不結(jié)球白菜分蘗性狀的發(fā)生機(jī)理及其候選基因挖掘

1、不結(jié)球白菜分蘗性狀的發(fā)生機(jī)理及其候選基因挖掘不結(jié)球白菜 (Brassica rapa ssp. chinensis Makino)原產(chǎn)中國 , 是十字花科蕓薹屬中重要的蔬菜作物之一。 不結(jié)球白菜可以分為五大類, 分別是 :1. 普通白菜munis (Tsen etLee) Hanelt, 2.塌菜 var. rosularis(TsenetLee)Hanelt, 3.菜薹 var.parfaachinensis (L.H. Bailey) Hanelt, 4.薹菜 var.tai-tsai Hort.,5.分蘗菜 var. multiceps Hort.。其中分蘗菜表現(xiàn)為特殊的多頭分枝特性,

2、在營養(yǎng)生長階段即有大量側(cè)枝形成,狀如分蘗 , 又叫多頭菜。本研究主要以分蘗菜品種馬耳頭和普通白菜品種蘇州青為研究材料 , 對分蘗菜的多頭分枝特性進(jìn)行觀察, 解剖 , 測定內(nèi)源激素含量變化 , 探討其發(fā)生機(jī)理。構(gòu)建 F2 分離群體 , 利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行分蘗性狀相關(guān)的候選基因的挖掘。研究內(nèi)容如下 :1 不結(jié)球白菜分藥性狀的特點(diǎn)不結(jié)球白菜的多數(shù)品種在開花期會有大量側(cè)枝從莖基部( 一級分枝 ) 及葉腋之間 ( 二級分枝 ) 抽出 , 一般在營養(yǎng)生長期無側(cè)枝形成。但不結(jié)球白菜變種之一的分蘗菜在營養(yǎng)生長階段即有側(cè)芽從短縮莖基部和成葉間的葉腋處長出 , 進(jìn)一步伸長生長發(fā)育成為由多片小葉組成的分枝。形態(tài)

3、學(xué)觀察表明 , 營養(yǎng)生長達(dá)到一定階段 (10-12 片), 不結(jié)球白菜分蘗菜中的側(cè)芽開始形成并長出 , 直到每一個(gè)葉腋處都有一個(gè)側(cè)芽并最終長成分蘗, 具有一片成葉對應(yīng)一個(gè)分藥的特點(diǎn)。組織切片觀察顯示 , 蘇州青和馬耳頭都有腋分生組織的形成, 但形成時(shí)期略有不同。蘇州青中腋分生組織形成后進(jìn)入休眠狀態(tài)而馬耳頭中腋分生組織形成后無休眠過程直接繼續(xù)發(fā)育并進(jìn)一步形成分藥。生殖生長開始后 , 蘇州青中的腋芽結(jié)束休眠也開始向外生長, 形成側(cè)枝后開花結(jié)果。成株期部分營養(yǎng)品質(zhì)含量測定結(jié)果顯示, 分蘗菜的硝態(tài)氮、可溶性蛋白和 Vc 含量都顯著高于普通白菜。2 激素對不結(jié)球白菜分藥性狀的影響利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(EL

4、ISA) 測定馬耳頭和蘇州青內(nèi)源激素含量結(jié)果顯示: 生長素主要參與了蘇州青中側(cè)芽的休眠 , 抑制側(cè)芽向外生長 , 是蘇州青中頂端優(yōu)勢現(xiàn)象起主要作用的激素;細(xì)胞分裂素在馬耳頭分蘗發(fā)生過程中起主要促進(jìn)作用。對馬耳頭的根部外施細(xì)胞分裂素 (6-BA) 和獨(dú)腳金內(nèi)酯 (GR24), 處理 6 天后發(fā)現(xiàn) , 獨(dú)腳金內(nèi)酯抑制側(cè)芽的發(fā)生和生長而細(xì)胞分裂素促進(jìn)側(cè)芽的發(fā)生和伸長。Q-PCR結(jié)果顯示 , 細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因BcRR4和 BcRR5在馬耳頭中的增加量顯著高于蘇州青中的增加量, 說明馬耳頭對細(xì)胞分裂素的響應(yīng)更敏感 ;BcBRC1基因在馬耳頭中的表達(dá)量顯著低于蘇州青中的表達(dá)量 , 說明在“細(xì)胞分裂素 -

