黃瓜綠斑駁花葉病毒砧木種子發(fā)病觀察及帶毒檢測

1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生畢業(yè)論文（設(shè)計） 題 目 黃瓜綠斑駁花葉病毒砧木種子發(fā)病觀察及帶毒檢測 學(xué) 院 植物保護(hù)學(xué)院 專業(yè)班級 植物檢疫（2）班 學(xué)生姓名 指導(dǎo)教師 撰寫日期： 2014 年 5 月 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明、使用授權(quán)及知識產(chǎn)權(quán)歸屬承諾書學(xué)位論文題目黃瓜綠斑駁花葉病毒砧木種子發(fā)病觀察及帶毒檢測學(xué)位級別學(xué)士學(xué)生姓名學(xué)科專業(yè)植物檢疫導(dǎo)師姓名學(xué)位論文是否保密否如需保密，解密時間 年 月 日獨創(chuàng)性聲明本人呈交論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包括為獲得河南農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書

2、而使用過的材料，指導(dǎo)教師對此進(jìn)行了審定。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中做了明確的說明，并表示了謝意。特此聲明。學(xué)生簽名： 導(dǎo)師簽名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日學(xué)位論文使用授權(quán)及知識產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本人完全了解河南農(nóng)業(yè)大學(xué)關(guān)于保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)生必須按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存提交論文的印刷本和電子版本，并提供目錄檢索和閱覽服務(wù)，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。本人同意河南農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。本人完全了解河南農(nóng)業(yè)大學(xué)知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)辦法的有關(guān)規(guī)定，在畢業(yè)離開河

3、南農(nóng)業(yè)大學(xué)后，就在校期間從事的科研工作發(fā)表的所有論文，第一署名單位為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，試驗材料、原始數(shù)據(jù)、申報的專利等知識產(chǎn)權(quán)均歸河南農(nóng)業(yè)大學(xué)所有,否則，承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。注：保密學(xué)位論文在解密后適用于本授權(quán)書。學(xué)生簽名： 導(dǎo)師簽名： 學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)簽名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 黃瓜綠斑駁花葉病毒砧木種子發(fā)病觀察及帶毒檢測河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院10級植物檢疫專業(yè)2 班摘要：為了進(jìn)一步了解黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV） 在砧木種子上的發(fā)病情況,加強(qiáng)對黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢疫檢測，種植帶有CGMM

4、V的砧木種子（葫蘆種子），在苗期觀察葫蘆植株發(fā)病情況，并用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS-ELISA）檢測。在長出2-5片真葉時，觀察種植出苗的135株葫蘆植株，出現(xiàn)顯性癥狀的有5株，課題來源：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)鄭州果樹所DAS-ELISA檢測全部為陽性，另外130株未發(fā)病。在每株未發(fā)病的植株上取1-2片真葉，進(jìn)行DAS-ELISA檢測，其中出現(xiàn)陽性（隱性帶毒）的有6株，砧木種子植株隱性帶毒率為4.62。結(jié)果表明：砧木種子植株可以隱性攜帶CGMMV，因此不能單從在苗期是否發(fā)病來判斷植株是否攜帶該病毒。關(guān)鍵詞：黃瓜綠斑駁花葉病毒；砧木種子；DAS-ELISA Cucumber green mottl

5、e mosaic virus infected rootstock seeds onset of observation and detectionPlant Protection College，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002, ChinaAbstract:To know more about the cucumber green mottle mosaic virus(CGMMV) in the incidence of rootstock seeds strengthen the CGMMV detection and qua

6、rantine.Planting poisonous rootstock seeds(gourd seeds) ,observe the CGMMV in the incidence of gourd seedling plants and detected with Double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent method (DAS-ELISA).When the gourd plants grown 2-5 true leaves ,5 strains have dominance symptom and 130 strains

7、 have no dominance symptom in 135 strains of planting and coming out gourd plants.Taking 1 to 2 leaf in each having no dominance symptom strains ,6 strains result into positive ,detected by DAS-ELISA ,4.62% of not plant disease.The recessive poisoned of the seed of stock rate was 4.62%.It turns out

8、that the plant of the seed of stock can recessively bring CGMMV.So whether the plan carry CGMMV,can't judge only from whether the plan has dominance symptom in seedling stage. Keyword:CGMMV;poisoned seed;DAS-ELISA 1 引言 1935年Ainsworth在英國首次發(fā)現(xiàn)和報道黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)。隨

