α-苦瓜素經(jīng)LRP1受體介導(dǎo)的JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞L02早期凋亡的機(jī)制研究

1、    苦瓜素經(jīng)lrp1受體介導(dǎo)的jnk信號(hào)通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞l02早期凋亡的機(jī)制研究    鄧念華 沈富兵 鄭崛村 沈岱 王玲r575；q23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 a 1001-0408（2018）23-3203-05doi 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.08摘 要 目的：探討-苦瓜素誘導(dǎo)肝細(xì)胞l02（簡(jiǎn)稱“l(fā)02細(xì)胞”）早期凋亡的信號(hào)通路。方法：制備并純化-苦瓜素。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)0（陰性對(duì)照）、160、80 g/ml -苦瓜素作用l02細(xì)胞28 h后的細(xì)胞凋亡率。小干擾rna（sirna）沉默低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（l

2、rp1）得到lrp1-sirna細(xì)胞，然后采用液相芯片分析術(shù)檢測(cè)-苦瓜素（160 g/ml）分別作用l02細(xì)胞（正常組）和lrp1-sirna細(xì)胞（沉默組）0、0.25、0.5、1、2 h后c-jun氨基末端激酶（jnk）信號(hào)通路中促調(diào)蛋白磷酸化jnk（p-jnk）、磷酸化凋亡前體蛋白（p-bad）、胱天蛋白酶9（caspase-9）及抑調(diào)蛋白磷酸化蛋白53（p-p53）、磷酸化蛋白激酶b（p-akt）、磷酸化b淋巴細(xì)胞瘤2（p-bcl-2）、caspase-8的表達(dá)情況，分析-苦瓜素對(duì)l02細(xì)胞jnk信號(hào)通路的作用。結(jié)果：制備并純化得到-苦瓜素（純度>97%）；與陰性對(duì)照組比較，160

3、 g/ml -苦瓜素作用8 h時(shí)，可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡（p0.05）；與0 h比較，作用后0.25 h促調(diào)蛋白p-jnk、p-bad和caspase-9表達(dá)量顯著增加（p<0.05），而抑調(diào)蛋白p-p53、p-akt、p-bcl-2和caspase-8表達(dá)量無(wú)變化；與正常組相比，沉默組各時(shí)間點(diǎn)的p-jnk、p-bad和caspase-9的表達(dá)均顯著減少（p<0.05）。結(jié)論：-苦瓜素可能通過(guò)lrp1受體介導(dǎo)jnk信號(hào)通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，為揭示其肝毒性提供了參考。關(guān)鍵詞 -苦瓜素；凋亡；肝細(xì)胞l02；c-jun氨基末端激酶信號(hào)通路；低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1abstract obj

4、ective： to explore the signaling pathway of -momordicin inducing early apoptosis of hepatocyte l02 （called “the l02 cell” for short）. methods： -momordicin was prepared and purified. flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of the l02 cell after treated with 0 （negative control）， 160 and

5、80 g/ml of -momordicin for 2-8 h. lrp1-sirna cells were obtained by small interfering rna （sirna） silencing low density lipoprotein receptor-related protein 1 （lrp1）. the expression of proapoptotic protein p-jnk， p-bad， caspase-9， inhibitor of apoptosis protein p-p53， p-akt，p-bcl-2 and active caspas

6、e-8 in the l02 cell （normal group） and lrp1-sirna （silence group） after treated with -momordicin for 0， 0.25， 0.5， 1， 2 h were determined by liquid biochip analysis in c-jun n-terminal kinase （jnk） signaling pathway. effects of -momordicin on jnk signaling pathway were analyzed. results： -momordicin

7、 could be prepared and purified （purity>97%）. compared with negative control group， 160 g/ml -momordicin could significantly induced early apoptosis of the cell after treated for 8 h （p0.05）. compared with 0 h， the expression of p-jnk， p-bad and caspase-9 were increased significantly and even rea

