第講克隆基因的表達(dá)與產(chǎn)物純化外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)

1、一、原核生物基因表達(dá)的特點1. 只有一種RNA多聚酶識別原核細(xì)胞的啟動子，催化所有的RNA合成。2. 以操縱子為單位數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個表達(dá)的協(xié)同單位。3. 轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行。4.不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。5.調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。6. mRNA的核糖體結(jié)合位點。Shine-Dalgarno（SD）sequence:含有一個啟始密碼子和一段同核糖體16SRNA3末端堿基互補的序列，叫Shine-Dalgarno（SD）序列。二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項1. 外源基因不能帶有內(nèi)含子。2. 必須用cDNA3. 不能直接用真核基因組DNA。4. 必須利用原核細(xì)胞的調(diào)

2、控原件（啟動子等）5. 防止外源基因產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒害。三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控1. 啟動子是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。（1） 啟動子序列大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致順序（consensus sequence）。-35 Box 和-10 Box -35 boxRNA聚合酶亞基的識別位點。 5 TTGACA- 3 -10 box（Pribnow Box） 5TATAAT- 35 TTGACA TATAAT 轉(zhuǎn)錄起始位點17bp核糖體結(jié)合位點（2） 翻譯的起始位點核糖體結(jié)合位點（RBS）ribosome binding site1）Shine-Dalgar

3、no（SD） sequence：2 2）起始密碼：）起始密碼：位于SD序列下游。AUG (91%) GUG ( 8% ) UUG ( 1% ) 2. RNA多聚酶大腸桿菌只有一種類型的RNA 多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA。結(jié)構(gòu)全酶是一個5聚體，含有兩個小亞基，和2兩個大亞基（和），一個亞基。3. 轉(zhuǎn)錄終止子在表達(dá)載體克隆位點的下游一般設(shè)計一段轉(zhuǎn)錄終止子。啟動子 操縱子 S-D序列 目的基因 終止子內(nèi)終止子 intrinsic terminator：E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串A，稱為內(nèi)終止子，形成終止信號。原因： 莖環(huán)結(jié)構(gòu) 多聚A/U反向回文

4、順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個減弱了RNA 與DNA的互作。由于莖環(huán)3段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。4. 翻譯終止密碼5. 翻譯增強(qiáng)子大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上全部的三個終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。Translation enhancer能夠顯著增強(qiáng)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)效率的特殊序列。T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列（簡稱g10-L序列）;大腸桿菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的區(qū)段。6. 基因工程常用的原核啟動子（1）最佳啟動子必須具備的條件 必須是一種強(qiáng)啟動子能使外源基

5、因的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上。 應(yīng)呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄 應(yīng)是可誘導(dǎo)型的便于表達(dá)毒性蛋白等。用溫度或化學(xué)試劑誘導(dǎo)。（2）乳糖啟動子lac來自大腸桿菌的乳糖操縱子。用乳糖或其類似物IPTG充當(dāng)誘導(dǎo)物，與阻遏蛋白結(jié)合，解除抑制。Plac O 目的基因I結(jié)合阻遏物RNA酶結(jié)合產(chǎn)生阻遏蛋白操縱基因啟動子阻遏物基因結(jié)構(gòu)基因AYZOP 調(diào)控區(qū)調(diào)控區(qū)CAP結(jié)合位點結(jié)合位點啟動序列啟動序列操縱序列操縱序列 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因Z： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y： 透酶透酶A：乙酰基轉(zhuǎn)移酶乙?；D(zhuǎn)移酶ZYAOPDNAmRNA阻遏蛋白阻遏蛋白IDNAZYAOPpol沒有乳糖存在時沒有乳糖存在時阻遏基因阻遏

6、基因mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白有乳糖存在時有乳糖存在時IDNAZYAOPpol啟動轉(zhuǎn)錄啟動轉(zhuǎn)錄mRNA乳糖乳糖半乳糖半乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖操縱子控制區(qū)的結(jié)構(gòu)“可移動的lac啟動子小片斷”組成：阻遏物作用區(qū)CAP作用區(qū)RNA聚合酶作用區(qū)長度：203bp的HaeIII片斷（包括-半乳糖苷酶的前8個密碼）。大腸桿菌乳糖操縱子控制區(qū)的結(jié)構(gòu)（3）色氨酸啟動子trp來自大腸桿菌的色氨酸操縱子。（4）PL和PR啟動子四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)包涵體（inclusion body）是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。形成原理未知。 優(yōu)點 缺點使重組蛋白

7、易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞回收的蛋白生物活性差。例：在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人生長激素（human growth hormone, hGH）。2.周質(zhì)中表達(dá)（1）周質(zhì)（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)的復(fù)雜機(jī)理目前不完全清楚優(yōu)點：容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。常用的原核信號肽（2）信號肽（signal peptide）能帶領(lǐng)蛋白穿過膜到達(dá)周質(zhì)。但以后需要正確切割掉。一般位于N端。大腸桿菌的信號肽：phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-內(nèi)酰胺酶（lactamase）、腸毒素（enterotox