9、著國際間日益廣泛的運輸業(yè)、旅游業(yè)等的發(fā)展以及日益頻繁的引種，為該病毒的傳播創(chuàng)造了空前的有利條件。該病毒對環(huán)境適應(yīng)力極強(qiáng)、寄主廣泛，一旦傳入，很容易定殖。目前該病毒在英國、希臘、羅馬尼亞、巴西、日本、伊朗、印度、韓國等及中國部分地區(qū)均有分布（蘭香等，2007）。該病毒一旦在新環(huán)境中定殖，會對葫蘆科植物的生長和發(fā)展造成嚴(yán)重威脅，因此，要嚴(yán)格控制該病毒的傳播。2006年我國農(nóng)業(yè)部(農(nóng)業(yè)部公告第788號)將該病毒確定為全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物（周華眾等，2009），嚴(yán)格控制該病毒的傳入，保障葫蘆科作物的正常生產(chǎn)。 黃瓜綠斑駁花葉病毒，作為煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的成員之一，能夠侵染葫

10、蘆科作物，嚴(yán)重威脅其生產(chǎn)（趙世恒等,2007）。該病毒的寄主主要是葫蘆科植物，主要有黃瓜、甜瓜、葫蘆、筍瓜、西葫蘆、棱角絲瓜、無花果葉瓜、南瓜等。隨著傳播變異該病毒分化為多種株系，如西瓜株系、日本黃瓜株系、Yodo株系等。該病毒的不同株系在不同寄主、不同生長時期的危害癥狀不盡相同，但發(fā)病植株都出現(xiàn)葉片褪色形成不規(guī)則的淡綠色至黃色的斑點，呈花葉狀，綠色部位突出表面，葉緣向上翻卷，葉片略微變細(xì)；嚴(yán)重時，呈黃綠色花葉癥狀，葉面凹凸不平，葉片明顯硬化等相同的癥狀（周華眾等，2009），可以作為判斷黃瓜綠斑駁花葉病毒病的一種指標(biāo)。 該病毒主要借助種子帶毒、土壤傳染等遠(yuǎn)距離傳播，據(jù)研究感染CGMMV西瓜、

11、甜瓜種子帶毒率高而傳毒率相對較低,說明CGMMV主要以種子表面帶毒為主（趙世恒等,2007）。另外，農(nóng)事操作、嫁接等也容易造成CGMMV的接觸性傳染，研究發(fā)現(xiàn)接觸到病株汁液的健康植株可在712d內(nèi)發(fā)?。▍菚艿?，2011）。此外，在田間CGMMV還可以通過介體傳毒，寄生性植物菟絲子就是其中之一；另外，黃瓜葉甲很可能是該病毒的昆蟲傳播介體。桃蚜和棉蚜不能傳播該病毒；被侵染葫蘆、瓠子的根際土壤中未發(fā)現(xiàn)介體真菌（張永江，2006）。黃瓜綠斑駁花葉病毒是單鏈RNA病毒，病毒粒子為直型棒狀，具有很強(qiáng)的抗原性，與其它煙草花葉病毒屬出現(xiàn)的癥狀在形態(tài)學(xué)上很相似，在血清學(xué)上也很相關(guān)。西瓜株系與英國的兩個株系及印

12、度的C株系有較近的親緣關(guān)系，但與日本的黃瓜株系、Yodo株系及煙草花葉病毒卻有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，而與番茄花葉病毒及煙草花葉病毒屬的其他成員的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)(Nozu et al,1971)。日本黃瓜株系與Yodo株系的親緣關(guān)系很近。所有株系都是極端穩(wěn)定的，典型株系90處理10min失去侵染能力，在常溫下該病毒侵染力可保持?jǐn)?shù)月之久，在0環(huán)境下可保持?jǐn)?shù)年（Daryono B S et al,2002）。關(guān)于對CGMMV的防治，目前主要是通過加強(qiáng)檢疫防控，提高檢疫意識，做好疫情監(jiān)測和調(diào)查該病毒的傳播。此外，種子處理，土壤處理，加強(qiáng)田間管理也是常用的防治方法（苗超等，2013）。檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的方

