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文檔簡介
1、精選學(xué)習(xí)資料 - - - 歡迎下載一. 基因工程( dna 重組技術(shù) ):體外.定向.分子水平基本工具: 限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)來自原核 細(xì)胞,識別 雙鏈 dna分子的某種特定的核苷酸序列,使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間 的磷酸二酯鍵 斷開;dna連接酶 : e· colidna 連接酶 (只 黏性末端)t4dna連接酶 (黏.平 末端也可但效率低)載體 :質(zhì)粒.入菌體的衍生物.動植物病毒條件:能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)固存在復(fù)制表達(dá)一種或多種限制酶切點(diǎn)標(biāo)記基因(抗生素抗性基因.熒光基因)基本操作程序:1.目的基因的獵?。海?人工合成.體內(nèi)提?。幕蛭膸飓C取基因組文庫e.g.cdn
2、a 文庫(部分基因文庫)大小大小啟動子有無內(nèi)含子有無基因數(shù)目某種生物全部基因部分基因(基因挑選性表達(dá))物種間基因溝通部分可以可以( mrna逆轉(zhuǎn)錄)pcr技術(shù)擴(kuò)增目的基因:模板 .taq 酶(熱穩(wěn)固 dna聚合酶). 原料 &能量 (dxtp). 引物 (過量)五物混合,加熱至9095 ,dna解旋,冷卻到5560,引物與互補(bǔ)dna鏈結(jié)合,加熱至7075 ,taq 酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成人工化學(xué)合成:基因比較小,核苷酸序列已知2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建:(基因工程的核心)啟動子 : dna片段,基因的首端,rna聚合酶識別和結(jié)合的部位 目的基因終止子 : dna片段 ,基因的尾端標(biāo)記基因
3、:鑒別受體細(xì)胞中為否含有外源基因,從而將含有外源基因的細(xì)胞挑選出來;(復(fù)制原點(diǎn):僅自我復(fù)制的需要,整合到宿主染色體上再表達(dá)的不需要)3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞:轉(zhuǎn)化:為目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并且在受體細(xì)胞內(nèi)維護(hù)穩(wěn)固和表達(dá)的過程;(1)導(dǎo)入植物細(xì)胞(體細(xì)胞.受精卵)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 (雙子葉植物.裸子植物)受損,傷口細(xì)胞分泌酚類化合物 ,吸引農(nóng)桿菌移向,ti 質(zhì)粒 上 t-dna(上插目的基因)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞整合到受體細(xì)胞染色體上基因槍法 (單子葉植物)花粉管通道法(2)導(dǎo)入動物細(xì)胞(受精卵)顯微注射技術(shù)(3)導(dǎo)入微生物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn):繁衍快.多為單細(xì)胞.遺傳物質(zhì)相對較少.對人體無害(大腸桿菌)步驟:
