基因工程在廢水處理中的應(yīng)用與展望

1、基因工程在廢水處理中的應(yīng)用狀況及展望摘要： 本文對(duì)現(xiàn)代基因工程技術(shù)在污水生物處理系統(tǒng)中的應(yīng)用進(jìn)行了概述,利用基因工程技術(shù)提高微生物凈化環(huán)境的能力是用于廢水治理的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。筆者就基因工程技術(shù)的原理、研究?jī)?nèi)容和在污水處理領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行了闡述了，并對(duì)其研究方向作了展望。關(guān)鍵字： 基因工程，污水處理，應(yīng)用the application status of gene engineering technique to wastewater treatment and its prospectsabstract: the application of gene engineering techniqu

2、e in wastewater treatment process had been discussed in this paper, and gene engineering technique was the key technique for wastewater treatment by improving the purifying environment ability of microbes. the author formulated the principle, main research content of gene engineering technique, and

3、the application of gene engineering technique in wastewater treatment, and discussed its research orientation in the end. key words: gene engineering, wastewater treatment, application 生物法處理生活污水如今已被廣泛的應(yīng)用，但揭示污水中復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)方面存在很大的局限性， 并且有些特殊污水用自然界中自然進(jìn)化的微生物難于降解，基因工程的引進(jìn)開辟了培育高降解能力的新品菌種方法，利用基因工程技術(shù)檢測(cè)微生物性狀、提高微生

4、物凈化環(huán)境的能力是用于廢水治理的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。1 基因工程的定義基因工程（genetic engineering ）是指重組 dna 技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、 克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 （即重組 dna 技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞或基因工程生物體的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程?；蚬こ淌抢弥亟M技術(shù)，在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對(duì)各種生物的核酸（基因）進(jìn)行改造和重新組合， 然后導(dǎo)入微生物或真核細(xì)胞內(nèi)， 使重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類需要的基因產(chǎn)物，或者改造、創(chuàng)造新特性的生物類型。一個(gè)完整的、用于生

5、產(chǎn)目的的基因工程技術(shù)程序包括的基本內(nèi)容有：（1）外源目標(biāo)基因的分離、 克隆以及目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)與功能研究。這一部分的工作是整個(gè)基因工程的基礎(chǔ)，因此又稱為基因工程的上游部分。（2）適合轉(zhuǎn)移、表達(dá)載體的構(gòu)建或目標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)重組。 （3）外源基因的導(dǎo)入。（4）外源基因在宿主基因組上的整合、 表達(dá)及檢測(cè)與轉(zhuǎn)基因生物的篩選。 （5）外源基因表達(dá)產(chǎn)物的生理功能的核實(shí)。（6）轉(zhuǎn)基因新品系的選育和建立，以及轉(zhuǎn)基因新品系的效益分析。 （7）生態(tài)與進(jìn)化安全保障機(jī)制的建立。 （8）消費(fèi)安全評(píng)價(jià)。2 基因工程技術(shù)在廢水處理中的應(yīng)用環(huán)境污染已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了自然界微生物的凈化能力，已成為人們十分關(guān)注的問題。尤其是在污水

6、處理方面， 生物法逐漸成為廢水處理的主要方法。但是由于廢水的多樣性及其成分的復(fù)雜性， 自然進(jìn)化的微生物降解污染物的酶活性往往有限。20世紀(jì)90年代后期問世的 dna 改組技術(shù)可以創(chuàng)新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新的功能，創(chuàng)造出全新的微生物，就可以定向獲得具有特殊降解性狀的高效菌株，方便有效地應(yīng)用于水污染處理。 因此，構(gòu)建基因工程菌成為現(xiàn)代廢水處理技術(shù)的一個(gè)重要研究方向，且日益受到人們的重視。2.1 基因工程技術(shù)在污水檢測(cè)中的應(yīng)用2.1.1 聚合酶鏈反應(yīng) (pcr)技術(shù)在污水檢測(cè)中的應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction)是 20 世紀(jì) 80 年代后期由k.mulli

7、s等建立的一種體外酶促擴(kuò)增特異dna 片段的技術(shù)，pcr是利用針對(duì)目的基因所設(shè)計(jì)的一對(duì)特異寡核苷酸引物，以目的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行的dna 體外合成反應(yīng)。由于反應(yīng)循環(huán)可進(jìn)行一定次數(shù)(通常為 2530個(gè)循環(huán) ) ，所以在短時(shí)間內(nèi)即可擴(kuò)增獲得大量目的基因。這種技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。pcr 技術(shù)的基礎(chǔ)是只有在微生物特定核酸存在的條件下，重復(fù)性酶促 dna合成和擴(kuò)增才能夠發(fā)生。 pcr 擴(kuò)增產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠電泳來檢驗(yàn)和純化，也可以被用來克隆、轉(zhuǎn)化和測(cè)序 . 在具體應(yīng)用中往往采用經(jīng)過修正的或與其它技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的 pcr衍生技術(shù)，如 rt-pcr 、競(jìng)爭(zhēng) pcr 、pcr-dgge、p

