PCR引物設(shè)計原則

1、寡核苷酸的優(yōu)化設(shè)計在核酸分子雜交、DNA序列測定和通過PCR放大DNA片段等實驗中，都需要使用寡核苷酸作為探針或引物，而對這些反應(yīng)的質(zhì)量起最重要影響作用的，就是這些寡核苷酸探針或引物。用優(yōu)化的寡核苷酸進行實驗?zāi)軌蚝芸斓玫胶玫慕Y(jié)果，而用不夠合適的寡核苷酸時，常常得出似是而非的結(jié)果，不僅大大增加了后續(xù)實驗的工作量，還可能一無所獲。    怎樣優(yōu)化設(shè)計寡核苷酸呢?至少有下列幾個方面的問題需要考慮。1. 估測可能形成的DNA或RNA雙鏈的穩(wěn)定性    寡核苷酸，無論是DNA的或者RNA的，都有形成雙鏈結(jié)構(gòu)的潛在可能性，正如下面反復(fù)提到的，這種

2、結(jié)構(gòu)對寡核苷酸的作用有很大影響。所以，預(yù)測這種結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性對設(shè)計和優(yōu)化寡核苷酸就很重要。在一個雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的。在熱動力學(xué)中，這樣的性質(zhì)以雙鏈形成時的自由能(G)來表示?，F(xiàn)在，大多采用 Breslauer等人提出的，以最接近的相鄰核苷酸的動力學(xué)數(shù)值(自由能)來預(yù)測雙鏈穩(wěn)定性的方法。為簡化起見，所有的計算都在25 條件下進行。此時，最接近的相鄰核苷酸的自由能是：第一個(5)核苷酸  第二個核苷酸  dA  dC  dG  dT dA  1.9  1.3  1.6  1.5

3、dC  1.9  3.1  3.6  1.6 dG  1.6  3.1  3.1  1.3 dT  1.0  1.6  1.9  1.9                           G(kcal/mol)  &#

4、160;  例如，雙鏈d(ACGGCCGT)的G是：  G(ACGG)G(AC)G(CG)G(GG)(1.33.63.1)8.0 kcal/mol    此計算方法特別適用于測定其3末端會形成雙鏈的引物的相容性。也可以用來計算發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的G。不過，這時需要根據(jù)環(huán)區(qū)內(nèi)核苷酸的數(shù)量添加一定的數(shù)值。如3個核苷酸時為5.2 kcal/mol；4個時為4.5；5個為4.4；6個是4.3；7和8個為4.1 kcalmo1。2. 選擇引物的一般規(guī)則    設(shè)計和選擇引物時有5個要素必需注意。2.1  引物的3末端不互補

5、     引物的3末端一定不能有很大的互補性，因為它們的互補會形成引物二聚體，這就會帶來很大的問題，例如合成出非專一的產(chǎn)物，極大地減少所期望產(chǎn)物的得量。有實驗表明，3末端雙鏈的G是02 kcal/mol時，PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在6時只有40%，到8時少于20%，而10時，接近于0。雖然產(chǎn)量還取決于其他參數(shù)，如退火溫度、引物的專一性等等，但是用Taq聚合酶操作時，由于它的工作能力很強，能夠在很短的時間內(nèi)就識別3末端互補的雙鏈區(qū)并發(fā)動聚合反應(yīng)，即使3末端雙鏈的穩(wěn)定性很差也不能阻礙它的作用，所以這時產(chǎn)量對二聚體的形成就有

6、很大的依賴性。2.2  引物分子內(nèi)不互補     應(yīng)當盡量不用會通過釋放能量而形成分子內(nèi)雙鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其G為3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結(jié)果，但是如果它的3末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時就很麻煩，即會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。當然，如果發(fā)夾環(huán)在5末端對反應(yīng)就沒有多大的影響了。2.3  引物的組分、解鏈溫度和長度    普遍認為PCR引物應(yīng)當有50%的GC/AT比率。其實，這是不對的。以人基因組DNA為模板，用81% AT的引物可以產(chǎn)生單一的，

7、專一的，長250 bp，含有70% AT的產(chǎn)物。完全沒有必要復(fù)雜地去計算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。    要知道，更重要的因素是模板與穩(wěn)定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因為DNA的解鏈溫度也取決于它的長度，所以有的研究者喜歡設(shè)計很長，而不求它很穩(wěn)定的引物。可是，引物太長就難以避免形成二聚體和自身互補，因此，一般還是不用為好。如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500 bp，選用短的(1618 mer)的引物：若產(chǎn)物長5 kb，則用24 mer的引物。有人用2023 mer引物得