13、法主要有：生物學(xué)鑒定法、血清學(xué)檢測法、分子生物學(xué)等（趙世恒等,2007）。相比較而言，血清學(xué)檢測方法是一種用于常規(guī)檢測的有效方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單等優(yōu)點，目前應(yīng)用最多的血清學(xué)檢測法是酶聯(lián)免疫吸附法（羅梅等，2010）。2 材料與方法2.1 供試材料 檢測用的砧木種子是感染黃瓜綠斑駁花葉病毒并表現(xiàn)明顯癥狀的葫蘆植株留下的種子，陽性對照為本實驗室分離純化接種保存在葫蘆上的黃瓜綠斑駁花葉病毒，陰性對照為健康葫蘆植株收取的種子。2.2 種子帶毒檢測分別從健康的和感染病毒的葫蘆種子中隨機(jī)抽取30粒種子，用適量的磷酸鹽緩沖液(0.1mol/l，pH74)浸泡3-5h。用0.1mol/l磷酸

14、緩沖液（pH74）稀釋1000倍，通過DAS-ELISA試驗檢測種子帶毒情況，同時設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照。（DAS-ELISA試驗方法參考2.3.3.2）2.3 苗期癥狀觀察與鑒定2.3.1 種子處理分別取50粒健康的、200粒感染病毒的砧木種子（葫蘆種子），由于葫蘆果實屬于瓠果類，種子有一堅硬外殼，出芽時間較長，在種子尖端開一小口，常溫水浸泡于消過毒的燒杯中。3-5h后，將浸泡過的種子包于濕潤的紗布中，放于28的溫箱中培育，培育期間要保持紗布濕潤。長出短芽（不能過長，防治斷芽）后取出，并播種于裝有機(jī)質(zhì)土（沒有種植過植物，確保土壤中沒有CGMMV或癥狀不容易與CGMMV癥狀區(qū)分的病害

15、或毀滅性病害）的淺盤中放于人工氣候箱中培養(yǎng)，光照時溫度設(shè)置為28、濕度設(shè)置為為70RH，每天培養(yǎng)16h；黑暗處理時，溫度設(shè)置為24、濕度設(shè)置為70RH，每天培養(yǎng)8h。2.3.2 癥狀觀察 等到種植的砧木種子長出兩片真葉時，將成活的135株植株標(biāo)記為：植株1、植株2、植株3植株133、植株134、植株135。連續(xù)觀察10天以上，并與健康植株對照。記錄出現(xiàn)CGMMV明顯癥狀的植株，并采集發(fā)病葉片。每采集一株發(fā)病植株的真葉時都要換一次性聚氯乙烯手套，防止接觸傳毒造成的誤差。及時清除壞死植株，保持培養(yǎng)環(huán)境的清潔，避免交叉感染。2.3.3 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)檢測2.3.3.1

16、 緩沖溶液和樣品的制備 1. 抗體包被緩沖液（0.05mol/L pH9.6的碳酸鹽溶液）的配制：Na2CO3 1.6g、NaHCO3 2.94g、NaN3 0.2ml ,無菌水定容至1L。 2. 洗滌緩沖液（pH7.4 的PBST溶液）的配制：NaCl 8.0g、 NaHCO3·12H2O 2.9g、KH2PO4 0.2g、KCl 0.2g、適量的Tween20,無菌水定容至1L。 3. 抗體稀釋緩沖液的配制：20g PVP溶于1LPBST溶液中。 4. 底物緩沖液（pH9.8)的配制：二乙醇胺10ml、蒸餾水80ml，用 濃HCl將溶液的pH調(diào)制9.8，蒸餾水定容至100ml。

17、5. 樣品的制備：新鮮葉片按1：5比例、干燥的葉片按1:10的比例用抗體稀釋緩沖液研磨，離心，4冰箱保存。2.3.3.2 DAS-ELISA反應(yīng) 1. 包被酶聯(lián)板與抗體吸附：CGMMV抗血清、酶標(biāo)抗體等購自美國Agdia公司，按照1:2000的比例用抗體包被緩沖液稀釋抗體。除空白對照每孔加入100ul ddH2O之外,每孔加入100ul稀釋抗體。保鮮膜密封后，放于4冰箱中靜置過夜。 2. 抗原抗體的結(jié)合：甩盡酶聯(lián)板上的抗體溶液，用洗滌緩沖液洗板三次，每次都要在吸水紙上拍盡孔內(nèi)的溶液，每次洗板3min；除空白對照每孔加入100ul抗體稀釋緩沖液外，每個樣孔加入100ul樣品，一個樣品兩個重復(fù)，同

