宏基因組測序講解

1、宏基因組測序目的研究藻類物種的分類，研究與特定環(huán)境與相關的代謝通路，以及通過不同樣品的比較研究微生物內部，微生物與環(huán)境，與宿主的關系。技術簡介宏基因組 （Metage nome）（也稱微生物環(huán)境基因組 Microbial Environmental Genome,或元基因組）。是由Handelsman等1998年提出的新 名詞， 其定義為"the genomes of the total microbiota found in nature", 即生境中全部微小生物遺傳物質的總和。它包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因，目前主要指環(huán)境樣品中的細菌和真菌的基因組總和。而所謂

2、宏基因組 學（或元基因組學，metagenomics）就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因 組為研究對象，以功能基因篩選和/或測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協(xié)作關系及與環(huán)境之間的關系為研究 目的的新的微生物研究方法。一般包括從環(huán)境樣品中提取基因組 DNA,進行高通 量測序分析，或克隆DNA到合適的載體，導入宿主菌體，篩選目的轉化子等工作。宏基因組 （Metage nome）（也稱微生物環(huán)境基因組 Microbial Environmental Genome,或元基因組）。是由Handelsman等1998年提出的新 名詞， 其定義為"the g

3、enomes of the total microbiota found in nature", 即生境中全部微小生物遺傳物質的總和。它包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因，目前主要指環(huán)境樣品中的細菌和真菌的基因組總和。而所謂宏基因組 學（或元基因組學，metagenomics）就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因 組為研究對象，以功能基因篩選和/或測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協(xié)作關系及與環(huán)境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法。一般包括從環(huán)境樣品中提取基因組 DNA,進行高通 量測序分析，或克隆DNA到合適的載體，導入宿主菌體，篩選目

4、的轉化子等工作。特定生物種基因組研究使人們的認識單元實現(xiàn)了從單一基因到基因集合的 轉變，宏基因組研究將使人們擺脫物種界限，揭示更高更復雜層次上的生命運動 規(guī)律。在目前的基因結構功能認識和基因操作技術背景下，細菌宏基因組成為研究和開發(fā)的主要對象。細菌宏基因組細菌人工染色體文庫篩選和基因系統(tǒng)學分析 使研究者能更有效地開發(fā)細菌基因資源，更深入地洞察細菌多樣性。如宏基因組 成為生物催化劑的新來源。宏基因組學研究的策略和基本過程研究策略“宏基因組學”是一種整體性的研究策略，它建立在微生物基因組學的迅速 發(fā)展和聚合酶鏈式反應廣泛應用的基礎之上， 是一種不依賴于人工培養(yǎng)的微生物 基因組分析技術，涵蓋了生物信

5、息統(tǒng)計分析和基因組兩方面的意義和技術，其策略是從特定環(huán)境中直接分離所有微生物 DNA將大片段的DNA克隆到受體菌中表 達，然后根據某些生物活性篩選有應用價值的克隆。包括兩個方面920:宏基因組文庫的構建：宏基因組文庫的構建沿用了分子克隆的基本原理和技術方 法，并根據具體環(huán)境樣品的特點和建庫目的采用了一些特殊的步驟和對策。一般包括樣品總DNA的提取、與載體連接和在宿主細胞建立中克隆17。宏基因組文庫的篩選：根據其研究目的，宏基因組文 庫篩選通常有功能 篩選(functional screening)和序列篩選(sequenee based screening) 兩種方法。2宏基因組學的研究步驟基

6、因組學的研究過程，一般包括從環(huán)境樣品中提取基因組 DNA克隆DNA到 合適的載體，導入宿主菌體，篩選目的克隆等 4個步驟。特別要指出的是，在基 因組學研究領域中，其研究目標通常是測定單一物種的基因組序列；而在宏基因組學中，則是要測定由多種微生物組成的復雜群體(community)的混合基因組序 列。這種差別的關鍵就是，絕大多數(shù)細菌是不可培養(yǎng)的，因此沒有足夠的研究材 料。2.1分離特定環(huán)境生物DNA方法上不同于傳統(tǒng)的先培養(yǎng)微生物再提取 DNA勺做法，而是首先直接收集能 夠代表特定生物環(huán)境生物多樣性的樣品； 然后利用各種理化方法破碎微生物，使 其釋放DNA再利用密度梯度離心等方法進行分離純化。2.

