第八小組 電泳

1、 electrophoresis 415宿舍 2 隨著電泳技術(shù)不斷發(fā)展和更新，其在臨床醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中有著極其廣泛的應(yīng)用價值，相信隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展必將越來越受到大家的青睞。 早期的電泳技術(shù)是由Svedberg教授提出的，1937年，ArneTiselius教授分離出了馬血蛋白，開創(chuàng)了電泳技術(shù)的新紀元。 此后，各種電泳技術(shù)及儀器相繼問世，使它在生物化學(xué)實驗技術(shù)中占重要地位。 它主要用于分離各種有機物和無機鹽；也可用于分析物質(zhì)純度，還可用于分子量的測定，可用于實驗室生產(chǎn)，甚至于微生物和細胞的研究。 3一， 概 念及原理 帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳。電泳技術(shù)

2、：依據(jù)分子或顆粒所帶的電荷、形狀和大小等不同，因而在電場介質(zhì)中移動的速度不同，從而使其分離的技術(shù)4 二， 分類 自由電泳（緩沖液）Tisa-leas式微量電泳顯微電泳等電聚焦電泳等速電泳密度梯度電泳區(qū)帶電泳（有支持體）濾紙電泳薄層電泳垂直板.平板.柱管狀凝膠電泳（瓊脂、聚丙烯酰胺凝膠）5 補充a等速電泳 加有領(lǐng)先離子和終末離子的樣品，電泳后達到完全分離。被分離的各離子的區(qū)帶按遷移率大小依序排列在領(lǐng)先離子與終末離子的區(qū)帶之間。 由于沒有加入適當?shù)闹С蛛娊赓|(zhì)來載帶電流，所得到的區(qū)帶是相互連接的，且因“ 自身校正”效應(yīng)，界面是清晰的，這是與區(qū)帶電泳不同之處。 b高效電泳色譜法 是將凝膠電泳解析度和快

3、速液相色譜技術(shù)溶為一體，在從凝膠中洗脫樣品時，連續(xù)的洗脫液流載著分離好的成分，通過一個連機檢測器，將結(jié)果顯示并打印記錄。 具有凝膠電泳固有的高分辨率，生物相容性的優(yōu)點，又可方便地連續(xù)洗脫樣品。C毛細管電泳 即微柱膠電泳，是將毛細管浸入凝膠混合液中，然后將其撳入代用粘土封閉管底，用一支更細的毛細管吸水鋪在凝膠上。聚合后，除去水層并加蛋白質(zhì)溶液于凝膠上，毛細管的空隙用電極緩沖液注滿，切除粘土部分即可。 6三，影 響 因 素1電泳介質(zhì)的pH值 溶液的pH值決定帶電物質(zhì)的解離程度，也決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少.對蛋白質(zhì)，氨基酸等類似兩性電解質(zhì)，pH值離等電點越遠，粒子所帶電荷越多，泳動速度越快，反之越慢

4、。2.緩沖液的離子強度帶電顆粒的遷移率與離子強度的平方根成反比。低離子強度時，遷移率快，但離子強度過低,緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定.反之，但電泳譜帶要比低離子強度時細窄。 3.電場強度 電場強度對電泳速度起著正比作用，一種是高壓電泳,電壓在5001000V或更高.時間短, 適于低分子化合物的分離，而常壓(100500V)電泳，產(chǎn)熱量小，室溫在1025， 標本不被破壞，無需冷卻裝置。4.電滲現(xiàn)象 在電場中,液體對于一個固體的相對移動稱為電滲. 帶電粒子的移動距離也受電滲影響；如電泳方向與電滲相反，則實際電泳的距離等于電泳距離加上電滲的距離.7核 酸 電 泳 方法 應(yīng)用DNA 測序（變性

5、PAGE） 基因組分析DNA 分離（非變性瓊脂糖凝膠電泳） DNA 片斷或PCR產(chǎn)物分離DNA 脈沖場分離(非變性瓊脂糖凝膠電泳) 大分子染色體DNA 分離8 A 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳v v設(shè)備與試劑： v 水平型可制低濃度凝膠，且制膠與加樣都較方便，故應(yīng)用較廣泛。v（2）制膠：v 用緩沖液配制瓊脂糖凝膠溶液，快速地徹底融化，冷至55時加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5g/ml，然后將其注入玻璃模子中，厚度依樣品濃度而定。 注膠時，梳齒下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脫凝固后，取出梳子，加入適量電極緩沖液使板膠浸沒在緩沖液下1mm處。v樣品制備與加樣： v 溶解于TBE或THE內(nèi)的樣

6、品應(yīng)含指示染料（溴酚藍或桔黃橙），也可使用2.5Fico 增加比重，使樣品集中，每齒孔可加樣5-10lv電泳： v 一般電壓為5-15V/cm。對大分子可用電壓5V/cm。最好在低溫條件下進行。v 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳. v染色：將凝膠浸入含有EB(0.5ug/ml)的電泳液中，室溫下30-45min。染色完畢后通常不需要脫色。在檢測小量DNA(10ng)時，需要脫色。9樣品回收： 電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察樣品的分離情況，對需要的DNA分子或特殊片段可從電泳后的凝膠中以不同的方法進行回收，如電泳洗脫法等，但各種法都僅僅有利于小分子量DNA片段（1kb）的回收，隨著DNA分子量