4、ca2+ 處理細(xì)胞,使其成為感受態(tài)細(xì)胞 ,重組表達(dá)載體dna分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在肯定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸取dna分子4.目的基因的檢測與鑒定:dna分子雜交技術(shù) :轉(zhuǎn)基因生物的染色體dna上為否插入了目的基因(目的基因為否進(jìn)入原核細(xì)胞)轉(zhuǎn)基因生物的染色體dna(原核質(zhì)粒) +有同位素標(biāo)記的目的基因rna分子雜交技術(shù) :目的基因為否轉(zhuǎn)錄出了mrna轉(zhuǎn)基因生物的mrna有+ 同位素標(biāo)記的目的基因抗原抗體雜交:目的基因為否翻譯成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì)+相應(yīng)的抗體個體生物學(xué)水平的鑒定:抗蟲抗病的接種試驗精品學(xué)習(xí)資料精選學(xué)習(xí)資料 - - - 歡迎下載二.蛋白質(zhì)工程(自然界不存在的蛋
5、白質(zhì))預(yù)期蛋白質(zhì)功能,設(shè)計蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),估計氨基酸序列,找對應(yīng)的脫氧核苷酸序列,人工合成基因,基因工程,蛋白質(zhì)產(chǎn)品三.細(xì)胞工程:(一)植物細(xì)胞工程:1.植物組織培育技術(shù):(1)原理:植物體細(xì)胞的全能性(2)過程:離體的植物器官.組織或細(xì)胞,脫分化 (避光), 愈傷組織 (未分化,薄壁細(xì)胞),再分化 ,根芽,細(xì)胞分裂分化,植株(3)條件: 無菌 (防止微生物污染) 養(yǎng)分 (無機(jī)鹽.有機(jī)物.水)激素 (生長素.細(xì)胞分裂素,=1 誘導(dǎo)脫分化, >1 生根, <1 生芽,激素杠桿)離體2.植物體細(xì)胞雜交技術(shù):克服生殖隔離(不同生物遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙)(二)動物細(xì)胞工程:1.動物細(xì)胞培育 :
6、(1)原理:一些動物細(xì)胞在體外可生長增殖(2)過程:動物組織塊,剪碎,胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理,分散成單個細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液原代培育 :轉(zhuǎn)入培育瓶, 細(xì)胞貼壁 (培育瓶內(nèi)壁光滑無毒易于貼附),細(xì)胞有絲分裂,接觸抑制胰蛋白酶 處理分瓶連續(xù) 傳代培育 (10 代以內(nèi)以保持正常的二倍體核型,50 代以上癌細(xì)胞)(3)條件:無菌無毒的環(huán)境:用具無菌處理;培育液中加抗生素 ; 定期更換培育液(清除代謝產(chǎn)物,防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物積存對細(xì)胞自身造成危害)養(yǎng)分:糖.氨基酸.促生長因子.無機(jī)鹽.微量元素.血清血漿溫度和 ph:動物體溫(哺乳36+ -0.5), ph=7.2-7.4氣體環(huán)境: 95%空氣 +5%co
7、(2 維護(hù)培育液ph)2.動物體細(xì)胞核移植技術(shù)(克隆動物) 胚胎細(xì)胞核移植 (易)移入去核卵母細(xì)胞精品學(xué)習(xí)資料精選學(xué)習(xí)資料 - - - 歡迎下載3.動物細(xì)胞融合 (細(xì)胞雜交):除物理化學(xué)法外,仍可用滅活的病毒 誘導(dǎo)4.雜交瘤技術(shù)(生產(chǎn)單克隆抗體 )(1)傳統(tǒng)方法:向動物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原,產(chǎn)生抗體后從血清中分別,抗體產(chǎn)量低純度低特異性差(2)單克隆抗體優(yōu)點(diǎn):特異性強(qiáng),靈敏度高,并能大量制備四.胚胎工程:早期胚胎或配子水平(一)體內(nèi)受精和早期胚胎發(fā)育:1.精子的發(fā)生:睪丸的曲細(xì)精管內(nèi),初情期開頭變形:細(xì)胞核 精子頭,高爾基體 頂體,中心體 尾,線粒體 尾的基部的線粒體鞘,其他物質(zhì) 原生質(zhì)滴向后