8、in）ST-II、LT-B等金黃色葡萄球菌的蛋白A?？莶菅挎邨U菌的內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）。胡蘿卜歐氏桿菌的PelB蛋白。真核信號肽也能在細(xì)菌中起作用。鼠源RNase、人生長激素信號肽。3.胞外表達(dá)使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。用溶血素（hemolysin）基因構(gòu)建分泌性融合蛋白；或與細(xì)菌素釋放蛋白（bacteriocin release protein)共表達(dá)。由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。五、幾種類型的原核表達(dá)載體1.非融合型表達(dá)載體載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列

9、ATG-外源基因-TAG優(yōu)點：產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。pKK223-3 載體哈佛大學(xué)Gilbert實驗室建立的。表達(dá)能力強(qiáng)。組成結(jié)構(gòu)： 強(qiáng)啟動子: tac（trp-lac）: trp的-35區(qū) lacUV5的-10區(qū)操縱基因： 乳糖操縱子系統(tǒng)。lac操縱基因調(diào)節(jié)基因： 宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。 如 JM105菌。 Lac I終止子：rrnB的強(qiáng)終止子 rrnB強(qiáng)終止子S-D序列和插入位點區(qū)：S-D 插入位點區(qū)載體的其余部分： 來自pBR322質(zhì)粒。表達(dá)誘導(dǎo)物： IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）宿主lac Itac P Lac O S

10、-D 插入位點區(qū) rrnB T阻遏物 IPTG2. 分泌型表達(dá)載體載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。如：pIN III系列：pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,組成結(jié)構(gòu) 強(qiáng)啟動子：Ipp（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。調(diào)節(jié)基因：lac IS-D序列和起始密碼ATG。分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。插入位點區(qū)（多克隆位點）。Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位點3. 融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng)pGEX系列表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的

11、。(1) 優(yōu)點(2) 組成結(jié)構(gòu)便于融合蛋白的分離和純化。啟動子：tac操縱基因：lacP調(diào)節(jié)基因：lacIS-D序列ori：pBR322 ori融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）(3) 產(chǎn)物提純GST融合蛋白用Glutathione Sepharose親和層析柱分離純化。lacItac lacP lac O S-D/ATG GST 插入位點 TGA(4) 產(chǎn)物分離用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。(5)其他融合蛋白系統(tǒng)His-tag（組氨酸標(biāo)簽）：在外源多肽的N端或C端接上6 個組氨酸（His）。His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以

12、純化蛋白質(zhì)。六、影響外源基因表達(dá)效率的因素1. 啟動子的結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響(1)一致順序越接近一致順序，啟動子越強(qiáng)。(3) -35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序(2) -35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時，啟動子最強(qiáng)。2. 轉(zhuǎn)譯起始序列對表達(dá)效率的影響(1) S-D序列5-AGGAGGU-3S-D序列后面的4個堿基：如果是A（T）, 翻譯效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。(2) 起始密碼AUGAUG左側(cè)的三個堿基也有影響。-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左側(cè)如果是UAU或CUU時，最為有效；如果是UUC、UCA或AGG時下降20倍。(3) 其它多順反子的mRNA與核糖體的結(jié)合

13、位點有一個或幾個終止密碼。噬菌體外殼蛋白或核糖體蛋白mRNA的核糖體結(jié)合位點有多個U。3. 啟動子與外源基因之間的距離4.轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對表達(dá)效率的影響5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費源量和能量、不會干擾正常的表達(dá)。增加載體的拷貝數(shù)會增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目。增加表達(dá)效率。但過度的外源基因的表達(dá)會影響宿主的正常生長。七、提高表達(dá)水平常用的方法1. 選擇強(qiáng)啟動子序列，如 tac 等2. 調(diào)整S-D序列與AUG堿基的距離3.改變起始密碼下面的幾組密碼子一般為5-9bp。距離過長或過短都影響真核基因的表

14、達(dá)。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離。能提高翻譯的起始效率。5. 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷4. 增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性在外源基因的下游插入“重復(fù)性基因外回文序列”能防止mRNA受到35外切酶的攻擊。合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系。（1）誘導(dǎo)表達(dá)將宿主生長代謝與外源基因表達(dá)分開。一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。PL啟動子是溫度誘導(dǎo)型32 cI857 (cI的溫度敏感突變等位基因)阻遏物有活性，抑制PL啟動子，外源基因不表達(dá)，宿主大量生長。42:cI857阻遏物失活，PL啟動子啟動，外源基因高水平表達(dá)，宿主生長受到限制。cI857 PL PO 外源基因PL啟動子是藥物誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)基因lac

15、 I（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。無IPTG: 阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。 宿主大量生長。有IPTG: 阻遏物與IPTG結(jié)合，lac操縱基因解放， 外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。（2）表達(dá)載體誘導(dǎo)復(fù)制將宿主的生長與載體的復(fù)制分開。當(dāng)需要宿主大量生長時，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。當(dāng)宿主大量生長后，再誘導(dǎo)載體質(zhì)粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。（1）設(shè)計成融合蛋白這是避免被降解的最好措施。N末端：由原核基因編碼一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。（2）使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。 使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減