8、cr-sscp 和巢式 pcr 等。pcr 通過對(duì)待測(cè) dna 片段的特異性擴(kuò)增， 一方面作為菌株定性鑒定的重要手段， 同時(shí)也為定性和定量研究微生物的群落特征提供幫助。自 pcr 技術(shù)問世以來，通過其自身的不斷完善以及同其它相關(guān)技術(shù)的聯(lián)用，在污水生物處理微生物的檢測(cè)和鑒定方面得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，為該領(lǐng)域的研究提供了一個(gè)高效、靈敏、簡(jiǎn)便的研究工具。 應(yīng)用 pcr-dgge ( polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrphoreses)方法對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行研究可以不經(jīng)過培養(yǎng)，直接從樣品中提取細(xì)菌的 dna ，再將編碼有 16sr

9、dna 的基因進(jìn)行擴(kuò)增。通過這種方法能夠直接了解樣品中微生物分布結(jié)構(gòu)， 并能大致比較相同條件下單一菌群的生物量。王峰等采用 pcr-dgge 技術(shù)來分析活性污泥與生物膜中微生物種群的結(jié)構(gòu)，可以不經(jīng)過常規(guī)培養(yǎng)而直接從活性污泥和生物膜樣品中提取dna ；marsh 等利用pcr-dgge 分析并獲得了活性污泥中真核微生物的種群變化情況；nicolaisen等利用 pcr-dgge 技術(shù)發(fā)現(xiàn) nitrosomonas-like細(xì)菌是上流式好氧流化床顆粒污泥中的主要氨氧化菌。以上的事實(shí)均說明，pcr-dgge 結(jié)合測(cè)序技術(shù)是一種完全可行的適于環(huán)境樣品微生物研究的快速分析方法。2.1.2 熒光原位雜交技

10、術(shù) (fish) 技術(shù)在污水檢測(cè)中的應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù) (fluorescence in situ hybridization，fish)結(jié)合了分子生物學(xué)的精確性和顯微鏡的可視性，能夠在自然的微生物環(huán)境中檢測(cè)和鑒定不同的微生物個(gè)體， 并提供污水處理過程中微生物的數(shù)量、空間分布和原位生理學(xué)等信息。 fish 技術(shù)的基本原理是通過熒光標(biāo)記的探針在細(xì)胞內(nèi)與特異的互補(bǔ)核酸序列雜交，通過激發(fā)雜交探針的熒光來檢測(cè)信號(hào)從而對(duì)未知的核酸序列進(jìn)行檢測(cè)。nielsen等(2001) 對(duì)工業(yè)廢水處理廠活性污泥的細(xì)菌表面疏水性進(jìn)行了原位檢測(cè)，并應(yīng)用fish 技術(shù)結(jié)合細(xì)胞表面微球體分析研究了絲狀細(xì)菌的胞外聚合物。 k

11、onuma 等(2001) 運(yùn)用 fish法來測(cè)定氨氧化菌 (ammonia-oxidizing bacteria)的數(shù)量，結(jié)果表明， fish 法對(duì)氨氮含量高的活性污泥混合液檢測(cè)結(jié)果較好，但對(duì)氨氮含量低的污水廠出水和河水的檢測(cè)效果不佳。表1 列舉了 fish技術(shù)的一些應(yīng)用實(shí)例。表 1 fish 技術(shù)在廢水中微生物檢測(cè)的具體應(yīng)用實(shí)例table1 the applications of fishin the microorganism detections in wastewater 應(yīng)用文獻(xiàn)來源檢測(cè)活化污泥反應(yīng)器中的microthrix parvicella （eberlet al.,1997

12、) 在 ebpr系統(tǒng)中 , 考察聚磷菌 (paos)的微生物特性和生化特性(minoet al.,1998) 探明廢水處理濕地生物膜中影響氨氧化的主要功能菌群(silyn-robertset al.,2001) 揭示 uasb 反應(yīng)器中高溫和中溫顆粒污泥的厭氧微生物群落的空間分布和多樣性(sekiguchiet al.,2002; syutsuboet al.,2001) 鑒定了活性污泥中硝化細(xì)菌群落的數(shù)量和空間分布( coskuneret al.,2002) sbr反應(yīng)器內(nèi) , 不同電子受體條件下, 反硝化除磷菌 (dnpaos)的種群變化(johuanet al.,2002) 2.1.3

