植物MS組培試驗use

1、實驗一、MS液體成份的配制一、實驗?zāi)康模?、掌握植物組織培養(yǎng)常用MS液體培養(yǎng)基成份的配制；2、為后續(xù)組培實驗做好準備工作。二、實驗基本原理MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog （二人縮寫）于1962年為煙草細胞培養(yǎng)設(shè)計的， 其特點是無機鹽和離子濃度較高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，是較穩(wěn)定的離子平衡洛液， 能滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要，適用范圉比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作 為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。三、實驗儀器與與試劑1、實驗儀器：1000ml/500ml量筒4個、250ml三角瓶（每人2個）、1000ml燒杯或塑料量杯5個、 1000ml試劑瓶5個、10只100mL試劑瓶、微波爐、

2、10ml離心管15個、玻璃棒5個、電 子天平、稱量紙、卷紙、移液槍（lOOOpLs lOOpL）、藥勺。2、實驗試劑：見下述實驗方案中所列。四、實驗方案與操作1、大量元素20X母液配制（貯備液I）配制20X （倍）濃度大量元素母液lOOOmL.按順序充分溶解后再加后一個試劑。KNOsNH4NO3KH2PO4MgSO4. 7H2O1900 mg/L (1.9g/L)1650 mg/L (1.65g/L)170 mg/L (O.17g/L)370 mg/L (O.37g/L)CaCl2. 2H2O440 mg/L （0.44g/L）（可單獨瓶配制存放）2、微量元素100X母液（貯備液II）配制：配

3、制100X （倍）濃度大量元素母液lOOOmL,按順序充分溶解后再加后一個試劑。KIH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2ONa2MoO4 .2H2OCuSO4 .5H2OCoCb .6H2O0.83 mg/L （先配母液:0.83 g KI溶于8 mL水）6.2 mg/L （先配母液：0.62 g溶于8 mL水）223 mg/L （先配母液：0.22 g溶于8 mL水）8.6 mg/L （先配母液：0.86 g溶于8 mL水）0.25 mg/L （先配母液:0.25 g溶于8 mL水）0.025 mg/L （先配母液：0.25 g溶于8 mL水）0.025 mg/L （先配母液:0

4、.25 g溶于8 mL水）3、鐵鹽100X母液（貯備液III）配制100X （倍）濃度大量元素母液lOOOmL,按順序充分溶解后再加后一個試劑。Na2EDTA.2H2OFeSO4.7H2O37.3 mg/L27.8 mg/L4、有機成分100X母液（貯備液IV）配制100X （倍）濃度大量元素母液lOOOmL,按順序充分溶解后再加后一個試劑。肌醇甘氨酸鹽酸硫胺素（VB1） 鹽酸毗哆醇（VB6） 煙酸（VB5）100 mg/L2 mg/L （先配母液：0.2 g溶于8 niL水） 0mg/L （先配母液：0.02 g溶于8 mL水） 0.5 mg/L （先配母液:0.05 g溶于8 mL水） 0

5、.5 mg/L （先配母液：0.02 g溶于8 mL水）5、植物生長調(diào)節(jié)劑的配制：6-BA（lmg/mL）：稱lOmg 6-BA先溶于ImL 1M鹽酸充分溶解，再加9mL以蒸餡水，混勻。 NAA（lmg/mL）：稱lOmg NAA先溶于ImL95%乙醇充分溶解，再加9mL以蒸憎水，混勻。五、實驗注意事項1、配制貯存母液時，要算好各種成分逐次加入，等第一種成分完全溶解后再加入第二種 成分，切忌“一鍋煮程 有機物質(zhì)配好以后要裝入棕色瓶放入電冰箱內(nèi)保存，其它三種母液 可在常溫下保存但最多不能超過一個月；2、pH值對培養(yǎng)基的硬度有影響，pH過高培養(yǎng)基變硬，pH過低培養(yǎng)基不能凝固，所以要 調(diào)整好培養(yǎng)基的

6、pH值；六、作業(yè)：認真總結(jié)，完成本實驗報告。實驗二、MS體培養(yǎng)基的配制與滅菌一、實驗?zāi)康?、掌握植物組織培養(yǎng)常用MS固體培養(yǎng)基的配制和滅菌方法；2、為下次組培實驗做好準備工作。二、實驗儀器與試劑1、實驗儀器高壓滅菌鍋、微波爐、100-200個組培瓶、pH試紙、4個WOOmL量筒、4個1000mL 塑料量杯、4只玻璃棒、移液槍（1000口1_、100口1_）、稱量紙、卷紙、電子天平、藥勺2、實驗試劑：10%NaOH、1MHCI、蔗糖，瓊脂三、實驗操作步驟1、在1 OOOmL塑料量杯中，先加入800mL雙蒸水，再按比例依次加入下列MS成份：大量元素20X母液：微量元素100X母液、鐵鹽100X母液