8、ched the peak value 0.25 h after medication （pkeywords -momordicin； apoptosis； hepatocyte l02； c-jun n-terminal kinase signaling pathway； low density lipoprotein receptor-related protein 1-苦瓜素是從苦瓜種子中提取的型核糖體失活蛋白（ribosome-inactivating proteins，rips），具有抗腫瘤、抗病毒等多種藥理學(xué)作用1-2。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，-苦瓜素通過(guò)激活凋亡信號(hào)通路胱天蛋白酶3（ca

9、spase-3），誘導(dǎo)乳腺癌mda-mb-231、mcf-7細(xì)胞凋亡3。本課題組在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，-苦瓜素雖能顯著抑制mcf-7細(xì)胞移植瘤的增殖，但也能引起動(dòng)物肝功能的異常和肝細(xì)胞的壞死4-5，使得其臨床應(yīng)用受到阻礙。目前有研究發(fā)現(xiàn)，同為型rips的天花粉蛋白（tcs）能通過(guò)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 （lrp 1）受體介導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞6-7。lrp1既是一種內(nèi)吞型受體，同時(shí)也具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，能激活c-jun氨基末端激酶（jnk）/促絲裂原活化蛋白激酶（mapk）等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡8。由于lrp1在肝細(xì)胞上分布極為豐富9，故筆者推測(cè)，-苦瓜素可能通過(guò)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋

10、亡。本研究以正常人胚肝細(xì)胞l02（簡(jiǎn)稱“l(fā)02細(xì)胞”）為試驗(yàn)對(duì)象，以流式細(xì)胞術(shù)分析-苦瓜素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，以液相芯片分析技術(shù)檢測(cè)-苦瓜素作用后，jnk信號(hào)通路凋亡信號(hào)蛋白中促調(diào)蛋白jnk、凋亡前體蛋白（bad）、caspase-9和抑調(diào)蛋白蛋白53（p53）、蛋白激酶b（akt）、b淋巴細(xì)胞瘤2（bcl-2）、caspase-8的表達(dá)水平變化，并以lrp1基因敲降法10驗(yàn)證該信號(hào)通路的lrp1 受體介導(dǎo)作用，從而闡明-苦瓜素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生途徑，為揭示-苦瓜素誘導(dǎo)的肝臟毒性發(fā)生機(jī)制提供參考。1 材料1.1 儀器bx51倒置熒光顯微鏡（日本olympus公司）；accuri 6流式細(xì)胞儀（美

11、國(guó)bd公司）； 76s/02324凝膠成像儀（美國(guó)bio-rad公司）；luminex 200液相芯片檢測(cè)分析系統(tǒng)（美國(guó)millipore公司）；akta蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)（美國(guó)ge公司）；ultrafle飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、maxis電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)bruker 公司）。1.2 藥品與試劑苦瓜種子（四川省農(nóng)科院種子公司，批號(hào)：20160912）；annexin -fitc凋亡試劑盒（美國(guó)biovision公司，批號(hào)：k201-100）；rpmi-1640培養(yǎng)基（美國(guó)gibco公司，批號(hào)：c11875500bt）；胎牛血清（美國(guó)hyclone公司，批號(hào)：nuco53）；兔抗人lrp1抗

12、體（美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab7975）；辣根過(guò)氧化物酶（hrp）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白g（igg）（美國(guó)r&d公司，批號(hào)：hy90077）；-肌動(dòng)蛋白（-actin）抗體（美國(guó)novus公司）；人早凋信號(hào)蛋白檢測(cè)試劑盒（內(nèi)含akt、jnk、bad、bcl-2、p53磷酸化抗體和caspase-8、caspase-9抗體，美國(guó)millipore公司，批號(hào)：48-669mag）；lrp1小干擾rna（sirna）試劑盒內(nèi)含a、b、c 3種序列sirna和非特異性sirna，3種序列sirna分別為lrp1-sirna-a（5 -acaccaauaagaag- cagaucaaugt-