18、時設(shè)置陽性和陰性對照。放置于4冰箱中培育過夜。 3. 加入酶標(biāo)抗體和底物：洗板（同上）；按1:2000的比例用稀釋緩沖液稀釋酶標(biāo)抗體，每孔加入100ul，28溫箱中溫育3h；洗板（同上）；用底物緩沖液將底物（對硝基苯磷酸二鈉）稀釋至1mg/ml,每孔加入100ul，遮光放入28的搖床中，每隔30min觀察一次，并記錄出現(xiàn)陽性的樣品。2.3.3.3 讀數(shù)及數(shù)據(jù)分析 待陽性對照孔呈一定程度的黃色時，用安托斯全自動酶標(biāo)儀(Anthos 2010)讀取在405nm 處的吸光值，根據(jù)公式：I/H=（樣品的平均吸光值-空白對照平均吸光值）/（陰性對照的平均吸光值-空白對照平均吸光值）計算并判斷檢測結(jié)果。若

19、I/H3，則檢測樣品為陽性；若I/H3，則檢測樣品樣品為陰性。2.4 砧木種子植株隱性帶毒檢測將種植出苗的的135株植株中的130株未發(fā)病的植株分為26組，5株植株為一組。在每株植株的葉片上取適量的葉樣，混合放入消毒的研缽中，并加入1-2ml的0.1mol/l磷酸鹽緩沖液(pH74)，充分研磨，直到樣品成液體狀為止；將研磨好的待測樣品轉(zhuǎn)移到2ml消毒的離心管中；離心；放入4冰箱中保存。DAS-ELISA反應(yīng)檢測樣品（DAS-ELISA方法同2.3.3.2）。然后，對DAS-ELISA檢測為陽性的組中的每一株進(jìn)行檢測。再對檢測結(jié)果為陽性的植株獨立觀察一周左右，觀察該植株是否出現(xiàn)CGNNV發(fā)病癥狀

20、。3 結(jié)果與分析3.1 種子帶毒檢測 表1：種子帶毒情況檢測結(jié)果測定樣品DAS-ELISA檢測結(jié)果酶標(biāo)儀測定結(jié)果感染病毒植株的種子+3.2613.543健康植株的種子0.6680.284陽性對照+3.5663.547陰性對照0.5230.323空白對照0.2680.284注：“+”表示檢測結(jié)果為陽性；“”表示檢測結(jié)果為隱性 由表1可見，隨機(jī)抽檢的30粒感染黃瓜綠斑駁花葉病毒明顯表現(xiàn)出CGMMV癥狀的葫蘆植株留的種子（感病種子）與CGMMV抗血清反應(yīng)I/H=8.043，呈陽性，表明隨機(jī)抽取的30粒種子攜帶有CGMMV；健康葫蘆植株的種子（健康種子）與CGMMV抗血清反應(yīng)I/H=1.125，呈陰性

21、，表明隨機(jī)抽取的30粒種子中不攜帶CGMMV，可以作陰性對照。3.2 苗期癥狀觀察與檢測種植出苗的健康的葫蘆種子39株植株中沒有出現(xiàn)發(fā)病植株，發(fā)病率為零；以此為對照，種植出苗的135株感病葫蘆種子中，有5株出現(xiàn)明顯的CGMMV侵染癥狀。DAS-ELISA檢測發(fā)病植株，5株發(fā)病植株檢測結(jié)果均呈陽性酶標(biāo)儀讀數(shù)計算結(jié)果I/H值均大于3（表2）。表2：發(fā)病植株帶毒情況檢測結(jié)果檢測樣品酶標(biāo)儀測定結(jié)果DAS-ELISA檢測結(jié)果I/H值植株1 3.43.401+3.840203275植株2 2.3253.326+3.190852626植株3 3.3362.564+3.331451158植株4 3.4693.