8、脫落2.卵子的發(fā)生:卵巢及輸卵管胎兒性別分化后:卵原細(xì)胞有絲分裂,并變成初級卵母細(xì)胞,被卵泡細(xì)胞包圍形成卵泡卵泡的形成和在卵巢內(nèi)的儲備在誕生前(胎兒時期完成)初情期后:初級卵母細(xì)胞次級卵母細(xì)胞和第一極體減二中期停卵子.極體馬狗排卵豬牛羊排卵受精卵子為否受精的標(biāo)志:卵黃膜和透亮帶的間隙可以觀看到兩個極體3.受精:輸卵管內(nèi)完成(1)精子獲能(2)卵子的預(yù)備:達(dá)到減數(shù)其次次分裂中期(3)受精:頂體反應(yīng) ,釋放頂體內(nèi)酶,溶解卵丘細(xì)胞之間 的物質(zhì),穿越放射冠.透亮帶,(精子觸及卵黃膜的瞬時)透亮帶反應(yīng) ,精子外膜和卵黃膜相互融合(標(biāo)志著精子入卵) ,卵黃膜的封閉作用& 精子尾部脫離形成雄原核,卵
9、子減二完成,排出其次極體,形成雌原核,比雄原核小,核融合(標(biāo)志受精卵的產(chǎn)生)防止多精入卵 :透亮帶反應(yīng)卵黃膜的封閉作用4.胚胎發(fā)育:卵裂期(透亮帶內(nèi),有絲分裂,胚胎的總體體積并不增加,或略有減小)(1)桑椹胚 :細(xì)胞數(shù)目32 個,全能細(xì)胞(2)囊胚:開頭顯現(xiàn)分化,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(胎兒);囊胚腔;滋養(yǎng)層細(xì)胞(胎膜胎盤)孵化:透亮帶破裂,胚胎舒展出來(3)原腸胚 :內(nèi)細(xì)胞團(tuán)外胚層.內(nèi)胚層.中胚層,原腸腔(二)體外:1.體外受精 :(1)卵母細(xì)胞的采集:試驗動物.豬.羊 促性腺激素 處理 超數(shù)排卵 ,輸卵管中沖取大牛:屠宰母畜的卵巢中采集卵母細(xì)胞;活體動物的卵巢中吸取卵母細(xì)胞人工培育至減二中期精品學(xué)習(xí)資料
10、精選學(xué)習(xí)資料 - - - 歡迎下載(2)精子的采集和獲能:假陰道法.手握法.電刺激法獲能處理 :培育法(人工配制的獲能液);化學(xué)誘導(dǎo)法(肯定濃度的肝素或鈣離子載體溶液)(3)受精:獲能溶液或?qū)S玫氖芫芤?.胚胎的早期培育:無機(jī)鹽.有機(jī)鹽.維生素.激素.氨基酸.核苷酸.血清向受體移植或冷凍儲存3.胚胎移植:(1)意義:充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個體的繁衍才能;大大縮短了供體本身的繁衍周期;良種畜群快速擴(kuò)大,加速了育種工作和品種改良;不受時間地域限制,節(jié)約購買種畜費(fèi)用;胚胎冷凍儲存品種資源和瀕危物種(2)基本程序:對供. 受體的挑選和處理;挑選 遺傳特性和生產(chǎn)性能優(yōu)秀的供體,有健康的體質(zhì)和正常繁衍才能的受
11、體,供體和受體為 同一物種 ;并用 激素 進(jìn)行同期發(fā)情處理,用促性腺激素對供體母牛做超數(shù)排卵處理;同種優(yōu)秀公牛配種或人工授精;把供體母牛子宮內(nèi)的胚胎沖洗出來 沖卵 ,胚胎進(jìn)行質(zhì)量檢查,向受體移植或放入液氮中儲存;對受體母牛進(jìn)行為否妊娠的檢查;(3)生理學(xué)基礎(chǔ):同期發(fā)情處理,為供體的胚胎移入受體供應(yīng)了相同的生理環(huán)境;早期胚胎在肯定時間內(nèi)處于游離狀態(tài),不與母體子宮建立組織上聯(lián)系,可以胚胎收集;受體對移入子宮的外來胚胎不發(fā)生免疫排斥反應(yīng),胚胎可以在受體的存活;供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯(lián)系,但遺傳特性在孕育過程中不受影響;4.胚胎分割 :實體顯微鏡.顯微操作儀發(fā)育良好,形狀正常的桑椹胚或囊胚 (內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割)5.胚胎干細(xì)胞 (es或 ek細(xì)胞 )
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