環(huán)境微生物綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、環(huán)境微生物綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告官洲河段不同斷面微生物群落分布的測定見習(xí)類型專業(yè)見習(xí)院 別化學(xué)與環(huán)境學(xué)院專 業(yè)環(huán)境工程指導(dǎo)教師成文老師班 級(jí)2010級(jí)環(huán)境工程姓 名翟錦亮學(xué) 號(hào)201024001322012年12月目錄1. 前言32. 實(shí)驗(yàn)方案與思路33. 實(shí)驗(yàn)方法3 3.1 儀器3 3.2 試劑 4 3.3內(nèi)容44. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果84.1 水樣觀察84.2 水樣細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算94.3 水樣菌落的培養(yǎng)觀察94.4 水樣菌落數(shù)的計(jì)算114.5 微生物個(gè)體菌種形態(tài)的觀察125. 實(shí)驗(yàn)分析135.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析135.2 實(shí)驗(yàn)存在問題145.3 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)意見156. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論157. 實(shí)驗(yàn)收獲15參考文獻(xiàn)16

2、1. 前言微生物的群落結(jié)構(gòu)與功能是微生物生態(tài)學(xué)的研究主題之一。水體中微生物與區(qū)域環(huán)境有著密切的聯(lián)系,其數(shù)量及種群分布與水的類型、有機(jī)物含量、微生物的拮抗作用等多種因素密切相關(guān)。對(duì)它的研究將有助于了解水體的富營養(yǎng)現(xiàn)狀及水域中C、N、P循環(huán)方式,并可為水體的整體治理方案提供依據(jù)2。本實(shí)驗(yàn)將大學(xué)城官洲河段到入珠江段分為三個(gè)斷面（對(duì)照斷面，控制斷面，消減斷面），在同一天同一時(shí)間段對(duì)各斷面水體的水樣分別采樣比較，測定水體中微生物的種類和數(shù)量，了解官洲河段不同斷面的水體中存在的微生物的種類和數(shù)量，分析各斷面中微生物群落的分布特點(diǎn)，了解各斷面水體污染情況以及污染物對(duì)水體中微生物群落的影響。2、實(shí)驗(yàn)方案與思路

3、2.1 采樣容器的洗滌和滅菌2.2 水樣的采集2.3 水樣微生物的觀察2.4 培養(yǎng)基的制備2.5 微生物的純種分離與培養(yǎng)2.6 微生物菌種的革蘭氏染色2.7 微生物菌種的觀察與鑒定3.實(shí)驗(yàn)方法 3.1 實(shí)驗(yàn)儀器高壓滅菌類：培養(yǎng)皿（12個(gè)）、試管（9支）、移液管（3支，1mL）、高壓蒸汽滅菌器、錐形瓶（1個(gè)）制備培養(yǎng)基類：燒杯（1000mL）、藥物天枰、玻璃棒、藥匙、pH試紙、加熱器、超凈工作室、恒溫培養(yǎng)箱觀察類：顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、血球計(jì)數(shù)板、滴管、燒杯、量筒（1個(gè)，10mL） 3.2 實(shí)驗(yàn)試劑肉膏胨淀粉培養(yǎng)基配方1：牛肉膏3g，蛋白胨10g，淀粉2g，氯化鈉5g,瓊脂15

4、-20g，蒸餾水1000mL，pH：7.47.8,。滅菌條件：0.101MPa(121oC，1520min)。革蘭氏染色液一套：草酸銨結(jié)晶染色液，革蘭氏碘液，體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，番紅染液其他：去離子水、無菌水3.3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 實(shí)驗(yàn)器材的洗滌與滅菌【1】將培養(yǎng)皿、試管、移液管用洗衣粉洗刷并用自來水沖洗干凈，再用去離子水沖洗12次，然后用報(bào)紙包好放入高壓蒸汽滅菌器中滅菌（121oC，相對(duì)蒸汽壓力0.103MPa，1520min），滅菌后放入無菌室備用。水樣的采集按下圖所示分別到三個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行采樣。采樣時(shí)，應(yīng)小心開啟包裝紙或瓶蓋，避免瓶蓋或瓶頸受到雜菌污染。水樣的保存為防止微生物發(fā)生質(zhì)的改變, 裝

