基礎(chǔ)生物學實驗(三)_基礎(chǔ)生物學實驗(安徽大學生物研究生復試,生命科學學院)

1、實驗一實驗一 糖類的糖類的定量定量測定測定實驗二實驗二 紙層析法分析氨基酸紙層析法分析氨基酸實驗三實驗三 血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳實驗四實驗四 酵母酵母RNARNA的提取及含量測定的提取及含量測定實驗五實驗五 外界因素對酶活性的影響外界因素對酶活性的影響實驗六實驗六 碘滴定法測定抗壞血酸碘滴定法測定抗壞血酸 二、實驗原理二、實驗原理 本實驗以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中含有清蛋白、a一球蛋白、一球蛋白、一球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點及形狀不同，在電場中遷移速度不同。分子量小、等電點低，在相同堿性pH緩沖

2、體系中，帶負電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場中遷移速度快。例如，以醋酸纖維薄膜為支持物，正常人血清在pH86的緩沖體系中電泳1 h左右，染色后可顯示5條區(qū)帶。清蛋白泳動最快，其余依次為1-、2-、-、-球蛋白。這些區(qū)帶經(jīng)洗脫后可用分光光度法定量，也可直接進行光吸收掃描，自動繪出區(qū)帶吸收峰及相對百分比，臨床醫(yī)學常用它們間相對百分比的改變或異常區(qū)帶的出現(xiàn)作為臨床鑒別診斷的依據(jù)。 圖112 醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置示意圖 虛線處為點樣位置圖ll一1 正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖 1為清蛋白；2，3，4，5分別為1-，2-，-及-球蛋白；6為點樣原點 此法由于操作簡單快速、分辨率高及重復性好等優(yōu)點，

3、目前已成為臨床生化檢驗的常規(guī)操作之一。它不僅可用于分離血清蛋白，還可用于分離脂蛋白、血紅蛋白及同工酶的分離測定。 （二）點樣 1.制備點樣模板 取一張干凈濾紙(10 cm10 cm)，在距紙邊1.5 cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點樣標志區(qū)。 2.點樣 用竹夾子取出薄膜，將無光澤面向上平放在濾紙上。點樣區(qū)距陰極端1.5 cm處，點樣時，先用玻璃棒或血色素吸管取23 ml血清，均勻涂在點樣器表面(該點樣器是由載玻片一端磨成具有斜面而成，再將點樣器輕輕印在點樣區(qū)內(nèi)，如圖2所示，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細均勻的直線。此步是實驗的關(guān)鍵，點樣前應(yīng)在濾紙上反復練習，掌握點樣技術(shù)后再正式點樣

4、是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)。 五、實驗建議 (1)醋酸纖維素薄膜的預處理 市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。為防止指紋污染，取膜時應(yīng)戴指套或用夾子。所選薄膜應(yīng)厚薄均勻，否則應(yīng)棄去不用，以免造成電泳區(qū)帶扭曲，界線不清，背景脫色困難，結(jié)果難以重復。由于薄膜吸水性比紙小，浸泡30 min以上是保證膜片上有一定量緩沖液，并使其恢復到原來多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，最好讓薄膜吸滿緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上聚集的小泡趕走。點樣時薄膜上的緩沖液不宜太多，但也不能太干。 (2)緩沖液的選擇 本實驗常用的pH86巴比妥緩沖液，其濃度為005O09 molL。選用何種濃度與

5、樣品及薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快，并由于擴散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨。 六、實驗報告及作業(yè) 1根據(jù)人血清中血清蛋白各組分等電點，如何估計它們在 pH86的巴比妥一巴比妥鈉電極緩沖液中移動的相對位置? 2.簡述醋酸纖維素薄膜電泳原理及優(yōu)點。 3.繪出酸纖維素薄膜電泳結(jié)果。 4.造成電泳圖譜不整齊的原因有哪些？ 三、實驗操作三、實驗操作 ( (一一)RNA)RNA的提取的提取 稱5g干酵母粉于150 ml三角燒瓶中，加30ml O.2的 NaOH，沸水浴中攪拌提取30 min。冷卻后滴加乙酸使其略偏酸性。離心(4000 rmin，15

6、 min)，去除沉淀。向上清液中加入30 ml95乙醇，稍攪拌后靜置。待完全沉淀后離心(4000 rmin，15 min) ，去上清液。沉淀加10 ml 95乙醇，攪拌后再次離心。沉淀再依次用10 ml的無水乙醇、乙醚(2)洗滌。稱重，計算RNA的初步得率（a)。 ( (二二)RNA)RNA的鑒定的鑒定 取沉淀約O.2 g，加2 ml 10H2SO4沸水浴中加熱2 min加1.5 ml地衣酚試劑沸水浴中加熱觀察顏色變化。 2. 2.取取6 6支潔凈試管，分別編號后，按表支潔凈試管，分別編號后，按表2 2操作：操作： 表表2 pH2 pH對酶活性的影響對酶活性的影響管管 號號 123456pHp

7、H值值 5.46.2 6.87.0 7.48.0緩沖液量緩沖液量(m1)(m1) 333333含含NaClNaCl的的0.50.5淀粉淀粉(m1)(m1) 222222稀釋稀釋100100倍唾液倍唾液(m1)(m1) 222222充分搖勻充分搖勻 3737保溫，保溫，l minl min后，用滴管從后，用滴管從3 3# #管中吸管中吸l l滴反應(yīng)液，放白瓷板用碘液檢驗滴反應(yīng)液，放白瓷板用碘液檢驗(1(1滴滴) )。以后每隔以后每隔1min1min檢驗一次。當檢驗一次。當3 3# #管反應(yīng)液遇碘液呈淡黃色時，立即向管反應(yīng)液遇碘液呈淡黃色時，立即向6 6支管中加碘支管中加碘液液 碘液碘液( (滴滴) ) 222221充分搖勻充分搖勻?qū)嶒灲Y(jié)果實驗結(jié)果 實驗六實驗六 碘滴定法測定抗壞血酸碘滴定法測定抗壞血酸 一、實