纖維素降解菌選育研究進(jìn)展及未來趨勢(shì)

1、纖維素降解菌選育研究進(jìn)展及未來趨勢(shì)邢鵬飛（生命科學(xué)學(xué)院級(jí) 生物工程二班）摘要本文總結(jié)纖維素酶高產(chǎn)菌選育的國內(nèi)外研究進(jìn)展，概括了迄今為止篩選出的 纖維素酶高產(chǎn)菌的徽牛物種群及其產(chǎn)酶特點(diǎn)，以及誘變育種、原牛質(zhì)體融合技術(shù) 育種、纖維素酶基因克隆的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，對(duì)今后纖維素降解菌的選育研究未 來發(fā)展趨勢(shì)做了分析和綜述。關(guān)鍵詞：微生物；降解；纖維素；纖維素酶；選育；纖維素是地球上廉價(jià)且年產(chǎn)量巨大的可再牛資源。微牛物作為處理纖維素的 一種手段，把纖維素水解成有葡萄糖等物質(zhì)，進(jìn)一步發(fā)酵生產(chǎn)酒精、有機(jī)酸等人 類急需的能源食物和化工原料等，不僅對(duì)環(huán)境危害小，而且可以避免由于化石嫌 料燃燒所帶來的環(huán)境污染，更重

2、耍的是可以緩解或解決世界性能源危機(jī)以及因石 油短缺引起的國際問題等。篩選出高性能纖維素降解菌是開發(fā)利用纖維素資源的 前提和關(guān)鍵。一、纖維素纖維素的基本結(jié)構(gòu)纖維素是d-葡萄糖昔以3-1, 4糖背鍵連接而成的鏈狀高分子化合物，含 碳、氫、氧三種元素，其中碳含量為44.44 z氫含量為k n%,氧含量為4亂vi%, 其分子式用（c6h10o5） n表示（n為聚合度），纖維二糖是其基本組成單元， 一般認(rèn)為纖維素分子約由個(gè)葡萄糖殘基構(gòu)成。常溫下不溶于水、不 溶于稀酸和稀堿。纖維素聚集體內(nèi)的氫鍵分布不均勻，有的基木上全是氫鍵，排列定向有序, 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這樣的區(qū)域稱為結(jié)晶區(qū)，其他區(qū)域則稱為無定型區(qū)。所謂結(jié)晶

3、度，即 指結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分率。纖維素纖維的結(jié)晶度增高，則硬度、密度等隨之增加，而柔軟性和化學(xué)反應(yīng)性等均降低，因此微生物對(duì)它的利用越困難。無定形區(qū)結(jié)構(gòu)比較疏松，易被微生物利用2纖維素的降解機(jī)理纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難被降解。一般的降解方式主要有機(jī)械降解、水解、 熱降解、氧化降解、光化學(xué)降解及酶（生物）降解等。但前幾種方法有成本高、 降解條件繁瑣及易造成環(huán)境污染等缺點(diǎn)，而生物降解方法主要是應(yīng)用纖維素酶來 催化降解纖維素，因其高度的專一性和低成木成為了目前主要關(guān)注的一種手段 131。纖維素酶降解纖維素的機(jī)制至今仍不清楚。但被普遍接受的假說主要有三 種：cm.r假說，順序作用假說和協(xié)同作用假說。

4、（i） tip假說kw年，k等人提出了著名的m.r假說（如圖l2）該假說認(rèn)為，ci 酶首先用于結(jié)晶纖維素使其變成無定形纖維素，再被酶進(jìn)一步水解成可溶性 纖維素和纖維糖，接著b 葡萄糖營酶將后者水解成葡萄糖，即ci酶的作用是 酶水解的先決條件但該假說對(duì)酶的作用機(jī)理闡述不清，只提出了多種推測(cè)。cicx卜匍萄糖昔酶結(jié)晶纖維素?zé)o定形纖維素k纖維二糖k葡萄糖圖1.2 c1-cx假說中纖維素降解機(jī)制(2)順序作用假說此假說以enari等人為代表，他們認(rèn)為外切型葡聚糖酶(cbh)首先將不溶 性纖維素水解，生成可溶性的纖維二糖和纖維糊精，內(nèi)切葡聚糖酶(eg)作用 于纖維糊精生成纖維二糖，再由b 葡萄糖昔酶將纖