5、好的樣品瓶要在絕熱箱中運(yùn)送。當(dāng)外界溫度較高時(shí)還要冷卻, 采樣容器也不要受任何直接陽光照射, 以免紫外線殺死微生物。采好的水樣應(yīng)立即送往實(shí)驗(yàn)室, 一般從取樣到檢驗(yàn)不宜超過兩小時(shí), 否則應(yīng)使用10oC以下的冷藏設(shè)備保存樣品, 但不得超過6小時(shí),實(shí)驗(yàn)室接到送檢樣品后, 應(yīng)將樣品立即放入冰箱, 并在兩小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn), 如果因路途遙遠(yuǎn), 送檢時(shí)間超過6小時(shí), 應(yīng)考慮采用延遲培養(yǎng)法4。 水樣微生物的觀察與計(jì)數(shù)A.水樣微生物的觀察（1）觀察比較從三個(gè)斷面（對(duì)照斷面、控制斷面、削減斷面）取回來的水樣，簡單描述三個(gè)水樣的外觀特征。（2）用壓滴法分別制片觀察三個(gè)斷面的原水樣水中微生物的種類、數(shù)量和形態(tài)。*壓滴法制

6、片方法1：如下圖所示，取一片干凈的載玻片放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用滴管吸取樣品于載玻片中央，用干凈的蓋玻片覆蓋在液滴上（注意不要有氣泡）即成標(biāo)本片，用低倍鏡和高倍鏡觀察，要充分利用顯微鏡的移片夾的移動(dòng)，注意觀察微生物組成。 B.水樣細(xì)菌總數(shù)的測定【1】（1）血球計(jì)數(shù)板的細(xì)胞計(jì)數(shù) 1）稀釋：將樣品稀釋至合適的濃度，一般將樣品稀釋至每一中格約有1520個(gè)細(xì)胞數(shù)為宜。本實(shí)驗(yàn)為了方便操作，故直接使用用于水樣細(xì)菌稀釋培養(yǎng)的稀釋水樣觀察。因此，水中微生物計(jì)數(shù)應(yīng)該在水中微生物純種分離之后，以防止污染稀釋水樣。 2）加被測水樣至血球計(jì)數(shù)板：取已洗凈的血球計(jì)數(shù)板，將蓋玻片蓋住中央計(jì)數(shù)室，用細(xì)口滴管吸取少量已經(jīng)充分搖勻的稀

7、釋水樣于蓋玻片的邊緣，水樣則自行滲入計(jì)數(shù)室，靜止510min，待水樣自然沉降并穩(wěn)定后即可計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)過程中，可根據(jù)各斷面水樣的外觀初步判斷取用的稀釋倍數(shù)。如控制斷面的水樣明顯較渾濁，則應(yīng)先選取1000倍的稀釋液計(jì)數(shù)。3）計(jì)數(shù)：先用低倍鏡尋找大方格網(wǎng)的位置，找到計(jì)數(shù)室后將其移至視野的中央，再換高倍鏡觀察和計(jì)數(shù)。需不斷地上、下旋動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)輪，以便看到計(jì)數(shù)室內(nèi)不同深度的菌體。為了減少誤差，所選的中格位置應(yīng)布點(diǎn)均勻，如規(guī)格為25個(gè)中格的計(jì)數(shù)室，通常取4個(gè)角上的4個(gè)中格及中央的1個(gè)中格共5個(gè)中格進(jìn)行計(jì)數(shù)。當(dāng)樣品的細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，應(yīng)計(jì)算所有中格的細(xì)胞數(shù)。（2）計(jì)算方法 結(jié)果計(jì)算：先求得每中格菌數(shù)的平均值，乘以中

8、格數(shù)（16或25），即為一大格（0.1mm3）中的總菌數(shù)，再乘以104，則為每毫升稀釋液的總菌數(shù)。如要換算成原液的總菌數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)即可。兩種不同規(guī)格的血球計(jì)數(shù)板的計(jì)算方法如下：16×25的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)（mL）（100小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)/100）×400×10 000×稀釋倍數(shù)25×16的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)（mL）（80小格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)/80）×400×10 000×稀釋倍數(shù)培養(yǎng)基的制備a.成分：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15-20g，淀粉2g，蒸餾水1000ml。b.方法：取牛肉膏0.5