8、到40 kb的產(chǎn)物。但是，引物較長時，如果不借助引物選擇的計算機軟件幫助，就很難確定一對引物是否會形成二聚體，是否有自身互補性以及專一性如何。于是，用眼睛選出來的寡核苷酸放大長片段DNA時就會使引物彼此引發(fā)而不是延伸模板，得出非專一產(chǎn)物。通過下述的觀察內(nèi)部穩(wěn)定性原理可以極大地減少這種問題。2.4  引物的內(nèi)部穩(wěn)定性    在DNA測序和PCR中最好用5末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng)。這就是基于引物內(nèi)部穩(wěn)定性的經(jīng)驗之談。其3末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應(yīng)中能起好作用的原因在于，接近

9、或在3末端上的堿基與非靶位點堿基所形成的配對的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應(yīng)，引物的5末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3末端與靶序列任何位點的牢固配合就可以引發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。    如果用3末端低穩(wěn)定性的引物，反應(yīng)的最適退火溫度范圍會不尋常的寬。這就可以不經(jīng)過事先的最佳化實驗就能在最佳條件下進行反應(yīng)。還要注意的是PCR反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量還取決于模板(底物的復(fù)雜性、Tm、產(chǎn)物長度)和退火的溫度與時間。 &

10、#160;  所以，有時3末端穩(wěn)定的引物也可以滿意地進行反應(yīng)。但是，無論如何，寡核苷酸3末端最后5個核苷酸的穩(wěn)定性小于9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3末端越不穩(wěn)定，假引發(fā)的可能性越低。2.5  引物的唯一性     為了放大單個的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應(yīng)當是唯一的，即在模板中沒有重復(fù)序列。雖然不會整個引物序列都偏好于和模板中的一個以上位點匹配，但是，通常見到的引物的3末端往往都有67個沒有什么個性的核苷酸。如果假引發(fā)的位點正好在放大區(qū)的內(nèi)部，那麻煩就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或雜

11、交效率，就容易產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。    如果用哺乳動物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復(fù)元件來核對想用的引物的互補性。由此也可知，應(yīng)當避免使用同寡聚物(如AAAAAA)和二核苷酸重復(fù)(如ATATAT)。3. 按照氨基酸序列設(shè)計寡核苷酸    按照多肽的氨基酸序列來設(shè)計 PCR引物或雜交探針是最常用的實驗手段，尤其是在試圖“釣取”一個蛋白質(zhì)的基因時。此時要注意的問題有：    (1)寧可用簡并引物，也不用猜測的引物。氨基酸密碼子的簡并性給予引物設(shè)計以可塑性，這比用猜測的密碼子要好得多。有人用1

12、024個簡并引物得到很好的結(jié)果。    但是，應(yīng)當避免在一個區(qū)域內(nèi)有很高的簡并性。但也有簡并性低使引物不工作的報道。    (2)引物與模板的錯配。一般認為，所用引物與模板有15%20%的錯配，PCR的效果還能接受。但是，引物3末端的錯配比同樣錯配率的5末端錯配會引起更嚴重的問題。    在最后4個堿基中有2個錯配的引物，其 PCR產(chǎn)量急劇下降。但是，當核苷酸濃度高時，3末端有錯配的引物還能被Tag聚合酶很好地利用。在0.8 mmol/L時，大多數(shù)3末端錯配引物可以接受，雖然非專一產(chǎn)物比較多，DNA合成的

13、忠實性也下降。即使在低核苷濃度下，還會有少量從錯配堿基出發(fā)的合成，因此，在開始的PCR循環(huán)中把退火時間增加到35分鐘，比之于用標準退火時間和高濃度核苷酸能夠產(chǎn)生質(zhì)量更好的所求產(chǎn)物。    (3)在用唯一性引物時，建議用0.2 mmol/L或更低的總核苷酸濃度，因為高濃度會增加錯誤參入的比率。    (4)簡并寡核苷酸時，PCR應(yīng)當在比較高的引物濃度下進行，即13 mol/L而不是0.2 mol/L，因為在反應(yīng)混合物中的大多數(shù)寡聚物并不是被用來引發(fā)專一的反應(yīng)，而只是產(chǎn)生高的背景而已。PCR引物設(shè)計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使

14、其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。 要設(shè)計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時應(yīng)預(yù)測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構(gòu)。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計引物?，F(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計一對引物。一般引物長度為1530堿基，擴增片段長度為100600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設(shè)計的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計引物。      

15、 同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的互補。    引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3端開始的。這里還需提醒的是3端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。     綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計原則：  引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。 引物長度一般在1530

16、堿基之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。  PCR引物設(shè)計原則   PCR引物設(shè)計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計。 1.引物的特異性 引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基

17、同源。 2.避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū) 某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（G°）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。3.長度寡核苷酸引物長度為1530bp，一般為2027mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因為>38時，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74)

18、,不能保證產(chǎn)物的特異性。 4.G+C含量 G+C含量一般為40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。 5.堿基礎(chǔ)隨機分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。6.引物自身引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。7.引物之間 兩引物之間不應(yīng)不互補性，尤應(yīng)