公開課用土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)實用教案

1、1 1、了解尿素、了解尿素 尿素是一種由尿素是一種由C C、H H、O O、N N組成的有機組成的有機化合物，分子式為化合物，分子式為CO(NH2)2CO(NH2)2，它是動物體，它是動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物，在肝臟內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物，在肝臟(gnzng)(gnzng)中合成后，隨尿液排出。中合成后，隨尿液排出。 1828 1828年，德國化學(xué)家維勒成功通過年，德國化學(xué)家維勒成功通過無機物的化學(xué)反應(yīng)合成了尿素。此后，尿無機物的化學(xué)反應(yīng)合成了尿素。此后，尿素走向工業(yè)化并廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。素走向工業(yè)化并廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。 課題(kt)背景第1頁/共25頁第一頁，共26頁。 課題(kt)背景2、尿素

2、(nio s)的利用3、細菌能分解尿素的原因直接原因：能合成脲酶（分解尿素的酶）根本原因：具有合成脲酶相關(guān)的基因第2頁/共25頁第二頁，共26頁。 課題(kt)目的第3頁/共25頁第三頁，共26頁。說明：尋找目的(md)菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。1966年，布魯克在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現(xiàn)了耐熱的Taq細菌，并分離到耐高溫的DNA聚合酶。一、篩選菌株耐高溫的酶耐高溫生物體耐高溫環(huán)境（熱泉、火山口）尋找尋找第4頁/共25頁第四頁，共26頁。2

3、、方法(fngf)：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制(yzh)或阻止其他微生物生長。1、原理：根據(jù)原理， 培養(yǎng)基應(yīng)如何配制，才能將分解尿素的細菌分離出來？利用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基進行篩選第5頁/共25頁第五頁，共26頁。第6頁/共25頁第六頁，共26頁。平板劃線法得到的菌落(jnlu) 稀釋涂布平板法得到的菌落(jnlu)第7頁/共25頁第七頁，共26頁。使用稀釋涂布平板法接種，在稀釋度足夠高的培養(yǎng)使用稀釋涂布平板法接種，在稀釋度足夠高的培養(yǎng)基中，細菌比較分散，容易形成單個菌落。基中，細菌比較分散，容易形成單個菌落。 一個一個(y (y )菌落來源于樣品

4、稀釋液中的一個菌落來源于樣品稀釋液中的一個(y (y )活菌活菌 間接(jin ji)計數(shù)法（活菌計數(shù)法）統(tǒng)計(tngj)菌落數(shù)目每克樣品中的菌株數(shù)=（CV)M C:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)； V:所用稀釋液的體積；M:稀釋倍數(shù)。第8頁/共25頁第八頁，共26頁。注意事項為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行(jnxng)計數(shù)。稀釋(xsh)度是不是越高越好？如果稀釋度過高，菌落數(shù)少于30，計算結(jié)果偏低，誤差大；如果稀釋度過低，菌落數(shù)超過(chogu)300，統(tǒng)計和計算結(jié)果都會有誤差；恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒y(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。第9頁/共25頁第九頁，共26頁。 兩位同學(xué)

5、用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。 2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。 你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法(zu f)正確嗎？如果有問題，錯在哪？ 甲：沒有重復(fù)實驗（至少(zhsho)涂布3個平板） 乙：其中一個平板計數(shù)結(jié)果與其他兩個相差太大，操作過程可能出現(xiàn)了錯誤。資料(zlio)分析：第10頁/共25頁第十頁，共26頁。注意事項為增強實驗說服力與準(zhǔn)確性，設(shè)計實驗時，需要涂布

6、至少三個平板作為重復(fù)組。分析實驗結(jié)果時，要考慮(kol)重復(fù)組結(jié)果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。為防止培養(yǎng)時間不足導(dǎo)致菌落遺漏，在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)，選取菌落數(shù)穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌實際數(shù)目低。因為當(dāng)兩個或多個細胞連在一起時，繁殖后形成(xngchng)的還是一個菌落第11頁/共25頁第十一頁，共26頁。第12頁/共25頁第十二頁，共26頁。三、設(shè)置(shzh)對照1、目的： 排除(pich)實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。 對照實驗是指除了 被測試 的條件外，其他條件都 相同 的實驗。第13頁/共25頁第

7、十三頁，共26頁。 利用選擇培養(yǎng)基進行尿素分解菌的分離過程(guchng)中，從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，A、B兩同學(xué)分別得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1、A同學(xué)篩選出150個菌落。 2、B同學(xué)篩選出50個菌落。 B認(rèn)為A的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細菌也能在該培養(yǎng)基中生長。A確認(rèn)自己的操作無誤，不同的原因是自己所用的土壤樣品與其他同學(xué)不同，但由于自己在實驗時未設(shè)置對照，因此也拿不出能令人信服的證據(jù)。請你幫助A同學(xué)改進實驗，提供具有說明了的證據(jù)。資料(zlio)分析：第14頁/共25頁第十四頁，共26頁。小結(jié)：通過(tnggu)這個事例可以看出，實

8、驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案(fng n)一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進行實驗 方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)(piyng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)(piyng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)(piyng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明是土樣不同引起；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)的操作有誤。土樣不同操作有誤導(dǎo)致培養(yǎng)基被污染第15頁/共25頁第十五頁，共26頁。.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第16頁/共25頁第十六頁，共26頁。第17頁/共25頁第十七頁，共26頁。為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中

9、能分解尿素的細菌的數(shù)量(shling)，選用的稀釋范圍相同嗎？第18頁/共25頁第十八頁，共26頁。實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明(zh mn)培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)(j sh)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。第19頁/共25頁第十九頁，共26頁。第20頁/共25頁第二十頁，共26頁。第21頁/共25頁第二十一頁，共26頁。第22頁/共25頁第二十二頁，共26頁。利用尿素作為唯一(wi y)氮源的培養(yǎng)基分離出的微生物都是能分解尿素的微生物

10、嗎？思考(sko)： 不一定。因為有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物(chnw)進行生長繁殖。第23頁/共25頁第二十三頁，共26頁。 課題(kt)延伸：鑒定菌株原理：產(chǎn)脲酶的細菌將尿素分解成氨，培養(yǎng)基PH會升高，通過檢測培養(yǎng)基PH變化(binhu)來判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。方法：在以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)該細菌，如果(rgu) PH升高，指示劑變紅，可以初步鑒定該種菌能分解尿素。第24頁/共25頁第二十四頁，共26頁。感謝您的觀看(gunkn)！第25頁/共25頁第二十五頁，共26頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)1、了解(lioji)尿素。篩選原因：因為熱泉的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，使耐熱的Taq細菌保留下來。