平邑甜茶幼苗NO3-吸收及利用特性對供磷水平的響應

1、平邑甜茶幼苗NO3-吸收及利用特性對供磷水平的響應季萌萌1，陳汝2，安欣1，文炤1，姜遠茂1*（1.山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018 ；2.山東省果樹研究所，山東泰安 271000 ）摘要：【目的】研究平邑甜茶幼苗NO3-N吸收和利用特性對不同供磷水平的響應機制，旨在從氮素吸收的角度挖掘影響氮肥利用率低的關(guān)鍵因素，從而為果園科學、高效利用養(yǎng)分提供理論依據(jù)，進而提高氮肥利用效率；【方法】本試驗運用15N示蹤技術(shù)，并借助非損傷掃描離子選擇電極，測定了不同供磷水平下平邑甜茶的氮素吸收和利用情況；【結(jié)果】在低磷水平（0-1.0mmol·L-1）

2、時，平邑甜茶根系長度、根系總表面積較小，且根尖數(shù)較少，此時平邑甜茶各器官Ndff均處于較低水平；隨著供磷水平的增加，在2.0-4.0mmol·L-1時，平邑甜茶根系生長迅速，其根系長度、表面積及根尖數(shù)量均有顯著增加，且達到最高水平，各器官Ndff較之前也有明顯增加；隨后，在6.0-16.0mmol·L-1時，由于過量供磷抑制了根系的生長，使平邑甜茶幼苗根系長度、表面積均有大幅降低，根尖數(shù)量驟降，平邑甜茶各器官Ndff值維持在一個略低于最大值的水平。當磷濃度在3.0 mmol·L-1 時平邑甜茶對NO3-有強烈吸收，在16.0 mmol·L-1時有明顯外排

3、。平邑甜茶幼苗對硝態(tài)氮的利用效率在磷虧缺處理時較低，而后隨著供磷水平的增加，平邑甜茶幼苗的氮肥利用率顯著增加，在4.0mmol·L-1磷水平時其氮肥利用率達到最大值，但持續(xù)過量供磷反而使平邑甜茶幼苗的氮肥利用率驟然降低；【結(jié)論】平邑甜茶對氮素的吸收受供磷水平影響顯著，其主要是通過影響根系的生長發(fā)揮作用。磷虧缺時氮素吸收和利用受到抑制，適當供磷能夠刺激幼苗根系生長，從而促進平邑甜茶對氮素的獲取，然而過量供磷會抑制平邑甜茶根系的生長，使氮素吸收受到限制。關(guān)鍵詞：蘋果；砧木；磷水平；氮素；吸收；利用Characteristics on the NO3- absorption and uti

4、lization of Malus hupehensis Rehd. seedlings on different phosphorus levelJI Meng-meng1, CHEN Ru2, AN Xin1, WEN Zhao1, JIANG Yuan-mao1*（1.College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/ State Key Laboratory of Crop Biology, Tai an, Shandong 271018, China；2.Shandong

5、 Institute of Pomology, Taian,Shandong 271000, China） Abstract: 【Objective】 In this study, we focused on the NO3-N absorption and utilization of Malus hupehensis Rehd. seedlings on different phosphorus level, aiming to excavate the key factors influencing nitrogen utilization ratio, which provide th

6、eoretical basis for scientific and efficient utilization of the fertilizer in apple orchard.【Method】The 15N tracer technique and non-invasive micro-test technique(NMT) were used to determine the nitrogen absorption and utilization ratio of Malus hupehensis Rehd. seedlings on different phosphorus lev

7、el.【Results】The root length, root surface area and quantity of root tips as well as the Ndff value were very low when the seedlings were grown in phosphorus deficiency environment(0-1.0mmol·L-1), and with the addition of phosphorus application(2.0-4.0mmol·L-1), obvious growth of the seedli

8、ngs can be seen thus the parameters determined above increased significantly. Whereas the root growth was restrained when the seedlings were in excess phosphorus application(6.0-16.0mmol·L-1), and the absorption of nitrogen decreased in consequence. The utilization of nitrogen varied on differe

9、nt phosphorus level: the utilization ratio of phosphorus deficiency treatment was lower than that on normal phosphorus environment, while the nitrogen utilization decreased violently when the phosphorus application was overdose.【Conclusion】The absorption and utilization capacity were restrained when

10、 the seedlings were in phosphorus deficiency environment, while the root growth and nitrogen absorption was promoted with appropriate phosphorus application, whereas with the overdose application of phosphorus, the root growth and nitrogen utilization decreased.Keywords: apple; rootstock; phosphorus