7、2純化的大分子量DNA進行克隆在對DNA酶切或者超聲打斷處理，并與合適的載體 DNA進行連接，構建重 組體。2.3將帶有宏基因組DNA的載體通過轉化方式轉入模式微生物建立各自的 無性繁殖系例如轉入大腸埃希菌中，使那些以前無法研究的不可培養(yǎng)微生物的DNA在模式微生物中得到復制、表達，進而得到研究。所有帶有宏基因組 DNA載體的 模式微生物克隆構成宏基因組文庫。2.4對宏基因組文庫的DNA進行分析基于不同的研究目的，有很多分析方法，主要分為兩類：一類為表型功能篩 選，即利用模式微生物表型的變化篩選某些目的基因。例如從文庫中篩選能表達 抗菌物質的克隆。功能分析法根據重組克隆產生的新活性進行篩選， 可

8、用于檢測 編碼新型酶的全部新基因或者獲取新的生物活性物質。另一類為序列基因型分 析，即對文庫中所有或部分的 DNA進行測序分析，以應用于生態(tài)學研究。例如 分析文庫中16SrRNA序列，對所研究生態(tài)環(huán)境的多樣性進行評估。一個典型的宏 基因組分析涉及多個輪次，以確保從生態(tài)環(huán)境標本中分離到目的基因， 及盡可能 多地分析DNA序列所編碼的信息。3宏基因組學的技術方法宏基因組學是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活 性、相互協(xié)作關系及與環(huán)境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法。宏基因組學的研究策略和方法大致相同，

9、現(xiàn)按照宏基因組學研究的基本過程和策略對常用方法和技術予以簡要介紹。3.1樣品總DNA的提取及基因或基因組DNA勺富集提取的樣品DNA必須可以代表特定環(huán)境中微生物的種類， 盡可能代表自然狀 態(tài)下的微生物原貌，獲得高質量環(huán)境樣品中的總DNA是宏基因組文庫構建的關鍵之一。要采用合適的方法，既要盡可能地完全抽提出環(huán)境樣品中的DNA又要保持較大的片段以獲得完整的目的基因或基因簇45。所以總的提取總是在最大提取量和最小剪切力之間折中。應嚴格操作，謹防污染，并且保持DNA片段的完整和純度。已有許多商品化宏基因組DNA提取試劑盒可用，同時很多實驗室仍 致力于宏基因組DNA提取方法的改進68。常用的提取方法有直

10、接裂解法和間接提取法（細胞提取法）。直接裂解法是將 環(huán)境樣品直接懸浮在裂解緩沖液中處理，繼而抽提純化，包括物理法（如凍融法、超聲法、玻璃珠擊打法、液氮研磨法等）和化學法、酶法等。不同直接裂解法的 提取方法差別在于細胞破壁的方式不同。此法操作容易、成本低、DNA提取率高、 重復性好，但由于強烈的機械剪切作用，所提取的DNA片段較?。?-50kb），難以 完全去除酚類物質。細胞提取法先采用物理方法將微生物細胞從環(huán)境中分離出 來，然后采用較溫和的方法抽提 DNA如先采用密度梯度離心分離微生物細胞， 然后包埋在低熔點瓊脂糖中裂解，脈沖場凝膠電泳回收DNA此法可獲得大片段DNA（20-500kb）且純度