13、3 ）、lrp1-sirna-b（5 -agauuuguccacagaguaaggccca-3 ）、lrp1-sirna-c（5 - ggcugugacugacgaggaaccgutt-3 ）、trans1.0轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)origene公司；細(xì)胞裂解液ripa、蛋白酶抑制劑均購(gòu)自美國(guó)millipore公司。1.3 細(xì)胞人胚肝細(xì)胞l02購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。2 方法2.1 -苦瓜素的制備及純化鑒定將苦瓜種子研磨成粉末并用50 mmol/l醋酸鹽緩沖溶液（ph=6.3）萃取，得到-苦瓜素粗提樣品；在2 條件下向粗提物中加入250 mmol/l hcl增溶，1 000 r/

14、min離心后，取上清液用1 mol/l磷酸鹽緩沖液（pbs，ph=7.0）中和，再用硫酸銨沉淀蛋白，得硫酸銨沉淀蛋白樣品；再分別經(jīng)sp-瓊脂糖凝膠色譜、離子交換層析、凝膠過(guò)濾色譜純化后，得到-苦瓜素蛋白純品。分別對(duì)上述純化過(guò)程收獲的中間樣品（硫酸銨沉淀蛋白樣品、sp-瓊脂糖凝膠色譜洗脫樣品、離子交換層析樣品）以及純化后-苦瓜素蛋白純品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page），并對(duì)純化后-苦瓜素蛋白純品進(jìn)行高效液相色譜（hplc）純度測(cè)定和飛行時(shí)間質(zhì)譜分子量分析以及電噴霧四極桿質(zhì)譜n-末端氨基酸序列分析。2.2 細(xì)胞培養(yǎng)肝細(xì)胞l02采用含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素

15、和100 g/ml鏈霉素的rpmi-1640培養(yǎng)基，于37 、5%co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.3 -苦瓜素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)按1×105個(gè)/孔將l02細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞貼壁達(dá)50%60%融合度時(shí)，分別加入終質(zhì)量濃度為0（陰性對(duì)照）、80、160 g/ml的-苦瓜素，并于給藥2、4、8 h后消化并重懸各孔細(xì)胞，加入5 l annexin 和10 l碘化丙啶（pi），用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，以flowjo 10軟件分析凋亡細(xì)胞的分布情況。2.4 lrp1-sirna轉(zhuǎn)染細(xì)胞將l02細(xì)胞接種于6孔板中，設(shè)置lrp1-sirna-a組、lrp1-sirna-b組、lrp1-si

16、rna-c組、非特異性sirna組和陰性對(duì)照組（pbs）。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到3040%時(shí)，分別向各組培養(yǎng)基中加入4 l 5 mmol/l的lrp1-sirna（a、b、c 3種）、非特異性sirna和pbs，然后加入20 l trans1.0轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染4 h后，將培養(yǎng)液更換為含有雙抗體（青霉素-鏈霉素）的10%胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。2.5 western blot法檢測(cè)lrp1-sirna沉默作用采用western blot檢測(cè)sirna基因的沉默效果。裂解“2.4”項(xiàng)各組細(xì)胞，提取蛋白，經(jīng)sds-page分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、分別加入一抗兔抗人lrp1抗體（

17、1 20 000），過(guò)夜冷藏，tbst緩沖液洗膜，分別加入二抗hrp-羊抗兔igg（1 1 000），37 孵育1 h，tbst緩沖液洗膜，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)成像結(jié)果，-actin作為內(nèi)參對(duì)照，篩選出使lrp1蛋白缺失85%以上的陽(yáng)性lrp1-sirna用于后續(xù)試驗(yàn)。2.6 液相芯片法檢測(cè)-苦瓜素對(duì)凋亡信號(hào)蛋白的影響2.6.1 分組及給藥 （1）正常組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的l02細(xì)胞接種于6孔板中，融合度60%時(shí)加入終質(zhì)量濃度為160 ?g/ml的-苦瓜素，分別于作用0、0.25、0.5、1、2 h后以ripa裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞裂解液樣品，4 下10 000 r/min離心，收集各上清液。（2）lr