5、維二糖水解為葡萄糖。同樣, 此假說在以后的實(shí)驗(yàn)中也未得到驗(yàn)證。o)協(xié)同作用模型目前，被大多數(shù)學(xué)者所接受的降解機(jī)制是協(xié)同作用模型。這種假設(shè)認(rèn)為，首 先由gp酶切割纖維素的無定形部位產(chǎn)生新的非還原性末端，然后由ci酶以纖維 二糖為單位從末端水解，最后由b 葡萄糖昔酶將纖維二糖水解為葡萄糖。有人 認(rèn)為內(nèi)切外切纖維素酶協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制，其酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)并未發(fā)生改變，只 是幾個(gè)催化順序反應(yīng)的酶組分混合后，后一個(gè)酶將前一個(gè)酶的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，去除了 產(chǎn)物抑制或空間的阻礙效應(yīng)，提高了反應(yīng)速度im。、菌種的選育2.1自然界中菌株的篩選從自然界篩選纖維素分解菌是構(gòu)建高效纖維素分解技術(shù)的基礎(chǔ)性工作。為了 獲得酶活性較高的

6、野生纖維素降解菌，國內(nèi)外科學(xué)工作者自2世紀(jì)"年代開始 做了大量的工作，目前已篩選到很多纖維素降解菌，主耍包括細(xì)菌、放線菌和絲 狀真菌等。最近兒年在篩選新的菌種方面有很大進(jìn)展，已發(fā)現(xiàn)的具有纖維素降解 能力的微牛物有2多種。蔡興旺等從中國天津地區(qū)堆肥中分離篩選到纖維單抱 菌(cellulomonas sp.),白洪志等在野生森林土樣中篩選到簡(jiǎn)青霉等。目前纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選除了尋找高活力的產(chǎn)酶菌外，再就是尋找具有特 殊活性的產(chǎn)酶菌株，如中性堿性纖維素酶，低溫、高溫纖維素酶等。2m8年，中 國學(xué)者韓覩從汕尾一鮑角場(chǎng)采集的樣品中分離出2株能適應(yīng)海水高鹽環(huán)境的纖 維素降解菌，經(jīng)初步鑒定這兩株菌

7、分別為vibrio alginolyticus和aeromonassobriao 2hb年kaur j篩選到一株嗜熱菌m elanocarpus sp.可產(chǎn)生較高活力的耐熱、中性 纖維素酶，有可能成為一個(gè)產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株。2hs年郭大城分離出一株 適宜在堿性條件下生長(zhǎng)的高效纖維素降解菌，該菌在h為all的范圍內(nèi)能夠產(chǎn) 生纖維素酶。經(jīng)初步鑒定該菌株為節(jié)桿菌(arthrobacter sp.)。2. 2誘變育種通過大量的篩選評(píng)價(jià)工作發(fā)現(xiàn)直接從自然界屮篩選獲得單株降解效率高且 適應(yīng)性強(qiáng)的微生物的幾率較少，耍獲得理想的降解菌往往需耍對(duì)所篩選出的菌株 進(jìn)行改造，人工誘變是目前常采用的改造方法，主要包

8、括物理誘變、化學(xué)誘變和 牛物誘變。(i)物理誘變利用紫外光對(duì)目標(biāo)菌種進(jìn)行處理，使其發(fā)生變異，從而篩選出降解效果更好 的纖維素降解菌種是目前比較常用的一種誘變方法。物理誘變劑包括紫外線 （価、微波、*射線、w射線、a射線、空間誘變和超聲波等。在微生物誘變育 種屮前四種較常用。國外這方面工作開展得很早，年farkas v等人就利用紫外線處理綠色 木霉（t.viride） qm94 14的分生他子；年，witkowskad 1241等人用紫外線 處理綠色木霉的菌體，突變體的酶活性最高可達(dá)到原始菌株的倍。在國內(nèi)， 趙瓊i2si以木醋桿菌（acetobacter x ylinum cl為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)