7、的增大，回收量顯著下降。 （6）影響因素 凝膠。電泳液。電壓、檢測手段，電泳時間 遷移率與其分子量的常用對數(shù)成反比；分子構(gòu)型也對遷移率有影響。 （7)用途 適用于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化， 常用于檢測和分離同工酶及其亞型，大分子核酸等。 判斷擴增片斷的大小。 回收擴增片斷。用于轉(zhuǎn)印進行Southern印跡10B 脈沖電泳凝膠電泳脈沖電泳凝膠電泳(PFGE) 1112A 紙 電 泳v1)紙電泳 v 就是把樣品以帶狀加在濾紙內(nèi)來檢測其移動和分離的方法。v常用以分離性質(zhì)相似的物質(zhì)，如各種氨基酸及稀土元素的分離等。 v2)儀器裝置 可分為低壓電泳和高壓電泳兩類。v3)操作v（1） 取

8、色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60烘箱烘干備用?？砂葱枰眉簦⒃诰嚅L度方向一端58cm處劃一起始線，每隔2.53cm處做一記號備點樣用。 v(2) 點樣 有濕點法和干點法。 v(4) 電泳 v 于電泳槽中加入適量枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0),浸沒鉑電極，接通電泳儀穩(wěn)壓電源擋,調(diào)整電壓梯度為1820V/cm，電泳約1小時45分鐘，取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點的位置。 v(5) 含量測定 v 剪下樣品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙，剪成細條，v分別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml

9、，搖勻，v放置1小時，用3號垂熔玻璃漏斗濾過，也可用自然沉降或v離心法傾取上清液，按各藥品項下的規(guī)定測定吸收度，v并按吸收系數(shù)計算含量。13 B 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳 (SDS-PAGE): 定義及定義及原理 蛋白質(zhì)電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無關(guān)。 SDS是陰離子去污劑，使氫鍵、疏水鍵打開，巰基乙醇使P二硫鍵還原，并結(jié)合成P-SDS，所帶的相同密度負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。操作要點操作要點1 凝膠制備： 丙稀酰胺（單體）N,N-甲叉雙丙稀酰胺（催化劑） 聚合 催化劑： 過硫酸銨四甲基乙二胺（TEMED） AP提供自

10、由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進行； 交聯(lián)劑； 能在線型分子間起架橋作用從而使多個線型分子相互鍵合交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。 常用 過氧化二異丙苯(DCP）過氧化苯甲酰(BPO)(DTBP） 制膠緩沖液： 濃縮膠是大孔膠，緩沖液為pH6.7。有堆積作用，凝膠濃度較小，把較稀樣品加在濃縮膠上，可使其被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。 分離膠是AP催化聚合成的小孔膠，緩沖液為pH8.9 Tris-HCl。 2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。 142 樣品處理及加樣上樣緩沖液是Tris-Hcl，DTT，

11、SDS，溴酚藍和甘油。3電泳（電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液） 開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)一起向正極移動，電泳開始時氯離子泳動率最大，在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成穩(wěn)定的界面，使蛋白聚在移動界面附近，濃縮成一中間層。 它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠后，分子篩作用使其按各自分子量的大小而被分離。4 染色與固定5 脫色與 分析應(yīng)用； 測定蛋白質(zhì)分子比較成功；用于蛋白質(zhì)定量； 用做蛋白質(zhì)純度的鑒定；分離蛋白質(zhì)和寡糖核苷酸 測定樣品P含量：掃描定量（比色）15 C 等電聚焦等電聚焦（IEF）

12、基本原理 電泳系統(tǒng)中加進兩性電解質(zhì)載體，當通直流電時，兩性電解質(zhì)載體即形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。P進入時，不同的P移動到與其等電點相當?shù)膒H位置上，從而使不同等電點的P得以分離。2.操作 1）穩(wěn)定的pH梯度的形成： 一種是人工pH梯度.不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不再使用。 另一種是天然pH梯度。在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，電泳前，各段介質(zhì)中的pH相等，用pH0表示。 2） 兩性電解質(zhì)載體 （由多乙烯多胺與丙烯酸制備） 3） 支持pH梯度的介質(zhì) 密度梯度溶液（用于自由電泳） 凝膠（如聚丙烯酰胺凝膠）4）聚焦電泳5）檢測3 .特點 優(yōu)點：分辨率高

13、，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測定P或多肽的等電點。特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分。 缺點：需無鹽溶液，不適用于在等電點不溶解或發(fā)生變性的P。 16 D 雙向電泳雙向電泳 IEF/SDS-PAGE1， 第一向第一向IEF等電聚焦電泳（等電聚焦電泳（管柱管柱） 加入高濃度尿素、適量非離子型去污劑NP-40，使蛋白質(zhì)按照等電點的不同分開，還應(yīng)有二硫蘇糖醇以促使蛋白質(zhì)變性和肽鏈舒展2 . 第二向第二向SDS-PAGE電泳電泳 （ 平板）平板） 將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應(yīng)用的樣品處理液中振蕩平衡，然后包埋在凝膠板上端，即可3.應(yīng)用應(yīng)用 可結(jié)合質(zhì)譜對細胞進行蛋白質(zhì)組的研究，可用于分析環(huán)境變化時細胞增殖、分化等過程中的基因表達產(chǎn)物。 最大優(yōu)勢在于它可對一系列復(fù)雜的蛋白質(zhì)進行分析，其斑點的矢量圖亦被經(jīng)常使用。如翻譯后的修飾和加工的變化與疾病的發(fā)生相關(guān)，若一個蛋白有多個矢量，表明該蛋白