18、p1-sirna沉默組。以“2.5”項(xiàng)篩選的陽(yáng)性lrp1-sirna轉(zhuǎn)染l02細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，同上述方法給藥處理，并收集各上清液。經(jīng)bca法測(cè)定如上所有上清樣品的蛋白含量，并調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度至0.4 mg/ml，-80 保存。2.6.2 凋亡信號(hào)蛋白的檢測(cè) 采用液相芯片分析系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞在-苦瓜素（160 ?g/ml）作用02 h后磷酸化jnk （p-jnk）、磷酸化bad（p-bad）、caspase-9、磷酸化p53（p-p53）、磷酸化akt（p-akt）、磷酸化bcl-2（p-bcl- 2）、caspase-8的表達(dá)水平，具體試驗(yàn)操作嚴(yán)格參考人早凋信號(hào)蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，以檢

19、測(cè)的各組細(xì)胞目標(biāo)蛋白的熒光強(qiáng)度（mfi值）反映其表達(dá)水平。將檢測(cè)到的各組細(xì)胞中p-jnk、p-bad、caspase-9、p-p53、p-akt、p-bcl-2、caspase-8的mfi值作為縱坐標(biāo)，-苦瓜素作用時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線圖。2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用spss 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用單因素方差分析。p<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 -苦瓜素蛋白的純化鑒定結(jié)果純化得到-苦瓜素蛋白純品，經(jīng)hplc色譜分析純度大于97%；飛行時(shí)間質(zhì)譜分析得出-苦瓜素蛋白樣品分子量為28 551.6 da，電噴霧四極桿質(zhì)譜分析得出該蛋白樣品n-末端5個(gè)氨

20、基酸序列n-天冬氨酸-纈氨酸-絲氨酸-苯丙氨酸-精氨酸，經(jīng)查詢，與ncbi公布的-苦瓜素序列一致（http：//），表明純化得到的蛋白樣品即為-苦瓜素蛋白。-苦瓜素純化過(guò)程及最終蛋白純品的sds-page電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。3.2 -苦瓜素誘導(dǎo)l02細(xì)胞早期凋亡結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，-苦瓜素質(zhì)量濃度為160 g/ml時(shí)，誘導(dǎo)l02細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率分別為2.8%（2 h）、3.8%（4 h）和6.2%（8 h），-苦瓜素質(zhì)量濃度為80 g/ml時(shí)，誘導(dǎo)l02細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率分別為2.6%（2 h）、3.4%（4 h）和3.8%（8 h）。與陰性對(duì)照組比較

21、，160 g/ml（8 h）的細(xì)胞凋亡率顯著升高（p0.05）。-苦瓜素誘導(dǎo)l02細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果如圖2。3.3 western blot檢測(cè)lrp1-sirna的基因沉默結(jié)果檢測(cè)結(jié)果顯示，l02細(xì)胞的lrp1受體經(jīng)sirna法基因沉默72 h后，lrp1-sirna-c組蛋白條帶缺失在85%以上，表現(xiàn)出了良好的沉默效果。l02細(xì)胞lrp1- sirna沉默效果的蛋白電泳圖見(jiàn)圖3。3.4 -苦瓜素對(duì)l02細(xì)胞凋亡信號(hào)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果各組細(xì)胞中p-jnk、p-bad、caspase-9、p-p53、p-akt、p-bcl-2、caspase-8熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，正常組于