9、g，加水100ml，再加入蛋白胨、氯化鈉、加熱使之完全溶解，調(diào)整pH值至7.27.4，分裝，高壓滅菌后備用。c.向滅菌后冷卻至5060oC的培養(yǎng)皿倒入一定量的滅菌后的溶液，將培養(yǎng)皿放置于無菌室冷卻備用。水樣微生物的純種分離與培養(yǎng)水樣稀釋取一個(gè)試管架，將9支高壓滅菌過的試管依次擺好，分別貼上標(biāo)簽：水樣斷面+稀釋倍數(shù)。在無菌操作條件下，用“十倍稀釋法”【1】將三個(gè)水樣分別稀釋10、100、1000倍。稀釋時(shí)，先在無菌試管中加入9mL無菌水，然后用無菌移液管移取1mL原水樣于試管中，將移液管吹洗3次，塞上橡皮塞搖勻，即為10-1濃度的水樣；用1mL移液管吸取1mL10-1濃度的水樣于9mL無菌水中，

10、將移液管吹洗3次，搖勻，即為10-2濃度的水樣；同理稀釋得到濃度為10-3的水樣；注意，每個(gè)水樣只用一根移液管。稀釋過程如圖所示。 水樣微生物的培養(yǎng)在超凈工作室中，用1mL無菌移液管按從低濃度到高濃度的順序分別移取1mL稀釋倍數(shù)為1000倍、100倍、10倍以及原水樣4個(gè)水樣于制備好的培養(yǎng)基上，按“水樣斷面+稀釋倍數(shù)”的格式貼上標(biāo)簽，然后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時(shí)針和反時(shí)針來回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于37oC的恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2448h，然后觀察結(jié)果。微生物菌種的革蘭氏染色通過涂片染色觀察微生物個(gè)體形態(tài)。用接種環(huán)按號(hào)碼順序選擇幾種細(xì)菌（單菌落）做涂片，進(jìn)行革

11、蘭氏染色，并作鏡檢，確定其革蘭氏染色反應(yīng)，并繪出其形態(tài)圖。由于只做一次分離實(shí)驗(yàn)，得到的單菌落可能還不太純，鏡檢時(shí)會(huì)出現(xiàn)多種形態(tài)。a.涂片、固定 干燥過程最好在空氣中自然晾干，為了加速干燥，也可在微小火焰上方烘干。烘干后再在火焰上方快速通過34次，使菌體完全固定在載玻片上。但不宜在高溫上長時(shí)間烤干，否則急速失去會(huì)使菌體變形。b.初染 滴加草酸銨結(jié)晶染色液染色12min，水洗。c.媒染滴加革蘭氏碘液，染12min，水洗。d.脫色 滴加體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，約45s后即水洗；或滴加體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇后將玻片搖晃幾下即傾出乙醇，如此重復(fù)23次后即水洗。e.復(fù)染滴加沙黃液（番紅），染23min，水

12、洗并使之干燥。微生物菌種的觀察與鑒定 觀察菌落的大小、形狀、表面結(jié)構(gòu)、隆起度、邊緣結(jié)構(gòu)、菌從高度、表面性狀、顏色、透明度、氣味、質(zhì)地軟硬情況、表面光滑與粗糙情況和干濕度等綜合情況。將上述步驟染色的微生物按顯微鏡的操作步驟觀察菌體形態(tài)，及時(shí)記錄，并進(jìn)行形態(tài)圖的繪制。4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 水樣觀察（1）對(duì)照斷面（小洲村）：水樣較清，無色透明；用顯微鏡觀察，可觀察到很多藻類，藻類種類不多，體積比較大，以圓形藻，球形藻為主。（2）控制斷面（中大）：水樣呈淺綠色，可明顯觀察到有綠色絲狀懸浮生物；用顯微鏡觀察，可觀察到很多不同種類的藻類；藻類的體積普遍比較小，形狀有長桿狀、鏈球狀等。（3）削減斷面（商業(yè)北

13、區(qū)）：水樣無色，有輕微白色渾濁；用顯微鏡觀察，可觀察到藻類；藻類的種類不多，體積較大，以線狀發(fā)散生長的藻類為主。4.2 水樣細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算水樣來源中格1（個(gè)）中格2（個(gè)）中格3（個(gè)）中格4（個(gè)）中格5（個(gè)）平均值（個(gè)）總數(shù)（個(gè)/mL）對(duì)照斷面（小洲）（稀釋10倍）2012252921225.5×107控制斷面（中大）（稀釋1000倍）2642275819358.75×109削減斷面（商業(yè)北區(qū)）（稀釋100倍）2736332229307.5×108小結(jié)：各斷面細(xì)菌總數(shù)關(guān)系：控制斷面>削減斷面>對(duì)照斷面，說明水體污染程度越高，細(xì)菌總數(shù)越多。4.3 水樣菌落