22、034+3.671936759植株5 3.1283.129+3.533032185空白對照0.6730.456-0.637492942陽性對照3.4563.334+3.833992095隱性對照1.0960.675-1注：“+”表示檢測結(jié)果為陽性；“”表示檢測結(jié)果為隱性。 由表2可見，健康的葫蘆種子不帶毒，也沒有受到CGMMV侵染，沒有出現(xiàn)明顯的CGMMV發(fā)病癥狀，可以作為陰性對照；感病植株的種子帶毒，CGMMV可借助種子傳播，而且發(fā)病種子植株能表現(xiàn)出明顯的CGMMV發(fā)病癥狀。但是種子傳毒的發(fā)病率較低，這可能還與其它原因有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。3.3 未發(fā)病植株的帶毒檢測 經(jīng)過DAS-ELISA

23、檢測，在26組未發(fā)病的植株中有4組雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)結(jié)果呈陽性，說明有陰性帶毒的植株（表3，見下頁）。表3：無CGMMV發(fā)病癥狀組檢測結(jié)果組別酶標(biāo)儀測定結(jié)果DAS-ELISA檢測結(jié)果I/H值組11.0340.986-2.362573099組20.6780.786-1.712280702組31.3320.504-2.147368421組43.53.5+8.187134503組50.8950.765-1.941520468組61.0120.994-2.34619883組71.0531.045-2.45380117組80.2140.133-0.405847953組91.1581.124-2.669

24、005848組101.0340.675-1.998830409組111.3250.436-2.059649123組121.2311.132-2.76374269組133.53.5+8.187134503組141.3461.046-2.797660819組150.7620.689-1.697076023組160.8711.543-2.823391813組171.2110.936-2.511111111組180.8710.754-1.900584795組191.0341.046-2.432748538組203.2313.345+7.69122807組210.9570.764-2.012865497

25、組220.8320.857-1.975438596組230.3420.344-0.802339181組243.53.5+8.187134503組250.2330.564-0.932163743組260.4640.564-1.202339181空白對照0.1540.256-0.479532164陰性對照0.5340.321-1陽性對照3.4533.152+7.725146199注：“+”表示檢測結(jié)果為陽性；“”表示檢測結(jié)果為隱性。對雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)呈陽性的4組中的20株植株進(jìn)行雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測，其中有6株反應(yīng)呈陽性，酶標(biāo)儀檢測計算結(jié)果大于3（表4）。表4：檢測結(jié)果為陽性各組植株檢測結(jié)

26、果組別植株酶標(biāo)儀測定結(jié)果DAS-ELISA檢測結(jié)果I/H值組4植株220.09340.986-1.352123262植株232.6782.786+6.844544657植株240.6320.594-1.535763497植株263.53.5+8.768633346植株270.8950.765-2.079418765組13植株640.8120.913-2.160841789植株650.6530.645-1.625955155植株663.53.5+8.768633346植株670.5460.657-1.506952274植株691.1340.975-2.641863961組20植株1003.425

27、2.936+7.968182388植株1020.2310.932-1.456845797植株1033.53.5+8.768633346植株1040.8460.946-2.244770137植株1050.6620.789-1.817612426組24植株1210.9711.043-2.52286108植株1220.8110.936-2.188400351植株1230.6710.854-1.910309407植株1242.9342.646+6.989853439植株1250.8311.045-2.349993737對照空白對照0.2320.304-0.671426782陰性對照0.44430.35

28、4-1陽性對照2.5323.5+7.55605662注：“+”表示檢測結(jié)果為陽性； “”表示檢測結(jié)果為隱性。 由表4可見，即使沒有出現(xiàn)明顯CGMMV發(fā)病癥狀的寄主植株也有可能攜帶CGMMV，即砧木種子植株可以隱性帶毒，此次試驗135株植株中隱性帶毒率為4.62。所以，在檢驗檢疫CGMMV時不能僅僅從葫蘆植株發(fā)病與否來判斷植株是否帶毒，必須根據(jù)血清學(xué)或生物學(xué)等原理進(jìn)一步確定。4 結(jié)論與討論隨機(jī)抽取的30粒感病植株的種子，DAS-ELISA試驗檢測結(jié)果呈陽性，說明CGMMV可以通過種子帶毒傳播；播種出苗的135株植株中有5株出現(xiàn)明顯的CGMMV發(fā)病癥狀；130株未出現(xiàn)明顯癥狀的植株通過DAS-EL

29、ISA試驗檢測，檢測結(jié)果有6株植株出現(xiàn)陽性，即有6株植株隱性帶毒，檢測到的隱性帶毒率為4.62。所以，可以確定黃瓜綠斑駁花葉病毒在帶毒砧木種子植株上可能即可以出現(xiàn)明顯的CGMMV發(fā)病癥狀（即顯性帶毒），也可以不出現(xiàn)明顯的CGMMV發(fā)病癥狀的帶毒現(xiàn)象（即隱性帶毒）。 帶毒砧木種子在苗期是否發(fā)病與砧木種子的帶毒率與傳毒率有很大的關(guān)系。雖然至今尚未明確CGMMV的田間傳毒媒介，但是一旦在田間出現(xiàn)因種子帶毒發(fā)生的病苗，即使是很低的比例，也會以此為初侵染源，通過非介體因素傳播，引起病害流行，從而造成嚴(yán)重?fù)p失，也可能是本實驗誤差來源之一。本實驗組檢測到CGMMV的葫蘆種子傳毒率0.92%，帶毒率是100%