9、行紫外誘變, 獲得一株細(xì)菌纖維素酶高產(chǎn)菌株a.xylinumc«44,該突變株的產(chǎn)量是原始菌株的 “倍。（2）化學(xué)誘變化學(xué)誘變是利用一些化學(xué)藥品改變微牛物的遺傳物質(zhì)，從而獲得某一特性的 正突變體?；瘜W(xué)誘變劑種類很多，主要有烷化劑、堿基類似物、脫氨劑、金屬鹽 類、移碼突變劑等。其屮，烷化劑因可與筑基、竣基和氨基基團(tuán)直接反應(yīng)而引起 基因突變，應(yīng)用的較為廣泛。叭 年，h i2w等人利用秋水仙素處理里 氏木霉 郴 的菌絲體，再用 *4甲基磺酸乙脂處理突變體，得到兩株新的突 變體，每株纖維素酶產(chǎn)量都高于出發(fā)菌株，經(jīng)i次傳代仍然很穩(wěn)定。董志揚(yáng) s 等人使用y射線和亞硝基呱交替處理康寧木霉的分生抱

10、子，突變株酶活提高 l73倍。還有研究表明紫外光與化學(xué)誘變劑結(jié)合使用會(huì)提高其產(chǎn)生突變體的效 果。如年石家冀 s 等以康寧木霉p為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線和亞硝基弧 處理，得到突變體tm敕 酶活力是出發(fā)菌株的倍。曾瑩等列 以t： 為出發(fā)株，經(jīng)過紫外線和硫酸二乙脂、亞硝酸和氯化鋰交替處理，突變體酶活力 是出發(fā)菌株的倍。o）生物誘變生物誘變主要是利用微生物之間的相互關(guān)系，通過另一種微生物生長(zhǎng)代謝過 程中所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)誘變株產(chǎn)生作用，使誘變株的遺傳變異向人們所需 方向進(jìn)行。這種方法最符合微牛物牛態(tài)的要求，但誘變菌難求且過程難以控制， 故較少用。近些年來，為了增強(qiáng)誘變效果，常采用物理誘變與化學(xué)誘變相

11、結(jié)合的方法?？傮w來說，紫外光誘變操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，一般實(shí)驗(yàn)室條件下都可以達(dá)到, 且出現(xiàn)正突變的兒率較高。而化學(xué)誘變?cè)谀撤N程度上應(yīng)用更廣泛，其可操作性強(qiáng), 簡(jiǎn)單易行，特異性強(qiáng)，能誘變定位到衛(wèi)上的某些堿基，后代較易穩(wěn)定遺傳。因 此，在實(shí)際應(yīng)用中，研究者應(yīng)根據(jù)出發(fā)菌株及實(shí)驗(yàn)室條件等具體情況來選擇合適 的誘變方法。2. 3原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合育種，指通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生 質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子，從而得到新物種的育 種方法。這種方法打破了微生物的種界界限，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組，可使 遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機(jī)會(huì)。原生質(zhì)體

12、融合技術(shù)在微生物育種上的應(yīng)用也十分廣泛，現(xiàn)已成為工業(yè)徽生物 改良的一種快速有效的手段。近年來采用原生質(zhì)體融合技術(shù)改良纖維素酶生產(chǎn) 菌株的研究日益增多。比如.里氏木霉能大量合成外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶. 但是其b 葡萄糖卄酶活力低而黑曲霉a.niger的b 葡萄糖卄酶活力很高°為了充分利用里氏木霉和黑曲霉這2個(gè)遠(yuǎn)緣屬種間的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)性狀可將里氏木霉 和黑曲霉進(jìn)行原牛質(zhì)體融合篩選到的融合子可能具有兩屬的優(yōu)點(diǎn)。2. 4基因工程技術(shù)構(gòu)建纖維素降解菌ulinulin高效工程菌利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)己從不同的物種屮克隆了大量的纖維 素酶基因從中選擇那些比活力高、酶性質(zhì)優(yōu)良的纖維素酶基因?qū)⑺鼈兺?/p>