11、高，但操作繁瑣，成本高，有些微生物在分離過程中可能 丟失，溫和條件下一些細胞壁較厚的微生物 DNA也不容易抽提出來。為了更好地反映環(huán)境中的微生物種群并且提高陽性克隆的占有率， 需要在克 隆之前通過不同的方法對感興趣的目的基因或基因組進行富集 9 11，一個比 較好的富集方法是穩(wěn)定同位素示蹤技術12。抑制性消減雜交技術13是抑制性與消減雜交技術相結合的更簡單、更快速 的分離差異基因的方法。該方法不僅利用了消減雜交技術的消減富集，同時也利用了抑制性技術進行了高效率的動力學富集，所以該技術是一項富集特定基因、 證實微生物之間基因不同的非常有用的技術方法。3.2宏基因組文庫的建立宏基因組文庫的構建策略

12、取決于研究的整體目標。偏重于低拷貝、低豐度基因還是高拷貝、高豐度基因要取決于研究的目的是單個基因或基因產物還是整個 操縱子及編碼不同代謝途徑的基因簇?；蛭膸斓慕⑦^程中需要選擇合適的克 隆載體和宿主菌株。傳統(tǒng)的方法是直接利用表達載體構建宏基因文庫，但是表達載體可插人的宏基因片段一般小于 10kb?？寺≈兴拗骶甑倪x擇主要考慮到轉 化效率、宏基因的表達、重組載體在宿主細胞中的穩(wěn)定性以及目標性狀的篩選等。 目前大腸桿菌是最為常用的宿主14，此外，鏈霉菌和假單胞菌也可以作為構建 文庫的宿主，不同微生物種類所產生的活性物質有明顯差異，不同的研究目標應選擇不同的宿主菌株。3.3宏基因組文庫的篩選由于環(huán)

13、境基因組的高度復雜性，需要通過高通量和高靈敏度的方法來篩選和 鑒定文庫中的有用基因。篩選技術大致可分為四類：基于核酸序列差異分析； 基于目的克隆功能的特殊代謝活性； 基于底物誘導基因的表達；基于包括 穩(wěn)定性同位素和熒光原位雜交在內的其他技術。.3.1基于序列的篩選方法通常根據已知相關功能基因的保守序列設計探針或PCR引物，通過雜交或PCF擴增篩選陽性克隆。用這種方法有可能篩選到某一類與已知序列相近的新基 因，這一策略可以分離已知基因家族的新成員和含有高度保守區(qū)的酶基因1516。另一種方法是對含有16SrRNA等系統(tǒng)進化錨定基因的克隆進行測序或對文 庫隨機測序17。優(yōu)點是不必依賴宿主菌株來表達克

14、隆基因，缺點是必須對相關基因序列有一定的了解，文庫中那些和現(xiàn)有基因序列完全不一樣的基因無法被篩 選，故難以發(fā)現(xiàn)全新的活性物質，對鑒定新的基因成員有一定的局限性，也很難獲得全序列。直接序列分析法(sequenee driven screening method)是對所構建宏基因 組文庫的克隆進行隨機測序分析，顯然可以得到最多的信息1820。也可用鳥槍法對宏基因組文庫進行測序，但需要進行大量的測序和分析工作，需大量人 力、物力及財力。雖然DNA序列分析技術不斷發(fā)展，但與個體微生物基因相比， 宏基因組文庫包含著巨大的序列片段，但對這些序列片段進行后續(xù)的分析則極為 困難，結合其他的篩選方法可以得到更多

15、的信息。用微陣列技術(基因芯片)進行初步篩選，可以很大程度上減少測序量和后續(xù) 的序列拼接等工作量。但微陣列技術在用于宏基因組文庫篩選時， 除了其本身由 于交互雜交等導致的特異性低、靈敏度較差等缺點外，同樣不能用于對未知功能 基因的篩選，且檢測不到環(huán)境中存在的那些低豐度微生物的序列 21 22。3.3.2基于功能的篩選方法功能性篩選法是以活性測定為基礎，通過建立和優(yōu)化合適的方法從基因組文 庫中獲得具有特殊功能的克隆，然后通過序列和生化分析研究這些克隆。由于基于活性的篩選不需要已知序列的信息，故能較快地找到可用于工農業(yè)和醫(yī)藥的蛋 白質和天然產物。功能性篩選的方法有兩種，一種是對具有特殊功能的克隆子