13、dna 重組技術(shù)在污水檢測(cè)中的應(yīng)用dna 重組技術(shù)的實(shí)質(zhì)是， 將兩個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的dna 片段連接起來產(chǎn)生一個(gè)能在特定宿主中自主復(fù)制的dna 分子。其基本程序是 : 外源 dna 的獲得；選擇載體并進(jìn)行處理； 將目的 dna 片段和處理后的載體連接； 將連接產(chǎn)物導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞內(nèi)，使重組 dna 分子在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增； 將轉(zhuǎn)化菌落在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)成單個(gè)菌落， 篩選獲得含有重組dna 的陽性克隆。 在廢水的處理過程中僅靠分離和篩選的功能性微生物是不夠的。 在混合的微生物群體中篩選特定的微生物菌種時(shí)往往得不到預(yù)期的結(jié)果； 特定的微生物可能難以培養(yǎng)， 從而無法應(yīng)用到實(shí)際的生物反應(yīng)器中； 人類排

14、放到環(huán)境中的污染物越來越復(fù)雜且難以處理。因此，有必要通過基因工程技術(shù)并根據(jù)具體的需要構(gòu)建有效的基因工程菌或培育出可高效降解復(fù)雜多樣的有害污染物的細(xì)菌來解決以上的問題。2.2 利用基因工程菌降解廢水中的有機(jī)污染物生物處理法是廢水中有機(jī)污染物降解的主要方法，但是部分難降解有機(jī)污染物需要不同降解菌之間的協(xié)同代謝或共代謝等復(fù)雜機(jī)制才能最終得以降解, 這無疑降低了污染物的降解效率。首先, 污染物代謝產(chǎn)物在不同降解菌間的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是耗能過程 , 對(duì)細(xì)菌來說這是一種不經(jīng)濟(jì)的營養(yǎng)方式；其次, 某些污染物的中間代謝產(chǎn)物可能具有毒性，對(duì)代謝活性有抑制作用；此外, 將不同種屬、來源的細(xì)菌的降解基因進(jìn)行重組 , 把分屬

15、于不同菌體中的污染物代謝途徑組合起來以構(gòu)建具有特殊降解功能的超級(jí)降解菌, 可以有效地提高微生物的降解能力。satoshi soda 等11將基因工程菌 p.putidabh(psl0-45)接種到 sbr 反應(yīng)器的活性污泥中 , 用于處理 500mg/l的苯酚廢水 , 在大大提高苯酚去除率的同時(shí)改善了污泥沉降性能。南京大學(xué)、揚(yáng)子石油化工有限責(zé)任公司、香港大學(xué)、國家環(huán)?？偩帜暇┉h(huán)境科學(xué)研究所聯(lián)合完成了跨界融合構(gòu)建基因工程菌處理石化廢水的生物工程技術(shù)。在優(yōu)化調(diào)控技術(shù)的基礎(chǔ)上 , 該菌株對(duì)二甲苯、 苯甲酸、鄰苯二甲酸、4- 羧基苯甲醛和對(duì)苯二甲酸的降解率分別高達(dá)86% 、94% 、99% 、97%

16、和94%,比原工藝提高了 20% 30%,總有機(jī)碳去除率達(dá)到了94% ；污水經(jīng)過處理后 , 銅、錳、鋅、硒的濃度符合國家規(guī)定排放標(biāo)準(zhǔn), 生物毒性明顯降低。劉春等以生活污水為共基質(zhì), 考察了基因工程菌在mbr 和活性污泥反應(yīng)器中對(duì)阿特拉津的生物強(qiáng)化處理效果, 以及生物強(qiáng)化處理對(duì)污泥性狀的影響。結(jié)果表明, 基因工程菌在 mbr 中對(duì)阿特拉津具有很好的生物強(qiáng)化處理效果, 阿特拉津平均出水濃度為 0.84 mg/l, 平均去除率為 95%,最大去除負(fù)荷可以達(dá)到 70mg/(ld)。生物強(qiáng)化的 mbr 對(duì)生活污水中 cod 的平均去除率為 71%,cod 平均出水濃度 65mg/l。呂萍萍等研究發(fā)現(xiàn)，

