常規(guī)反相分析方法開發(fā)的流程

1、.1.回顧樣品信息樣品的分子量、 pka、酸堿性流動相需要緩沖鹽嗎？酸性、堿性化合物需要加緩沖鹽來控制流動相pH樣品需要預(yù)處理嗎？有損壞色譜柱的、干擾檢測的成分則預(yù)處理2.明確分離目標足夠的分離度、最短的分離時間、精確度等3.展開起始的分色譜柱：100mm*4.6mm*3um ， C18 或者C8（或者其他大小離和內(nèi)徑）流速：2ml/min柱溫：30或 35流動相：樣品不含酸和乙腈和水堿：流動相：樣品含酸和堿：根據(jù)樣品 pka 選擇流動相的 pH（流動相的 pH 在樣乙 腈 和 （ pH2.5-3.0） 品的 pka± 1.5 的外），根據(jù)流動相pH 選擇緩沖液，（10-25mmol

2、/l ）緩沖鹽盡量選擇 pka 與流動相的 pH 相等的緩沖鹽， 濃度經(jīng)常為 5-50mmol/l 。磷酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽都是在pH 小于 8 時最常用的緩沖液。梯度： 10 分鐘內(nèi) 5%100%B3.1.遇到的問題：4 優(yōu)化梯度色保留因子 k5.優(yōu)化梯度選擇性5.1：加入步驟 5 的分離度 2，或者需要增短時間6.調(diào)整梯度范圍和形狀,.過早洗脫（說明可以減少起始的 %B或者使用起始梯度停留樣品的極性大，離子化的酸或改變流動相的 pH 增強他們的保留（減少分子的離子化）堿）在流動相中加入離子對試劑使用正相色譜或者HILIC過遲洗脫（樣品使用親酯性較弱的色譜柱（降低H 值，見附件 1）的極性很

3、?。┦褂谜嗌V復(fù)雜的樣品 （樣如果都是目標化合物，可使用2D 色譜品大于 15 種成幾個化合物是目標成分：樣品先預(yù)處理分）起始的分離條件對于大多是小分子樣品（分子量 1000）一般能使 k 值大約為5梯度時間和柱建議第二個方法將梯度時間延長2-3 倍，在沒有分開的情況溫是首選。下可以進一步延長時間獲證增加柱溫為50用甲醇替代乙腈重復(fù)步驟1-4更換色譜柱重復(fù)步驟1-4考慮使用分段梯度A:考慮最佳的起始和最終的 %B 值，從而在分離度 Rs 合理的前提下實現(xiàn)最短的實驗時間B:對于“較臟的”的樣品，加入坡度較大的梯度分段至100%B（例如在5min至 100%B，維持 3-5min 等）C:加入坡

4、度較大的梯度分段來加速色譜圖后端的、間隔較寬的色譜圖峰的洗脫D:加入的等度度停留從而改善梯度前洗脫出來的色譜峰之間的分離度使保留因子定。.7.以步驟 5、6 中獲得的最佳的分離效果為基礎(chǔ)，平衡分離度和運行時間改 善 色 譜 柱 的色譜柱的大小、粒徑、條件流速、樣品的分子量運能影響色譜柱的塔板數(shù)。粒徑和色譜柱的大小通常在方法建立之前已選好。增長色譜柱的長度通常能增加塔板數(shù)、分離度、 實驗時間。在梯度洗脫中， 使tgF/L 保持恒定，從而K*保持恒保留因子K：tg:梯度時間 ； F：流速 ； Vm：死體積 ； ? ：梯度范圍 ； S：分子量在 100-500Da 的樣品 S 值為4 。8.測量連續(xù)的陽以上面選好的一般使用 10 個或者以上的色譜柱體積的其實流動相來平衡陽機那樣之間，實驗條件開展色譜柱（約等于 10 乘死時間的體