30、。然而，Choi Gug Seounf 檢測感染CGMMV的葫蘆種子帶毒率為84,傳毒率為2（Choi Gug Seoun，2001）；秦碧霞等檢測感染CGMMV的葫蘆種子帶毒率為100，傳毒率為1.01（秦碧霞等，2011）。說明不同批次的同品種種子帶毒率和傳毒率也不同，所以隨機(jī)取樣和抽取足量樣本進(jìn)行檢測更能真實反映種子的帶毒情況。另外，由于種子傳毒與否及種傳率高低除與病毒本身有關(guān)外，還受植株品種、感染時期，環(huán)境條件及各種園素互作影響（季良，1995）造成試驗誤差。檢測種子數(shù)量較少、觀察時間不夠長實驗結(jié)果也可能造成一些誤差。 除了種子傳毒對病害的流行傳播有重要影響以外，該病毒也極易通過汁液摩

31、擦、葉片接觸、嫁接、農(nóng)事操作等非介體傳播（張永江，2006）造成誤差。另外，DAS-ELISA檢測誤差，也是造成誤差的主要來源。此外，葫蘆是我國很多西瓜產(chǎn)區(qū)用于嫁接防治枯萎病的主要砧木，葫蘆種子帶毒很容易通過嫁接傳染接穗西瓜苗，從而擴(kuò)散到大田引起嚴(yán)重的后果（趙紅運等，2006）。 黃瓜綠斑駁花葉病毒是我國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物和進(jìn)境檢疫性有害生物，由于該病毒極強(qiáng)的穩(wěn)定性、具有廣泛的適宜寄主和多種傳播特性，在我國定殖和擴(kuò)散的風(fēng)險性極高(元華等，2010)。建立完善的葫蘆科種子檢驗檢疫規(guī)程制度和加強(qiáng)檢疫監(jiān)管是防止該病毒傳播危害的主要手段。此外，對商品用種和引進(jìn)調(diào)運的種子進(jìn)行消毒處理，加強(qiáng)抗病品種培

32、育等多途徑手段綜合應(yīng)用，阻斷該病毒的傳入、定殖及擴(kuò)散，從而促進(jìn)葫蘆科作物生產(chǎn)持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展。 種子攜帶病毒是該病毒遠(yuǎn)距離傳播的主要形式，種子帶毒滅活處理也已經(jīng)有很多成功的方法(Kim Sang-Min et al , 2003) 。本實驗研究表明，帶有該病毒的砧木種子植株有隱性帶毒的可能，所以不能單從是否出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀判斷該苗木是否帶有該病毒。目前，DAS-ELISA和反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）等方法已經(jīng)成功應(yīng)用于快速靈敏檢測種子攜帶的CGMMV（Kim Du-Hyun et al -1999）。所以，加強(qiáng)CGMMV的檢驗檢疫不應(yīng)單從觀察癥狀有無來判定，必須建立和發(fā)展以血清學(xué)和生物學(xué)

33、等原理為基礎(chǔ)的準(zhǔn)確、快速、簡便的測定方法。參考文獻(xiàn)1.蘭香，謝丙炎，楊宇紅等檢疫性黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測和防疫控制中國蔬菜，2007(9)：3438.2.季良植物種傳病毒與檢疫M(jìn)北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：129.3.羅梅，王琳，賓淑英等.黃瓜綠斑駁花葉病毒檢測技術(shù)的研究進(jìn)展.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2010,29(3):392-396.4.苗超，黃廣飛.黃瓜綠斑駁花葉病毒病的發(fā)生及危害防控措施.安徽農(nóng)學(xué)通報.2013,19(08).5.秦碧霞，蔡健和，陸秀紅等.葫蘆種子傳黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測.植物保護(hù).2011.37(3):109-112.6.吳會杰，秦碧霞，陳紅運等.黃瓜綠斑駁花葉病毒

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