17、克隆有苯降解過程中的關(guān)鍵基因甲苯加雙氧酶的基因工程菌e.coli.jm109(pkst11) 對(duì)苯具有較高的降解效率和降解速度, 應(yīng)用于固定化細(xì)胞反應(yīng)器中效果突出。在較短的水力停留時(shí)間內(nèi), 可以將1500mg/l苯降解70%,降解速度為 1.11mg/(l s), 延長(zhǎng)水力停留時(shí)間 , 可以使去除率達(dá)到 95% 以上。該反應(yīng)器對(duì)高濃度的苯具有突出的處理效果。同時(shí)所得到的產(chǎn)物為環(huán)己二烯雙醇,可以被野生非高效菌 w3 快速利用。2.3 基因工程技術(shù)在處理重金屬廢水中的應(yīng)用將基因工程技術(shù)應(yīng)用于重金屬廢水的治理，就是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)， 將外援基因轉(zhuǎn)入到微生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)， 使之表現(xiàn)出一些野生菌沒有的優(yōu)

18、良的遺傳性狀。2.3.1 基因工程菌強(qiáng)化生物化學(xué)法處理重金屬廢水生物化學(xué)法指通過微生物處理含重金屬廢水, 將可溶性離子轉(zhuǎn)化為不溶性化合物而去除。硫酸鹽生物還原法是一種典型生物化學(xué)法, 該法是在厭氧條件下硫酸鹽還原菌通過異化的硫酸鹽還原作用, 將硫酸鹽還原成h2s,重金屬離子和h2s反應(yīng)生成溶解度很低的金屬硫化物沉淀而被去除, 同時(shí) h2so4的還原作用可將 so2-4轉(zhuǎn)化為 s2-而使廢水的 ph 值升高 , 從而形成重金屬的氫氧化物而沉淀。中國科學(xué)院成都生物研究所從電鍍污泥、 廢水及下水道鐵管內(nèi)分離篩選出35 株菌株 , 從中獲得高效凈化 cr(vi) 復(fù)合功能菌。袁建軍等利用構(gòu)建的高選擇型

19、基因工程菌生物富集模擬電解廢水中的汞離子, 發(fā)現(xiàn)電解廢水中其他組分的存在可以增大重組菌富集汞離子的作用速率, 且該基因工程菌能在很寬的ph范圍內(nèi)有效地富集汞。但高濃度的重金屬廢水對(duì)微生物毒性大 , 故此法有一定的局限性 , 不過, 可以通過遺傳工程、馴化或構(gòu)造出具有特殊功能的菌株 , 微生物處理重金屬廢水一定具有十分良好的應(yīng)用前景。2.3.2 基因工程強(qiáng)化生物絮凝法處理重金屬廢水生物絮凝法是利用微生物或微生物產(chǎn)生的具有絮凝能力的代謝物進(jìn)行絮凝沉淀的一種除污方法。生物絮凝劑又稱第三代絮凝劑，是帶電荷的生物大分子，主要有蛋白質(zhì)、黏多糖、纖維素和核糖等。目前普遍接受的絮凝機(jī)理是離子鍵、氫鍵結(jié)合學(xué)說。

20、前述硅酸鹽細(xì)菌處理重金屬廢水可能的機(jī)理之一就是生物絮凝作用。目前對(duì)于硅酸鹽細(xì)菌絮凝法的應(yīng)用研究已有很多，有些已取得顯著成果7。運(yùn)用基因工程技術(shù)， 在菌體中表達(dá)金屬結(jié)合蛋白分離后，再固定到某些惰性載體表面，可獲得高富集容量絮凝劑。mehran pazirandeh 等人將含金屬結(jié)合肽 (cysglycyscysgiy) 的基因與麥芽糖結(jié)合蛋白的基因進(jìn)行融合，并將融合蛋白在ecoli 細(xì)胞膜處表達(dá)，表達(dá)該融合蛋白的基因工程菌對(duì)人工合成廢水中cdz+ 和h +的去除率有很大的提高，cdz 和h +的富集能力分別達(dá)到每毫克濕細(xì)胞1 1和1 3nmol， 而對(duì)照菌株 (缺少金屬結(jié)合肽 ) 的富集能力低于

21、每毫克濕細(xì)胞01 nmol masaaki terashima 等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使 e.coli表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白（pmal）與人金屬硫蛋白（ mt ）的融合蛋白 pmal-ml 并將純化的 pmal-mt 固定在 chitopeara 樹脂上，研究其對(duì) ca2+和 ga2+的吸附特性，該固定了融合蛋白的樹脂具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，并且其吸附能力較純樹脂提高十倍以上。3 展望自2000年，國際上提出基于系統(tǒng)生物學(xué)原理的基因工程概念后，基因工程被應(yīng)用于社會(huì)各個(gè)領(lǐng)域， 并且手段日新月異。 在環(huán)境領(lǐng)域當(dāng)中， 基因工程正迅速應(yīng)用到廢水檢測(cè)和廢水治理當(dāng)中，培養(yǎng)出新的特效物種并進(jìn)一步提高其應(yīng)用效率、降低應(yīng)用成本

