被解析出來，由于NADH的氧化能力蛋白質(zhì)在凝膠中是可見的。圖3顯示，再次表現(xiàn)出NADH的蛋白條帶只能是存在的具有氧化酶的活性的丙酮酸分派給產(chǎn)物hicD所致。一個沒有丙酮酸控制凝膠除外，HicD帶了相同的結(jié)果缺失（數(shù)據(jù)未顯示）。此外，兩個頻段在丙酮酸缺失的情況下展現(xiàn)出NADH氧化酶的活性表2從葡萄糖生產(chǎn)幾種干酪乳桿菌菌株的有機酸圖3 NADH的氧化酶中存在丙酮酸酶譜分析的diVerent干酪乳桿菌菌株的無細胞提取物上SDSPAG解決處理鈥淢動脈插管和方法鈥箭頭參展的NADH氧化活性增加蛋白質(zhì)點中LDH1背景。的HicD酶的立場

25、是標有一個箭頭。株是“基本法”第二十三條（野生型）; BL249（LDH1）; BL274（LDH1 hicD）; BL189（hicD）; BL252（LDH1 LDH2）;BL271（LDH1 LDH3）和BL273（LDH1 LDH4）檢測和強度增加了LDH1背景（圖3）。討論：LAB的遺傳菌株modiWcation已被用于對工業(yè)生產(chǎn)或食品相關(guān)的分子代謝的途徑的改變。LDH-編碼基因的突變是實現(xiàn)這一目標的一個重要工具，因為它會產(chǎn)生氧化還原失衡，這可以彌補同源NADH氧化的新化合物的合成外源酶的表達4，9，17，20它提供了丙酮酸代謝替代途徑6，13，18。然而，這些方法有時導致所需產(chǎn)物的

26、產(chǎn)量降低。在其他因素方面，這可能會產(chǎn)生氧化增加NADH的其他途徑（即乙醇生產(chǎn)）和替代LDH基因13的表達。在這種情況下，基因組重要的工業(yè)可用性微生物是在發(fā)展至關(guān)重要新戰(zhàn)略旨在改善應(yīng)變。在這工作中，我們試圖確定是否四個基因的研究BL23基因組假設(shè)干酪乳酸脫氫酶編碼將有助于乳酸合成。LDH1突變有一個顯著的來自干酪乳桿菌的eVect代謝反應(yīng)，盡管在突變株測得LDH的活性偏低，但它仍然產(chǎn)生了相當大數(shù)量的L-乳酸。兩種可能性可以解釋：（1）檢測乳酸最佳實驗條件額外的LDH酶（S）或脫氫酶的活性在起作用（2）一個非常低的LDH活性，就足以讓乳酸在低濃度下大幅度堆積增長。在的johnsonii乳酸菌中，基

27、因編碼的D-乳酸脫氫酶的失活，導致LDH活性10降低超過85，而總?cè)樗岙a(chǎn)量只有降低了16，表明乳酸脫氫酶的酶是目前過剩丙酮酸轉(zhuǎn)化的原因。不管怎樣，負責在L型干酪L乳酸的生產(chǎn)酶是未知的。新的identiWed的貢獻是證明了LDH2，LDH3和LDH4的乳酸產(chǎn)量低，而且只有reXected小在D-/L-lactate比例變化雙突變體。存在這樣的可能性，它們在一個基因deWciency上的編碼可以彌補另外兩個基因多余的LDH。這一假說可以證明，如果三聯(lián)或四聯(lián)的突變體在LDH將產(chǎn)生新的基因。此外，存在表現(xiàn)出LDH活性酶譜分析的額外波段指向存在其他unidentiWed酶能降低丙酮酸，乳酸。我們的研究結(jié)