16、進 行直接檢測，如利用其在選擇性培養(yǎng)基上(如含有化學染料和不可溶的或發(fā)光的 酶反應底物)的表型特征進行篩選23。這種方法具有較高的靈敏度，可檢測到 較少的目的克隆。另一種方法是基于異源基因的宿主菌株與其突變體在選擇性條 件下功能互補生長的特性進行24。功能性篩選法的優(yōu)點是篩選過程比較簡單、快速，只要基因能表達，就可以根據基因表達特性進行篩選，不需要復雜的實驗過程。不足之處是這種篩選方法 依賴于目的基因在新的宿主中表達，但使用模式微生物并不能把所有的宏基因組 DNA表達出來，而且要求克隆到基因或基因簇的全長，一旦克隆過程中破壞基因 某個組件將使得基因沒法表達，也就不能根據功能進行篩選，故檢出的概

17、率很低， 工作量大，往往從上萬個克隆中只能篩選到幾個有用的克隆。3.3.3 底物誘導基因表達篩選(substrateinduced geneexpressionscree ning, SIGEX)SIGEX是用于能利用各種底物誘導的分解代謝型基因的檢出，并結合生物發(fā)光技術用來篩選代謝相關基因及酶基因25。由于編碼相關代謝基因或酶基因通常呈 簇存在，通常與該物質誘導的啟動子和同源轉錄調控序列毗鄰，往往在有底物誘導的條件下才表達，反之則不表達。首先構建一個含有綠色熒光蛋白(GFP)的表達載體，這個載體可將宏基因組 DNA克隆到GFF基因上游，使該基因的表達受到 宏基因組DNA片段中的啟動子調控。當

18、外加目標底物時，可以影響GFP的表達，進而通過活細胞熒光分離技術 (fluorescenee activated cell sorting, FACS)，在添加特定底物的條件下對表達庫進行篩選，就能夠得到對該底物具有代謝活性的克隆SIGEX在宏基因組研究中具有很多優(yōu)勢，它提供了一個有效的和經濟的檢測 手段，大大增加了篩選的容量和效率，節(jié)省了時間，為高通量篩選提供了保障， 而且不需要對在顏色篩選中使用的底物進行修改，勿需擔心因修改底物而產生毒性；且可以從底物來推斷得出未知的酶，繼而推斷基因的功能。而SIGEX法的不足之處是目標基因的結構性和適應性很敏感，同時，無法用于分析不能進入細胞質的底物，而

19、且FACS對進樣設備的要求也比較高；代謝特定底物的調控子和操 縱子在位置上不一定都相鄰；同時有些基因的表達除了受底物誘導外，還可能受其他因子的誘導，而有些基因并不需要誘導，是本底水平表達的，有些可誘導基 因在新的宿主中有可能不可被誘導表達。 但是考慮到宏基因組文庫中含有大量的 基因，其中必然有一部分是可誘導的，是可以被該技術檢測到的。所以只要對這 些不足之處進行優(yōu)化，選擇合適的條件，SIGEX法仍然是一種宏基因組文庫篩選 的有效方法，尤其適合于在工業(yè)上使用26。3.3.4基于穩(wěn)定性同位素技術篩選方法具有相同原子序數(shù)但不同中子數(shù)目且不具放射性的元素稱為穩(wěn)定同位素(stable isotope probing, SIP)。環(huán)境中的許多物質都可以用 SIP來標記，鑒定和分析復雜樣本中進行有特殊代謝功能的微生物27。3.3.5熒光原位雜交技術熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization, FISH)是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶 DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微 鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細 胞。FISH技術已經用于不同生態(tài)系統(tǒng)的研究中，應用穩(wěn)定同位素技術可以對環(huán) 境中某些活性微生物的核酸進行