22、。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)、 環(huán)境工程檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展并結(jié)合我們已經(jīng)掌握的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能方面的知識(shí), 我們逐漸了解到污水生物處理系統(tǒng)中微生物群體的多樣性、實(shí)際生存狀態(tài)、功能特點(diǎn), 并更有效地對(duì)其加以開發(fā)和利用。此外，基因工程菌的出現(xiàn)，使以往的一些難降解有機(jī)廢水、制藥廢水、石油廢水、重金屬污染廢水以及其他有毒有害廢水等都得到了有效地治理，還會(huì)實(shí)現(xiàn)廢水資源化。當(dāng)下引入 dna 擴(kuò)增和其它生物技術(shù)的環(huán)境監(jiān)測(cè)方法等將是基因工程技術(shù)研究的側(cè)重方向?；蚬こ碳夹g(shù)作為一種新興技術(shù)以極快的速度發(fā)展。以下兩方面的研究將對(duì)水資源保護(hù)有著重要意義。一是對(duì)基因工程菌的深入研究, 如基因工程菌對(duì)污染物的代謝途徑、 控制

23、目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子基因序列、降解基因表達(dá)的調(diào)控條件的優(yōu)化等方面的研究； 二是對(duì)環(huán)境中微生物的習(xí)性及基因工程菌與環(huán)境中微生物和污染物之間的相互作用進(jìn)行研究。 目前的研究主要是利用單一的基因工程菌對(duì)污染物進(jìn)行處理 , 隨著研究的不斷深入, 利用多種基因工程菌相結(jié)合對(duì)污染物進(jìn)行處理 , 將對(duì)水資源保護(hù)起到更為重要的作用。4 參考文獻(xiàn)1 李向東，馮啟言，于洪鋒. 基因工程菌在制藥廢水處理中的應(yīng)用. 工業(yè)水處理，2008, 28(8) ： 70-71. 2 楊林 , 聶克艷 , 楊曉容 , 高紅衛(wèi) . 基因工程技術(shù)在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,20(5):11-30. 3 邢雁霞 ,

24、劉斌鈺 . 基因工程技術(shù)的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景. 大同醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),2006 年第3期:48. 4 johwan a, tomotaka d, satoshi t, et al.2002. characterization of denitrifying phosphate-accumulating organisms cultivated under different electron acceptor conditions using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis assay j. w

25、at res, 36:403412. 5 leo e, renate s, aldo a, et al. 1997.use of green fluorescent protein as a marker for ecological studies of activated sludge communitiesj. fems microbiology letters, 149(1):20:7783. 6 marsh tl, liu wt, forney lj. 1998. beginning a molecular analysis of the eukaryal community in

26、activated sludge j. wat sci tech, 37(45):455 460. 7 metcalf, eddy, inc.2003. wastewater engineering: treatment and reuse (fourth edition)m.beijing: tsinghua university press:129130. 8 mette h n, niels b r. 2002. denaturing gradient gel electrophoresis (dgge) approaches to study the diversity of ammo

27、nia-oxidizing bacteria j. journal of microbiological methods, 50:189203. 9 wang f, fu y g. 2004. characteristics of municipal sewage chem-bioflocculation treatment process by using pcr-dgge technologyj. environmental science,25(6):7480 (in chinese). 10 wang j, chicharro m, rivas g,et al. 1996. dna b

28、iosensor for the detection of hydrazinesj. anal chem, 68(13): 2251 2254. 11 zhang d, zhang d m, liu y p,et al. 2004. community analysis of ammonia oxidizer in the oxygen-limited nitritation stage of oland system by dgge of pcr amplified 16s rdna fragments and fish j. journal of environmental science

29、s, 16(5):838 842 . 12 sellwood j,litton p a,mcdermott j,et al. 1995. studies on wild and vaccine strains of poliovirus isolated fromwater and sewage j. wat sci tech, 31(5 6):317 321. 13 selvaratnam s, shoedel b a, mcfarland b l, et al.1997.application of the polymerase chain reaction and reverse tra

30、nscriptase/pcr for determining the fate of phond-degrading pseudomonas putida attcc 11172 in a bio-augmented sequencing bath reactor j. appl environ microbiol, 47:236 240. 14 simont.1999.pcr and the detection of microbial pathogens in water and wastewaterj.wat res,33(17):35453556. 15 zhao, x. w., m. h. zhou, q. b. li, et al. simultaneous mercury bioaccu