28、果conWrm證明了先前的假設(shè)，HicD負責在D-乳酸水平LDH1的情況下19增加。這種eVect菌在LDH1 hicD雙突變的情況下完全恢復。因此，它的出現(xiàn)，說明HicD酶只有在對乳酸丙酮酸Xux對主要的乳酸脫氫酶活動的終止作用可能占了相當大的一部分。這可能是reXects較低的aYnity與HicD丙酮酸相比，得到LDH1。相反，aYnities為丙酮酸HicD和額外的L型LDH酶可能是類似的。一個附加的HicD探索在BL23基因編碼的酶的基因編碼為33HicD的蛋白，這是100的同源性到LSEI_2156，存在的ATCC334基因組14。此外，酶譜分析表明，微弱的波段與HicD活動相關(guān)。

29、盡管這種推測HicD酶發(fā)揮了D-乳酸合成的作用仍有待證明。但在先前的一份報告中，hicD的突變導致幾乎測不到D-乳酸水平19。然而，目前的實驗結(jié)果表明，少量生產(chǎn)的Dlactate在hicD株野生型中更加持久。這些diVerences可能是的diVerent培養(yǎng)的因果條件。相似的，一些學者報道，一個研究桿菌ldhL ldhD雙基因剔除的條件下產(chǎn)生12-14mM乳酸3，而其他作者的報道60mM乳酸可產(chǎn)生類似的葡萄糖量13。雖然LDH1在BL23的干酪乳桿菌負責主要的LDH活性，但這種蛋白質(zhì)不能被檢測酶譜分析。因此，這種酶不遷移，在非變性凝膠是不可逆轉(zhuǎn)的，經(jīng)SDS或滅活其活性丟失后凝膠電泳是可能的。

30、然而，酶譜分析conWrmed在干酪乳桿菌BL23兩個NADH的氧化酶誘導LDH1突變，這說明了細胞如何響應(yīng)試圖以彌補缺乏通過乳酸脫氫酶NADH再生。NADH / NAD LDH1缺失造成的不平衡可部分彌補NADH的表達，這可能是對O2的依賴，并在一些實驗室的氧化酶占相當比例的NADH的循環(huán)利用5。事實上，干酪乳桿菌LDH1突變株在通氣條件下增長較快19，BL23的基因組檢測表明，至少有三個公認的NADH的氧化酶（數(shù)據(jù)編碼未顯示）。存在一個額外的頻段表現(xiàn)出L型LDH在酶譜的活動表明，酶法機械干酪乳桿菌BL23的丙酮酸減少是比預期更復雜的。有趣的是，作為顯示引起NADH的氧化酶，這種活動較高時L

31、DH1缺失。在一些實驗室，在好氧生長誘導氧依賴于NADH的氧化酶5和研究上的變化在LDH糖代謝的基因剔除株3，16，19揭示了一個深刻的代謝調(diào)整對NAD+再生替代途徑。LDH干酪乳桿菌BL23 deWciency是復雜的，它涉及丙酮酸Xux不僅變化，但也丙酮酸和NADH代謝相關(guān)蛋白的誘導。這強調(diào)需要一個更深層次干酪乳桿菌代謝的知識為基礎(chǔ)，這些化合物進一步的代謝工程的方法。致謝J. Rico的是關(guān)于Corporacion AlimentariaPeñasanta部分資金中船重工研究生獎學金獲得者，在大學的L. casei BL23的基因組進行測序，卡昂，Laboratoire德Micr

32、obiologie DE L'ENVIRONNEMENT，在非洲自然資源Thiverval-Grignon，Microbiologie等GénétiqueMoléculaire研究所AgroquímicaTECNOLOGIA的Alimentos，中船重工，從事諾曼底地區(qū)和非洲自然資源組織成員Wnancial的助手。參考文獻：1.Aarnikunnas J, von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A乳酸菌發(fā)酵的代謝工程（2003）甘露醇和純L-乳酸或丙酮酸生產(chǎn).生物工程Bioeng82:653-66