14、培養(yǎng)觀察（1）對(duì)照斷面（小洲村）：水樣菌落培養(yǎng)基照片:說明：由于倒平板時(shí)水樣擴(kuò)散不均勻，所以恒溫培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基分離出來的菌落大多呈片狀生長，分離出來的純種菌落數(shù)目較少。4個(gè)培養(yǎng)基都有一定的臭味，以原水樣培養(yǎng)基的臭味最濃；不同稀釋濃度分離出的純種菌落差異不大，下面挑選一些特征比較明顯的菌落描述：特征編號(hào)菌落大小菌落形狀菌落顏色邊緣特征縱剖面特征表面（粗糙/光滑）菌落一中等粒狀成團(tuán)乳黃色不規(guī)則邊緣波浪粗糙菌落二較大半球形乳黃色規(guī)則，圓滑邊緣圓滑，高突起光滑（2）控制斷面（中大）：水樣菌落培養(yǎng)基照片:說明：4個(gè)培養(yǎng)基都有一定的臭味，以原水樣培養(yǎng)基的臭味最濃。由于水樣擴(kuò)散不均，原水樣和10倍稀釋度的水樣

15、菌落呈片狀生長，沒有分理出純種菌落。100倍和1000倍稀釋度的水樣分離出的純種菌落種類比較多，大小差異也比較大，下面挑選一些特征比較明顯的菌落描述：特征編號(hào)菌落大小菌落形狀菌落顏色邊緣特征縱剖面特征表面（粗糙/光滑）菌落一較大針狀成團(tuán)乳黃色不規(guī)則有小突起粗糙菌落二較大半球狀乳黃色規(guī)則隆起光滑菌落三較小球狀黃色透明規(guī)則隆起光滑菌落四較小球狀白色規(guī)則隆起光滑（3）削減斷面（商業(yè)北區(qū)）：水樣菌落培養(yǎng)基照片:說明：本組培養(yǎng)基的水樣培養(yǎng)的比較好，有明顯的純種菌落獨(dú)立分離出來。4個(gè)培養(yǎng)基都有一定的臭味，以原水樣培養(yǎng)基的臭味最濃。隨著稀釋倍數(shù)的增大，培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目也不斷增加，各菌落的差異性也比較大，下

16、面挑選一些特征比較明顯的菌落描述：特征編號(hào)菌落大小菌落形狀菌落顏色邊緣特征縱剖面特征表面（粗糙/光滑）其他菌落一較大圓形白色規(guī)則扁平光滑/菌落二較大圓形黃色規(guī)則扁平光滑中間有下凹點(diǎn)，枚紅色菌落三中等球狀乳黃色規(guī)則隆起光滑/菌落三較小球狀黃色規(guī)則隆起光滑中間有一個(gè)枚紅色的下凹點(diǎn)4.4 水樣菌落數(shù)的計(jì)算：不同稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)/個(gè)菌落總數(shù)/（CFU/mL）報(bào)告方式/(CFU/mL)10倍100倍1000倍對(duì)照斷面（小洲）無法計(jì)算32無法計(jì)算32003.2×103控制斷面（中大）無法計(jì)算無法計(jì)算1861860001.9×105削減斷面（商業(yè)北區(qū)）無法計(jì)算11430207002.1&

17、#215;104小結(jié)：隨著斷面污染程度的增加，培養(yǎng)基的菌落數(shù)目也隨之增多。說明水體污染程度在一定程度上影響了水中微生物的數(shù)量與種類。4.5 微生物個(gè)體菌種形態(tài)的觀察在三個(gè)水樣的培養(yǎng)基中分別選出3個(gè)純種菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察，結(jié)果如下表所示：（1）對(duì)照斷面（小洲）：細(xì)菌形態(tài)細(xì)菌顏色G+ /G-細(xì)菌圖片菌落一鏈桿狀紫紅色革蘭氏陰性菌落二圓形紫藍(lán)色革蘭氏陽性菌落三圓形紫紅色革蘭氏陰性（2）控制斷面（中大）：細(xì)菌形態(tài)細(xì)菌顏色G+ /G-細(xì)菌圖片菌落一長桿狀紫紅色革蘭氏陰性菌落二圓形紫藍(lán)色革蘭氏陽性菌落三/紫藍(lán)色革蘭氏陽性（3）削減斷面（商業(yè)北區(qū)）：細(xì)菌形態(tài)細(xì)菌顏色G+ /G-細(xì)菌圖片菌落一短桿狀紫藍(lán)色