5、 獨(dú)腳金內(nèi)酯調(diào)控莖分枝” 這一抑制分蘗發(fā)生的調(diào)控途徑中 , 馬耳頭響應(yīng)機(jī)制劣于蘇州青 。3 兩雜交組合 6 個(gè)遺傳群體的數(shù)量遺傳學(xué)分析利用分蘗親本 馬耳頭、如皋毛菜和不分蘗親本 蘇州青構(gòu)建遺傳群體 (P1、P2、F1、F2、BC1和 BC2), 對分蘗數(shù)和葉片數(shù)進(jìn)行主基因+多基因的混合遺傳模型分析。結(jié)果顯示不結(jié)球白菜分蘗數(shù)和葉片數(shù)均符合E-1 混合遺傳模型 , 受 2 對加性 -顯性 - 上位性主基因 +加性 - 顯性多基因控制。分蘗性狀不僅受兩對主基因控制,也受更多微效多基因的遺傳影響。F2 中主基因加多基因的遺傳率達(dá)到61.58% 96.83%,說明分蘗數(shù)和葉片數(shù)主要由遺傳因素控制 , 環(huán)

6、境對分蘗數(shù)和葉片數(shù)的影響穩(wěn)定而微效。遺傳率的高低, 可以用于與分蘗決定選擇世代的早晚 , 高遺傳率說明早期選擇是有效的。4 利用 F2 群體進(jìn)行 BSA-簡化基因組測序分析及SSR分子標(biāo)記開發(fā)測定1000株 F2 群體的分蘗數(shù) , 選取分蘗數(shù)分別為0、1-2 、5-6 、8-9 和 10 各 50 株抽提DNA,形成五份 DNA混池并利用限制性內(nèi)切酶EcoRI+MseI 酶切后測序。 利用分布在全基因組的 SNP標(biāo)記對五種 DNA池進(jìn)行基因型鑒定 , 篩選在若干 DNA混池之間存在多態(tài)性差異的標(biāo)記 (Marker),根據(jù)這些標(biāo)記進(jìn)一步確定與分蘗相關(guān)的候選區(qū)域 , 對區(qū)域內(nèi)基因進(jìn)行注釋和q-PC

7、R篩選 , 進(jìn)一步確定用于做功能驗(yàn)證的基因。根據(jù)簡化基因組測序的結(jié)果進(jìn)行與分蘗性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的開發(fā),得到 9對 SSR分子標(biāo)記。其中有 8 對能在親本中擴(kuò)增出較為清晰的條帶 , 有效引物比例為 90%,其中編號為 Bra028643、 Bra023312、Bra002958 和 Bra002957 的基因?qū)?yīng)的 4 對引物在親本中表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性,SSR標(biāo)記引物開發(fā)成功率為50%。5 不結(jié)球白菜分蘗性狀轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析將蘇州青和馬耳頭兩個(gè)時(shí)期的根 (R) 、莖尖 (SAM)和葉片 (L) 共計(jì) 12 個(gè)樣本進(jìn)行了無參轉(zhuǎn)錄組測序并組裝成一套參考序列。獲得了總長為120,205,788 nt的 119,237 個(gè) Unigenes, 其中得到注釋的基因共計(jì) 104,086 (87.29%) 。獲得了 32,065 個(gè) SSR標(biāo)記位點(diǎn)。 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋得到3,768 (6.25%) 個(gè)涉及到激素信號調(diào)控途徑的基因。將非分蘗期 (Stage0) 和分蘗期 (Stage 1) 樣本中的基因進(jìn)行差異性表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn) , 在兩個(gè)種質(zhì)之間及同一品種的不同