22、給藥0.25 h時(shí)各促調(diào)蛋白p-jnk，p-bad和活化caspase-9表達(dá)達(dá)到高峰，直至給藥2 h時(shí)依然處于較高水平，且與0 h比較有顯著差異（p<0.05）；各抑調(diào)蛋白p-p53、p-akt、p-bcl-2、活化caspase-8各時(shí)段表達(dá)無(wú)顯著變化。與正常組比較，lrp1-sirna沉默組各時(shí)段促調(diào)蛋白表達(dá)明顯抑制（p<0.05），而抑凋蛋白的表達(dá)無(wú)顯著變化。表明lrp1受體的基因沉默可以顯著阻止-苦瓜素對(duì)l02細(xì)胞的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。4 討論苦瓜入藥在本草綱目滇南本草中早有記載11，從苦瓜種子中提取的-苦瓜素具有抗腫瘤、抗病毒等作用，是一種藥用價(jià)值較高的天然藥物1-2。研

23、究發(fā)現(xiàn)，-苦瓜素屬于rips，同天花粉蛋白一樣，被證實(shí)對(duì)乳腺癌、絨毛膜細(xì)胞癌、黑色素瘤等皆有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，已成為腫瘤治療的候選藥物之一12-13。在本課題組前期抗腫瘤試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，-苦瓜素雖能顯著抑制人乳腺癌mcf-7移植瘤的增殖，但同時(shí)也能引起動(dòng)物食欲減退、精神萎靡、肝功能異常等3，14；因此闡明-苦瓜素肝細(xì)胞損傷機(jī)制可為其藥物開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)質(zhì)量濃度為160 g/ml的-苦瓜素濃度作用于l02細(xì)胞8 h后可誘導(dǎo)l02細(xì)胞早期凋亡。-苦瓜素作用l02細(xì)胞后，其促調(diào)蛋白p-jnk、p-bad、caspase-9蛋白水平顯著升高，并在給藥后0.252 h達(dá)到高峰，而抑調(diào)

24、蛋白p-p53、p-akt、p-bcl- 2、caspase-8蛋白處于靜止或被抑制狀態(tài)，由此證明了-苦瓜素具有誘導(dǎo)l02細(xì)胞凋亡的作用。jnk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程即當(dāng)外源性刺激物與細(xì)胞膜受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶導(dǎo)致jnk和下游bad蛋白的磷酸化，bad一方面可抑制caspase-8，另一方面可活化caspase-9，從而導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡15。這7種凋亡蛋白是jnk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路蛋白，本試驗(yàn)結(jié)果也符合jnk信號(hào)途徑傳遞的細(xì)胞凋亡信息，初步揭示了-苦瓜素誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制。進(jìn)一步的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)-苦瓜素的特異性細(xì)胞受體lrp1被sirna基因沉默后，jnk的信號(hào)途徑的相關(guān)蛋白被明顯抑制。lrp

25、1是一種多配體共用受體，其細(xì)胞質(zhì)區(qū)域具有由天冬酰胺殘基（n）、脯氨酸殘基（p）及任何氨基酸殘基（x）和酪氨酸殘基（y）組成的兩個(gè)信號(hào)結(jié)構(gòu)域（npxy）16-17，這些信號(hào)結(jié)構(gòu)域可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)位點(diǎn)參與下游信號(hào)傳導(dǎo)，能通過(guò)mapk信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡8，jnk途徑是mapk通路的一種，主要發(fā)揮細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，本試驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明，-苦瓜素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用是由lrp1受體的介導(dǎo)完成的。本研究初步證明，通過(guò)jnk信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是-苦瓜素引起肝細(xì)胞毒性的早期發(fā)生機(jī)制。-苦瓜素與lrp1結(jié)合后，被介導(dǎo)內(nèi)吞入細(xì)胞中，抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而激發(fā)肝細(xì)胞凋亡，可為后續(xù)研究揭示-苦瓜素的肝臟毒性

26、發(fā)生機(jī)制提供參考。參考文獻(xiàn) 1 ng tb，wong jh，wang h. recent progress in resear- ch on ribosome inactivating proteinsj. curr protein pept sci，2010，11（1）：37-53. 2 puri m，kaur i，kanwar rk，et al. ribosome inactivating proteins （rips） from momordicacharantia for antiviral therapyj. curr mol med，2009，9（9）：1080-1094. 3 c

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