33、32. Bongers RS, Hoefnagel MH, Starrenburg MJ, Siemerink MA, ArendsJG, Hugenholtz J, Kleerebezem M（2003）J,IS981-介導的建國，適應(yīng)性進化ldhB轉(zhuǎn)錄恢復生產(chǎn)乳酸激活中的乳酸乳酸脫氫酶deWcient的應(yīng)變?nèi)? J Bacteriol185:4499-45073. Ferain T, Schanck AN, Delcour J（1996）C-13核磁共振葡萄糖和檸檬酸的終端產(chǎn)品在ldhLldhD共振分析雙淘汰賽株植物乳桿菌.J Bacteriol 178:7311-73154. Gaspa

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38、ov A, Pavlova N, Karamychev V, Polouchine N, Shakhova V,Grigoriev I, Lou Y,Rohksar D, Lucas S, Huang K, Goodstein DM,Hawkins T, Plengvidhya V, Welker D, Hughes J, Goh Y, BensonA, Baldwin K, Lee JH, Diaz-Muniz I, Dosti B, Smeianov V,Wechter W, Barabote R, Lorca G, Altermann E, Barrangou R,Ganesan B,

39、Xie Y, Rawsthorne H, Tamir D, Parker C, Breidt F,Broadbent J, Hutkins R, OSullivan D, Steele J, Unlu G, Saier M,Klaenhammer T, Richardson P, Kozyavkin S, Weimer B, Mills D（2006）.PROC NATL美國103:15611-15616科學院學報15. Malleret C, Lauret R, Ehrlich SD, Morel-Deville F, Zagorec M（1998）唯一乳酸菌ldhL的基因sakei防止破壞

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41、nholtz J, Starrenburg M, Vanalenboerrigter I,de Vos WM（1995）乳酸鏈球菌的代謝工程：inXuence的-乙酰乳酸合成酶的生產(chǎn)過剩作為一種文化的功能，乳酸脫氫酶deWcient的株條件.應(yīng)用與環(huán)境微生物61:3967-397119. Viana R, Yebra MJ, Galán JL, Monedero V, Pérez-Martínez G（2005）的乳酸脫氫酶的失活在多效eVects干酪乳桿菌.RES微生物156:641-64920. Wisselink HW, Moers APHA, Mars A

42、E, Hoefnagel MHN, de Vos WM, Hugenholtz J（2005）異甘露醇生產(chǎn)過剩1 - 磷酸酶工程甘露醇生產(chǎn)的一個關(guān)鍵因素乳酸乳球菌.應(yīng)用與環(huán)境微生物71:1507-1514附件：外文原文Analysis of ldh genes in Lactobacillus casei BL23:role on lactic acid productionJuan Rico · María Jesús Yebra ·Gaspar Pérez-Martínez · Josef Deutscher ·

43、;Vicente MonederoReceived: 21 December 2007 / Accepted: 13 January 2008 / Published online: 30 January 2008. Society for Industrial Microbiology 2008Abstract Lactobacillus casei is a lactic acid bacterium that produces L-lactate as the main product of sugar fermentation via L-lactate dehydrogenase (

44、Ldh1) activity. In addition,small amounts of the D-lactate isomer are produced by the activity of a D-hydroxycaproate dehydrogenase (HicD).Ldh1 is the main L-lactate producing enzyme, but mutation of its gene does not eliminate L-lactate synthesis. A survey of the L. casei BL23 draft genome sequence

45、 revealed the presence of three additional genes encoding Ldh paralogs. In order to study the contribution of these genes to the global lactate production in this organism, individual, as well as double mutants (ldh1 ldh2, ldh1 ldh3, ldh1 ldh4 and ldh1 hicD) were constructed and lactic acid producti

46、on was assessed in culture supernatants. ldh2, ldh3 and ldh4 genes play a minor role in lactate production, as their single mutation or a mutation in combination with an ldh1 deletion had a low impact on L-lactate synthesis. A _ldh1 mutant displayed an increased production of D-lactate, which was pr