7、、有機成份100X母液50mLlOmLlOmLlOmL最后再用約雙蒸水（約120mL）左容到lOOOmL,充分混勻。靜置30min,觀察無沉淀方可用。2、稱取并繼續(xù)加入蔗糖3Og,瓊脂粉7.5g,混勻。3、用10%NaOH調(diào)節(jié)pH至5.8 （用pH試紙或pH計測試），混勻。4、在微波爐中加熱至溶液均一、穩(wěn)定（要補充蒸發(fā)的水）。5、將配好的MS培養(yǎng)基趁熱迅速分裝至三角瓶或廣口組培瓶中，每瓶傾倒30ml即可，蓋 上瓶蓋（蓋要松點），裝入滅菌筐。6、放入高壓滅菌鍋121°C,滅菌20min （整個過程約lh左右）。7、滅菌結(jié)束后，立即拿出瓶子，趁熱擰緊每個瓶蓋。8、置于組培室架子上觀察3-

8、7天，無菌落長出說明良好，供下步組培用。四、作業(yè)：認真總結(jié)，完成本實驗報告。實驗三、外植體的消毒、接種與培養(yǎng)一、實驗?zāi)康恼莆胀庵搀w材料化學(xué)消毒和在固體培養(yǎng)基上接種的方法。二、實驗儀器與試劑1、實驗材料：新鮮胡蘿卜2、實驗儀器超凈工作臺、酒精燈、三角瓶、培養(yǎng)皿、鐵子、刀片、剪刀、燒杯、滅菌濾紙、紗布3、實驗試劑配制好的MS固體培養(yǎng)基、10%次氯酸鈉、無菌水、酒精、NAA, 6-BA, NaOH三、實驗操作方法（一）外植體的消毒1、準備工作：提前40min打開超凈工作臺紫外燈殺菌20min,關(guān)閉后再打開風(fēng)機吹20mino 坐到超凈臺前，將裝有經(jīng)濕熱滅菌MS固體培養(yǎng)基的三角瓶、配好的消毒液、洗凈瀝干

9、的 植物材料置于超凈工作臺上，用70%酒精棉球擦手與器具外壁。2、外植體的消毒：選取胡蘿卜的韌皮部，用水洗凈。先用70%酒精浸泡15-30S,然后放 入6%的次氯酸鈉溶液浸泡20min,進行材料脫毒，然后用無菌水沖洗5次。（二）外植體的切片與接種用刀片切取紅色韌皮部（不含中央黃色部位）成lcn*大小方塊，厚度約0.2 cm。將消 毒好的胡蘿I、韌皮部切片，在超凈工作臺上用毀子接種于已滅菌的含MS固體培養(yǎng)基的三 角瓶中，封口。注意規(guī)范操作，防止污染。（三）外植體的初步培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)基三角瓶置于組培室光照培養(yǎng)架上，先弱光培養(yǎng)1周，再1000-20001UX 光照培養(yǎng)數(shù)周，光周期為每天光照141

10、6h /黑暗8101“期間經(jīng)常來觀察，及時清除有 污染者和觀察外植體的變化。四、實驗注意事項1、實驗所使用的器材要嚴格滅菌，注意無菌操作，避免因染菌導(dǎo)致實驗失敗：2、材料脫毒時不要在酒精中停留過長時間，以免材料被殺死；3、接種后進行培養(yǎng)時，為確保實驗成功，可以首先進行7-10d的暗培養(yǎng)，然后再進行光照 培養(yǎng)。五、作業(yè)：認真總結(jié)，完成本實驗報告。實驗四、胡蘿卜韌皮部的繼代培養(yǎng)培養(yǎng)與觀察一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握外植體在固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)方法和不同階段的培養(yǎng)方案與技術(shù)區(qū)別。二、實驗儀器與試劑1、實驗材料：前期培養(yǎng)的外植體2、實驗器具超凈工作臺、高壓滅菌鍋、酒精燈、三角瓶、培養(yǎng)皿、銀子、刀片、剪刀、燒

11、杯、滅 菌濾紙、紗布3、培養(yǎng)基方案分化培養(yǎng)基：基本MS培養(yǎng)基（含30 g/L蔗糖、7.2g/L瓊脂，pH5.8） +3mg/L2,4-D +1 mg/L KT +300mg/L Cefo生根培養(yǎng)基：1/2MS （含 28g/L 蔗糖、Zg/P瓊脂，pH5.8） + 1 mg/L 2,4-D +200mg/LCefo三、實驗操作方法1、外植體的繼代與愈傷組織培養(yǎng)將暗培養(yǎng)1周后的胡蘿卜外植體在無菌條件下轉(zhuǎn)移到含500mg/L Cef的抑菌與愈傷培 養(yǎng)基上，在26°C光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以促進愈傷細胞的增殖。2、分化培養(yǎng)將愈傷培養(yǎng)后的胡蘿卜外植體在無菌操作下轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，在組培室中（