13、效的 啟動(dòng)子或染色體起始位點(diǎn)相融合實(shí)現(xiàn)纖維素酶基因的異源或同源高效表達(dá)將 是構(gòu)建纖維素降解菌的有效途徑。纖維素酶基因克隆研究起始于2世紀(jì)t年代末，早在iw3年penttila m e 等已經(jīng)能夠?qū)⒔z狀真菌里氏木霉屮得到的兩種內(nèi)切葡聚糖酶的cdna的拷貝在 酵母磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子的調(diào)控下在真核表達(dá)系統(tǒng)釀酒醉母中表達(dá)。目 前，利用基因工程技術(shù)將纖維素酶的基因克隆到細(xì)菌、酵母、真菌和植物中，在 國內(nèi)外均取得了一定的進(jìn)展。在國外，wood d3i等在大腸桿菌e.coli koll中表 達(dá)了 erwinia chrysanthemipsm21的葡聚糖內(nèi)切酶基因，最終得到的重組纖維素 酶在每升培養(yǎng)基

14、中可產(chǎn)生高達(dá)32nso在國內(nèi)，周圣德等utl將erwinia chrysanthemi的cely, celz基因整合到能夭然代謝纖維二糖的k.oxytocamsa 1的產(chǎn)乙醇菌株p2的染色體上對(duì)菌株進(jìn)行改良。經(jīng)過改良的新菌株產(chǎn)生的乙醇 量比對(duì)照提高22成 三、小結(jié)與展望纖維素作為一種巨大的可再生能源物質(zhì)，在石油、礦產(chǎn)資源即將耗竭的今天, 其應(yīng)用潛力已經(jīng)是毋庸置疑。如何才能有效環(huán)保地利用纖維素資源，已經(jīng)成為了 一項(xiàng)重要的課題。微生物廣泛存在于自然界中，可產(chǎn)生多種纖維素酶，具有酶系 全、可分泌至胞外、易純化等優(yōu)點(diǎn)。所以，利用微牛物降解纖維素是一種專一性 強(qiáng)、高效、經(jīng)濟(jì)及環(huán)保的方法。因而，國內(nèi)外對(duì)纖

15、維素降解菌選育研究高度重視。從自然界不斷地尋找和開發(fā)纖維素降解新菌種，選育出纖維素酶高產(chǎn)菌優(yōu)良 菌株是今后纖維素資源能否高效利用的關(guān)鍵問題，具有非常重要的生態(tài)效益、經(jīng) 濟(jì)效益和社會(huì)意義。在21世紀(jì)這個(gè)知識(shí)經(jīng)濟(jì)時(shí)代，隨著人們對(duì)纖維素酶高產(chǎn)菌 的篩選方法及產(chǎn)酶研究堅(jiān)持不懈地探索，將會(huì)逐步解決目前的局限性，纖維素酶 的活力單位不斷提高，纖維素酶的生產(chǎn)成本不斷下降。我們相信今后纖維素降解 菌株的選育研究將開拓出更多新的發(fā)展領(lǐng)域，使纖維素的生物降解取得長(zhǎng)足進(jìn) 展，獲得更多超高性能纖維素降解菌株。參考文獻(xiàn)：26 toyama h.construction of cellulose perproducing

16、 strains derived from polyploids of trichoderma reeseij. microbios, 1999,100 (395):7-18.27 董志揚(yáng)祝令香于巍等纖維素酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及產(chǎn)酶條件研究n核農(nóng)學(xué)扌r,2001,15(1):26-31.28 shi j. selection of beta-glucanase-producing trichoderma koningii t199 and its fermentation conditionsj. acta microbiologica sinica, 2001,41 (6):750-752.29 曾瑩.，胡塞陽，邱雁臨，等纖維素酶高產(chǎn)菌株的誘變選育bl微生物學(xué) 志,2003,11,23(6):23-26.l33wood b e, beall d s, ingram l o. production of recombinant bacterial endoglucanase as a coproduct with ethanol during fermentation using derivatives of escherichia coil koiij. biotechnol