真核細(xì)胞rna提取的實驗報告范文

1、真核細(xì)胞rna提取的實驗報告范文 本方法利用鹽酸胍抑制rna酶，勻漿裂解細(xì)胞，采用有機(jī)溶劑抽提去除蛋白質(zhì)。通過選擇性沉淀rna分子去除dna。 1.樣品處理 組織樣品處理：取新鮮的組織樣品稱重后，剪碎成約1cm2的組織塊直接參加勻漿液中進(jìn)行rna提取，或液氮中速凍-70保存。 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞處理：用pbs洗細(xì)胞一次，吸干溶液后將培養(yǎng)板快速移至液氮中冷凍后轉(zhuǎn)到-70保存；或參加1ml勻漿至培養(yǎng)板中直接裂解細(xì)胞，然后將粘稠的裂解液進(jìn)一步勻漿。 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞處理：離心收集細(xì)胞，用phs懸浮漂洗再田心收集，假設(shè)不立即提取rna，那么可經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)至一70貯存?zhèn)溆谩?2加l倍體積鹽酸胍勻漿液至準(zhǔn)備好的樣

2、品細(xì)胞中，高速勻漿1min。 3勻漿液5000g，室溫離心10min。 4將上清移至一個干凈離心管中，參加0.1體積的3moll乙酸鈉（ph5.2），混勻，再加5體積預(yù)冷的乙醇，立即充分混勻，-20放置至少2小時。 55000g 0離心10分鐘沉淀核酸，棄上清液，室溫枯燥。 6，每個提取rna的組織或細(xì)胞樣品中，參加l015min鹽酸胍勻漿液，攪拌溶解。 7參加2.5體積預(yù)冷的乙醇，立即充分混勻，-20至少放置2小時。 85000g 0離心10分鐘沉淀核酸，去上清，室溫?fù)]發(fā)乙醇。 9按每克組織細(xì)胞加5min的比例分兩次參加0.02moll edta(ph8.0) 先加12體積edta振蕩l2分

3、鐘，3000g離心2min吸出上清再加另一個1/2體積的edta振蕩l一2分鐘合并兩次核酸溶解液。 10用等體積氯仿正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g室溫離心l0min，5000g室溫離心10min。吸出上清至另一個干凈離心管中。 11加3倍體積lmoll乙酸鈉 (ph7.0) 混勻，-20放置1h以上，此時rna將選擇地沉淀，而dna仍為溶解狀況。 125000g，0離心20min，沉于管底的是rna。 13吸去上清，用4預(yù)冷的lmoll乙酸鈉(ph70)漂洗rna沉淀。然后20 5000g，離心20分鐘?；厥誶na。 14盡量去除上清液。按每g組織細(xì)胞1m的比例參加rna溶解液(0.

4、2sds，0.5moll edta，ph8.0)。注意：假設(shè)有sds沉淀析出滴加0.11moll naoh調(diào)溶液ph至75。 15參加2倍體積冰預(yù)冷乙醇混勻，0放置至少2小時，5000g，4離心10分鐘，rna沉淀用70乙醇漂洗，短暫離心后，棄上清，室溫枯燥蒸發(fā)乙醇。 16用適當(dāng)小容積depc處理過的ddh2o溶解rna沉淀，參加3倍體積乙醇， -70保存rna備用。用時參加0.1體積的3moll乙酸鈉，混勻，120xxg，4離心回收rna。 1鹽酸胍勻漿液 成分：8moll鹽酸胍(分子量為95.6)，o1moll乙酸鈉(ph52)，5mmoll 2巰基乙醇，0.5十二烷基肌氨酸鈉 配制方法：

5、取191g鹽酸胍加8.35m1 3moll乙酸鈉(ph52)和625ml 02moll 2琉基乙醇溶液中，再加水至2375ml，混勻后加125ml 10十二烷基肌氨酸鈉,振蕩混勻溶解。 2鹽酸胍勻漿液 成分：8moll鹽酸胍(分子量力95.6),0.1moll乙酸鈉(ph52),1mmoll 2 琉基乙醇，20mmoll edta(ph8.0) 配制方法：取191g鹽酸胍，加日35ml 3moli。乙酸鈉(ph52)和125ml 02mol l 2巰基乙醇溶液中，再參加10ml 0.5moll edta(ph8.0)。加水至250ml混勻。 3.乙醇 4.70乙醇 5.氯仿正丁醇(4：l，體積