12、25°C,光 照，RH7585%）進行繼代培養(yǎng)，以誘導(dǎo)不定芽或胚狀體的發(fā)生。光周期為每天光照14 16h/黑暗810h,繼代培養(yǎng)周期為816天（取決于有無污染情況），這是一個漫長且極其 重要的過程，約需5-8周。每2天觀察統(tǒng)計有無污染、不定芽發(fā)生數(shù)量及生長情況，并及 時拍照。對于有污染的外植體應(yīng)及時消毒處理并隔離培養(yǎng)觀察或者清除。3、芽苗的生根培養(yǎng)當(dāng)分化培養(yǎng)中產(chǎn)生的芽苗生長到2-3cm時，用手術(shù)刀切下插入到1/2MS生根培養(yǎng)基淺 層，在組培室中繼續(xù)進行繼代培養(yǎng)（適當(dāng)增加光照強度和光照時間），約在24周內(nèi)可生長 出大量白色的毛發(fā)狀根。應(yīng)經(jīng)常觀察拍照。4、污染率、成苗率的統(tǒng)計污染率=污染

13、的外植體個數(shù)/接種時外植體總個數(shù)X100%成苗率=不定芽分化成小苗的個數(shù)/接種時外植體總個數(shù)X100%五、作業(yè)：認真總結(jié)，完成本實驗報告，將培養(yǎng)結(jié)果照片附在報告中。實驗五PEG介導(dǎo)的細胞融合一、實驗?zāi)康?、理解PEG介導(dǎo)細胞融合的原理，掌握實驗方法與技能。2、了解影響細胞PEG介導(dǎo)融合的因素。二、實驗原理2個或以上的細胞合并為1個細胞的現(xiàn)象，稱為細胞融合。細胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和電融合方法。PEG是乙二醇的多聚化合物，一般常用分子質(zhì)量為MW 40006000的50%PEG溶液, 首先引起細胞的集聚與粘連，然后改變各類細胞膜的結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處脂分子雙層 發(fā)生疏松和

14、重排，由于兩細胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親合以及彼此的表面張力作用， 使細胞發(fā)生融合，胞質(zhì)流通，最后形成融合細胞。細胞融合頻率和活力與所用PEG的分子質(zhì)量、濃度、作用時間、細胞的生理狀態(tài)與密 度等有關(guān)。細胞融合過程模式三、實驗器材1、材料：新鮮雞血紅細胞2、器具： 光學(xué)顯微鏡，離心機，恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水浴鍋，電磁爐、離心管、燒杯、容量瓶、木夾子、 載玻片，蓋玻片等。3、試劑與配制：1. 0.85 % NaCl 溶液2. GKN液：8.0g NaCl, 0.4g KC1, 3.56 g Na1HPO4 12H,O, 0.78 g NaH,PO4 2HQ, 2.0g葡萄糖， O.Olg酚紅，溶于1

15、000ml重蒸水中。3. 33% (W/V) PEG溶液1. 取10g PEG (分子質(zhì)量=4000)放入50ml瓶中，在電磁爐水浴鍋中加熱熔化后，再邊攪拌繼續(xù)加熱6mino2. 讓PEG冷卻至50°C,勿讓其凝固。3. 邊攪拌邊加入15ml預(yù)熱至50°C的GKN液，再充分混勻，置37°C水浴鍋中待用。4. 肝素鈉：100ml 0. 85%生理鹽水中溶解0. 04g肝素鈉(125U/mg),加入40ml全血?？上扰?00倍母液:用0.85%生理氯化鈉鹽水配成1 %肝素溶液(200mg/10ml) 再稀釋：按1： 40,用0.85%氯化鈉溶液將母液稀釋好，再采雞血。

16、四、實驗方法1. 雞血的獲得：從在燒杯中事先加入配好的肝素鈉(100U肝素/5ml全血)，到菜市場采集雞血，按1： 4體積比制成抗凝全血，置于4°C冰箱內(nèi)可供一周內(nèi)使用。2. 雞血紅細胞懸液的制備：(1) 取雞血儲備液lml,加入4ml (4倍體積)0. 85 %NaCl溶液,上下顛倒輕 柔充分混勻后，1500rpm離心5min,輕輕棄去上清液留沉淀。(2) 加入4ml 0. 85% NaCl溶液，混勻，1500rpm離心5min,輕輕棄去上清液 留沉淀。(3) 給沉淀中再加入4ml 0. 85% NaCl溶液,混勻,1500rpm離心4min,輕輕 棄去上清液留沉淀。(4) 給沉淀

17、中再加入4mlGKN溶液，混勻，1500rpm離心4min,輕輕棄去上清 液留沉淀。(5) 細胞沉淀中再加入2 ml GKN稀釋充分混勻使細胞懸浮，37°C溫浴靜置5min。333%PEG溶液的制備：稱取10克PEG(MW=4,000)放入燒杯內(nèi)，在微波爐上融化之，冷卻至50C, 加入2倍體積(15ml)預(yù)熱至5O°C的GKN液，迅速混勻，制成33% PEG溶液， 放入37C水浴中待用。4. PEG誘導(dǎo)細胞融合：(5)吸取0.5 ml純化后的雞血，沿著離心管壁逐滴加入1.0 ml 33%PEG溶液, 邊加邊輕搖離心管，加完后輕彈使PEG與細胞充分混勻；(6)然后在37C水浴中靜置15-20min；期間洗好載玻、蓋玻片，待鏡檢。(7)再給管