47、obably synthesized via the activity of HicD, as it was abolished in a _ldh1 hicD double mutant. Contrarily to HicD, no Ldh1, Ldh2, Ldh3 or Ldh4 activities could be detected by zymogram assays. In addition, these assays revealed the presence of extra bands exhibiting D-/L-lactate dehydrogenase activi

48、ty, which could not be attributed to any of the described genes. These results suggest that L.casei BL23 possesses a complex enzymatic system able to reduce pyruvic to lactic acid.Keywords Lactobacillus casei · Lactic acid ·Lactate dehydrogenase · Hydroxycaproate dehydrogenase ·M

49、etabolic engineeringIntroductionThe metabolism of sugars by lactic acid bacteria (LAB) is characterized by the production of lactate as the main fermentation product via the action of lactate dehydrogenase,which reduces pyruvic acid to lactic acid. Lactic acid production is important from a biotechn

50、ological point of view,as it can be produced by LAB fermentation of many natural sources and it can be used in the food, pharmaceutical and biopolymers industries 7. In Lactobacillus casei BL23, a strain that has been widely used for genetic, physiological and biochemical studies, two genes encoding

51、 proteins with lactate dehydrogenase activity have been described 8, 12,19. Gene ldh1 codes for an L-Ldh responsible for the synthesis of L-lactate, whilst hicD encodes a D-hydroxyisocaproate dehydrogenase that provides D-lactate. Mutant strains have been constructed in both genes demonstrating that

52、 they were responsible for the main L- and D-lactate formation in this bacterium 19. However, an L. casei BL23 ldh1 mutant still produced substantial amounts of L-lactate and the production of D-lactate was increased. A comparable behaviour has also been reported for other LAB with deleted ldh genes

53、. In this sense, mutation of the genes encoding L- and D-Ldhs from Lactobacillus plantarum, an organism which produces a mixture of 50% D- and 50% Llactate, never resulted in a complete lack of lactate production3. An ldhL mutation in Lactobacillus sakei, a lactic acid bacterium which lacks D-lactat

54、e dehydrogenase activity,resulted in a strain with strongly reduced L- and D- lactate production (the D isomer was a consequence of the presence of a racemase activity able to transform L- into Dlactate)but small amounts of lactate were still produced15. Finally, a Lactobacillus fermentum ldhL-ldhD

55、double knockout was still able to synthesize lactate 1. EVorts have been made to construct LAB strains aVected in one or several of the identiWed ldh genes, as they can be used in the production through fermentation of non-racemic, optically active lactic acid 1. In addition, metabolic engineering s

56、trategies were applied where oxidation of NADH was coupled to an alternative metabolism of pyruvate, leading to the production of value-added metabolites 4, 6, 13, 17.However, deletion of known lactate dehydrogenase genes in combination with the expression of enzymatic activities able to reduce pyru

57、vate is not always suYcient to divert a signiWcant pyruvate Xow towards other molecules of interest diVerent from lactic acid. For those reasons, a better study of the enzymes implicated in lactate synthesis becomes necessary. In an attempt to discover the genes responsible for residual lactic acid

58、production in an L. casei BL23 ldh1 mutant, we searched its genome for the presence of additional ldh genes and studied the eVects of mutations in the newly found ldhs on lactate production.Material and methodsStrains and growth conditionsThe L. casei strains used in this study are listed in Table 1

59、.They were grown in MRS medium (Oxoid) or MRS basal medium, containing per litre: peptone, 10 g; meat extract,8 g; yeast extract, 4 g; Tween 80, 1 mL; K2HPO4, 2 g;ammonium citrate, 2 g; MgSO4.7H2O, 0.2 g;MnSO4.4H2O, 0.05 g and supplemented with 0.2% (w/v)glucose, at 37 °C under static conditions. E. coli DH5_ was used as a cloning host and it was grown in LB medium at 37 °C under agitation. For selecting L. casei transformants,erythromycin was added to the growth medium at 5