6、比) 6.4moll乙醇鈉，ph7.0 7.3moll乙醇鈉，ph5.2 8.rna溶解液 成分：o2sds0.05moll edta, ph8.0 提取rna時，要特別注意防止rnase的污染，所用玻璃器皿均應(yīng)用0.1的二乙基焦碳酸鹽(diethyl pyrocarbonate，depc)處理。塑料器材均使用一次性用品，并高壓滅菌處理，必要時，也可用0.1%depc處理。 rna是基因表達(dá)產(chǎn)物，由以下幾類分子組成，rrna（占細(xì)胞總rna的80%85%）、trna和核內(nèi)小分子rna（占1015%）、mrna（占15%）。其中mrna是分子生物學(xué)的主要研究對象，別離制備mrna是克隆基因，分析

7、基因表達(dá)以及建立cdna文庫的首要步驟。 真核細(xì)胞總rna別離提取的目的是要獲得高純度的具有充分長度的rna分子，包括rna的純度和完整性。rna別離的關(guān)鍵是盡量減少rna酶的污染。rna酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性的rna酶外，環(huán)境中也存在rna酶。因此在提取rna時，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個無rna酶的環(huán)境，包括去除外源性rna酶的污染和抑制內(nèi)源性rna酶活性。主要是采用rna酶的阻抑蛋白rnasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑鹽酸胍或異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性rna酶，采用焦碳酸二乙酯（depc）去除外源性rna酶。 真核細(xì)胞rna的提取過程有四個關(guān)鍵點，即樣品（細(xì)胞或組織）的有效破碎；有效地使核蛋白

8、復(fù)合體變性；對內(nèi)源rna酶的有效抑制；有效地將rna從dna和蛋白混合物中別離；其中最關(guān)鍵的是抑制酶活性。提取的rna可以用于核酸雜交、cdna合成以及體外翻譯等。 1.儀器：勻漿器、低溫離心機(jī)、離心管。 2.試劑：氯仿、75%乙醇、異丙醇、depc溶液、1%甲醛變性膠、37%甲醛、3%過氧 化氫、甲酰胺、rna上樣緩沖液。 3.主要步驟 （1）取組織50100mg，加0.8ml trizol沖洗勻漿器，移入同一離心管，冰上靜置5min。 氯仿，充分震蕩混勻，靜置 0.5ml異丙醇，顛倒混勻。 1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉 淀， 10min。 l depc溶液，充分溶解rna rna溶解液，

9、按一定比例稀釋后，紫外分光光度計測 值，計算od260/od280 od2601時，rna濃度約為 ）od260×稀釋倍數(shù)×40 1%甲醛變性膠電泳觀察 甲醛變性凝膠板：4.5l rna，120xxg×靜置2h，41.72.0，根據(jù)下述公式計算×甲醛膠電泳緩沖液，離心。棄沉淀。 ×10min×5min離心。 ：1之間，說明rna濃度：3%過氧化3.5l 37%甲（2）加0.2ml3min，415min（3）取上清，參加204，120xxg離心。 （4）棄上清，取沉淀，參加，7500g（5）棄上清，沉淀真空枯燥（6）加40。 4.結(jié)果鑒

10、定 （1）紫外分光光度計檢測：取定260nm、280nmod比值，如果比值在rna純度可。 標(biāo)準(zhǔn)樣品當(dāng)40g/mlrna濃度（g/ml。 （2）電泳檢測：rna質(zhì)量，電泳槽及制膠板先用氫浸泡過夜；制1%，2ul 5 醛，10ul甲酰胺，離心混勻，65變性15min后，迅速置冰浴中；再參加2l rna上樣緩沖液，離心混勻后上樣，6v/cm電壓，電泳12h；暗室內(nèi)紫外光下觀察，拍照；如果觀察到清晰的18s、28s rna電泳帶，無大量小分子rna，說明rna無明顯降解，樣品70保存?zhèn)溆谩?1、所有玻璃器皿160180高溫干烤6h以上，非耐高溫器皿經(jīng)0.1% depc液浸泡后，經(jīng)高溫（15磅，20m