18、革蘭氏陽性菌落三/紫藍(lán)色革蘭氏陽性5. 實(shí)驗(yàn)分析5.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析各斷面的水體污染程度不同，其外觀、微生物種類與數(shù)量、細(xì)菌總數(shù)、菌落種類與數(shù)量等各種參數(shù)都有明顯的差異。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，控制斷面的水體由于污染源來源最多，污染程度最深，因此各參數(shù)也最高；對(duì)照斷面的水體污染程度最輕，因此各參數(shù)最低；削減斷面由于河流本身的自凈作用以及污染物的擴(kuò)散減少，相對(duì)污染程度比控制斷面低，各參數(shù)較之控制斷面都明顯降低。（1）查看資料可知,線蟲是水體凈化程度差的指示生物；鐘蟲、輪蟲、苔蘚蟲都要求較高的溶解氧量，是污水生物處理效果好的指示生物；而胞囊是原生動(dòng)物抵抗不良環(huán)境的休眠體。通過對(duì)水樣的觀察，發(fā)現(xiàn)三種水樣中的

19、原生動(dòng)物種類都差不多，無法通過原生動(dòng)物的種類看出三種水樣分別位于河流的哪一個(gè)位置。（2）同一水樣，不同稀釋倍數(shù)所培養(yǎng)的細(xì)菌種類各異，大小各異。雖隨著稀釋倍數(shù)的增加，菌落種類有減少，但無規(guī)律變化，菌落總數(shù)無較大區(qū)別。不同水樣，細(xì)菌總數(shù)有明顯的差異，所培養(yǎng)的菌落總數(shù)稍有差異，菌落種類也各有差異，水樣三最多，水樣二次之，水樣三最少，但最后經(jīng)染色觀察，不同水樣中的微生物形態(tài)無較大差異。造成的原因可能是水樣不具代表性，或是實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)，具體敘述如下。5.2 實(shí)驗(yàn)存在問題（1）水樣采集：由于實(shí)驗(yàn)條件有限，因此各斷面水樣只能在岸邊水面采集，采樣地點(diǎn)位置不精準(zhǔn)，因此水樣代表性不夠高。（2）水樣觀察：由于水樣是

20、水面采集，所以在顯微鏡下觀察到的微生物只有一些藻類，水體中比較常見的一些微生物無法看到。（3）細(xì)菌總數(shù)：由于水樣不均勻，進(jìn)行水體細(xì)菌總數(shù)計(jì)算時(shí)，往往會(huì)有一些沉淀、大顆粒干擾試驗(yàn)觀察計(jì)數(shù)。（4）微生物培養(yǎng)：稀釋水樣時(shí)沒有使用滅菌的無菌水，直接使用去離子水，破壞了無菌環(huán)境，給實(shí)驗(yàn)帶來了較大誤差。而且培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)時(shí)，沒有倒置培養(yǎng)基，導(dǎo)致大部分培養(yǎng)基出現(xiàn)積水問題，沒能分離出純種菌落。（5）革蘭氏染色：部分菌種在革蘭氏染色時(shí)不夠均勻，無法看出菌種的具體形態(tài)。而且當(dāng)脫色不完全時(shí)，整個(gè)視野都呈紫色，連細(xì)菌也找不到。（6）菌落種類和特征：三個(gè)斷面的水體污染程度不同，理論上培養(yǎng)出來的菌落種類以及數(shù)量應(yīng)該有明顯

21、的差別。但是由于實(shí)驗(yàn)操作比較粗糙，所以三個(gè)水樣培養(yǎng)出的菌落形態(tài)并沒有明顯的區(qū)別，而且革蘭氏染色時(shí)觀察到的細(xì)菌形態(tài)也沒有明顯的差別。5.3 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)意見（1） 改善取水條件，增加設(shè)備采樣。（2） 顯微鏡觀察前充分搖勻水樣，以便觀察結(jié)果更具代表性。（3）提高無菌操作精度，使用無菌水作稀釋水。（4）恒溫培養(yǎng)要嚴(yán)格倒置培養(yǎng)基，因此要等水樣在培養(yǎng)基上風(fēng)干再倒置在培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（5）革蘭氏染色要嚴(yán)格按步驟執(zhí)行，每次脫色要完全，使每個(gè)涂片可以清晰分辨細(xì)菌形態(tài)顏色。6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論本實(shí)驗(yàn)對(duì)官洲河段三個(gè)斷面的水體進(jìn)行分析比較，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，水體污染程度：控制斷面>削減斷面>對(duì)照斷面。同時(shí)，隨著污染程度的不同，各水體的微生物群落分布也有差異，表