11、in）處理滅活rna酶，所用試劑均用depc水配制，然后高壓處理。 2、實驗用水要經(jīng)depc處理，但含tris的試劑不能用depc處理。 3、實驗操作過程中要戴一次性手套，以防止rna酶污染。 藥大0942605 實驗原理： 根據(jù)成熟雌蟾蜍體內(nèi)含大量卵細(xì)胞且可以方便獲取，細(xì)胞內(nèi)含核酸豐富，沒有其它組織器官等的干擾等優(yōu)點以確定蟾蜍卵細(xì)胞為實驗所需的真核細(xì)胞。通過trizol溶液中變性劑破碎真核細(xì)胞，然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提rna，再利用rna不溶于異丙醇的性質(zhì)將自身析出，到達(dá)別離提純的目的。 trizol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可

12、有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制rna酶活性，因此trizol中還參加了8羥基喹啉、異硫氰酸胍、-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源rnase（rna酶）。0.1%的8羥基喹啉可以抑制rnase，與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸別離。-巰基乙醇的主要作用是破壞rnase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。 甲基綠吡羅紅為堿性染料，它分別能與細(xì)胞內(nèi)的dna、rna結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色。當(dāng)甲基綠與吡羅紅作為混合染料時，甲基綠與染色質(zhì)中dna選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色；吡羅紅與核仁、細(xì)胞質(zhì)中的rna選擇性結(jié)合顯示紅色

13、。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用，同時兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的dna結(jié)合呈現(xiàn)綠色。而吡羅紅那么與聚合程度較低的rna結(jié)合呈現(xiàn)紅色（但解聚的dna也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn)紅色）。即rna對派洛寧親和力大，被染成紅色，而dna對甲基綠親和力大，被染成綠色。09419 1.甲基綠吡羅紅染料：染色劑a液的兩種配制方法 第一種方法：取吡羅紅甲基綠粉1g，參加到100ml蒸餾水中溶解，然后用濾紙過濾，將濾液放入棕色瓶中備用。 第二種方法：取甲基綠2g溶于98ml蒸餾水中，取吡羅紅g5g溶于95ml蒸餾水中。取6ml甲基綠溶液和2ml吡羅紅溶液參加到16m

14、l蒸餾水中，即為a液，放入棕色瓶中備用。（注意：用于核酸染色的是吡羅紅g，請不要錯買吡羅紅b。） 染色劑b液的配制方法b液是一種緩沖液，由乙酸鈉和乙酸混合而成。先取乙酸鈉16.4g，用蒸餾水溶解至1000ml備用；再取乙酸12ml，用蒸餾水稀釋至1000ml備用。取配好的乙酸鈉溶液30ml和稀釋的乙酸20ml，加蒸餾水50ml，配成ph為4.8的b液（緩沖液）。 染色劑的配制染色劑是由a液、b液混合配制而成的。取a液20ml和b液80ml混合，就是實驗中所用的吡羅紅甲基綠染色劑。應(yīng)該注意的是該試劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。 2.trizol試劑（invitrogen公司購置） 3.75%乙醇 4.氯仿 5.

15、異丙醇 6.nacl(0.14m/l) （二）器材 1.離心機(jī)（3000r.p.m） 2.冰浴 3研缽 4.燒杯 5.量筒 6.試管 7.玻棒 8.膠頭滴管9 9.離心管 10.天平 以班級為單位，稱取大概10g蟾蜍卵細(xì)胞（23保存），于研缽（可置于冰浴鍋上）中，根據(jù)1030mg組織細(xì)胞加1mltrizol試劑的量參加其中，快速研磨，制備勻漿。實驗二人合作為一組，每組取大概10ml勻漿。 取回勻漿后，室溫靜置10min，使樣品充分裂解離心(3000r.p.s)20mins取上清液移至新的離心管加1/5trizol溶液體積氯仿在手中反復(fù)振蕩搖勻，室溫靜置10min。離心20mins取上清液在上清中參加等體積冰冷的異丙醇，室溫放置10min。充分混勻，靜置10minute離心20min沉淀用75%乙醇洗滌兩次 取2支干凈試管，一管參加1.5mlrna溶液（將