11、 level; nitrogen; absorption; utilization1 引言【研究意義】隨著農(nóng)民肥料投入量的迅速提高，在促進了土壤有機質(zhì)的增長和土壤肥力提高的同時，由于過量施肥造成的地下水硝酸鹽超標和湖泊水體富營養(yǎng)化問題也日趨嚴重1,2。氮、磷肥的過量施用，不僅給環(huán)境造成威脅，也大大影響了土壤質(zhì)量，導致土壤礦質(zhì)養(yǎng)分失調(diào)，加速了土壤有機質(zhì)的分解，造成土壤板結(jié)和地力下降等嚴重問題3,4。因此，如何科學、合理地利用養(yǎng)分，提高肥料的吸收和利用效率，是現(xiàn)代果樹產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵所在?！厩叭搜芯窟M展】磷能夠促進根系對氮素的吸收，丁寧5等研究表明，適當施用磷肥可促進作物對土壤中氮素的吸收，而

12、低磷脅迫顯著降低了作物對于氮素的吸收和積累6,7。袁新民8等研究表明，施用磷肥后，刺激了小麥根系的發(fā)育，進而促進氮素的吸收，另一方面，施磷的增產(chǎn)作用提高了作物對氮素的需求，使作物吸氮量增加，最終降低了土壤中硝酸鹽的累積。Corina Graciano9等研究表明，施磷能夠促進巨桉樹體的干物質(zhì)積累及其對氮、硫的吸收，且施磷處理后樹體吸氮能力增強，器官含氮量較施氮處理明顯增多。磷在植物的氮代謝過程中發(fā)揮重要的作用，研究表明，硝酸還原酶發(fā)揮作用需要NADP+/NADPH作為其電子受體，催化NO3-還原為NO2-10,11，此過程是NO3-還原的限速步驟。非損傷微測技術(shù)（Non-invasive Mi

13、cro-test Technique, NMT）作為一種新型的電生理技術(shù)，能夠在真實生理環(huán)境狀態(tài)下，測定各種進出樣品的分子和離子的濃度、流速和三維運動方向的信息，已廣泛應用于植物生理和發(fā)育的各項研究12,13。駱翔14等利用NMT技術(shù)研究了檉柳根不同區(qū)域的氮素吸收特性發(fā)現(xiàn)，檉柳的根尖、分生區(qū)、伸長區(qū)等部位對NO3-離子有明顯的內(nèi)流趨勢，而對NH4+表現(xiàn)出外排趨勢。【本研究切入點】目前有關(guān)供磷水平對植物氮素吸收、利用的影響的研究主要集中于供磷對氮素吸收以及其向各器官的分配6,7,15，主要側(cè)重于對結(jié)果的闡述，在植物氮素吸收對不同供磷水平的響應機理的研究甚少，且在蘋果砧木上的研究未有報道。【擬解決

14、的關(guān)鍵問題】本試驗借助非損傷掃描離子選擇電極，研究了平邑甜茶幼苗NO3-N吸收和利用特性對不同供磷水平的響應機制，旨在從氮素吸收的角度挖掘不同供磷水平對氮肥利用率的影響機制，從而為果園科學、高效利用養(yǎng)分提供理論依據(jù)，進而提高氮肥利用效率。2 材料與方法2.1 試驗時間、地點本試驗于2014年在山東農(nóng)業(yè)大學園藝試驗站完成，室內(nèi)實驗在國家蘋果工程技術(shù)研究中心實驗室進行。2.2 植物材料以一年生平邑甜茶為試材，于3月上旬將層積好的種子播于穴盤中，正常溫度濕度管理，至幼苗長出45片真葉時，移栽至裝滿石英砂的花盆中，石英砂用前洗凈晾干，移栽后緩苗1周，期間澆灌去離子水，緩苗后先用1/2濃度Hoaglan

15、d營養(yǎng)液澆灌一周，隨后3天澆一次Hoagland營養(yǎng)液（含H2PO4- 1mmol·L-1）。2.3 試驗設(shè)計試驗設(shè)置P0、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8九個磷濃度處理，分別相當于0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0mmol·L-1 KH2PO4，其它營養(yǎng)元素濃度與正常Hoagland營養(yǎng)液相同，待長至7-8片真葉時，每次澆灌營養(yǎng)液時另外加入0.1g Ca15NO3（共施入1g，分10次）用于15N標記。2.4 樣品采集與分析每個處理選取長勢基本一致，無病蟲害的幼苗60株，分成4份。隨機選取15株平邑甜茶幼苗，運用非損傷掃描

16、離子選擇電極測定根尖NO3-離子的吸收/外排速率，試驗在旭月（北京）科技有限公司進行。選取15株幼苗，采集根系和葉片，用于硝酸還原酶活性測定。另外隨機選取15株，將根系和葉片組織磨成勻漿，沸水浴提取30min，定容至25ml容量瓶，脫色過濾后，測定游離NO3-含量，3次重復。剩余樣品整株取樣，每個重復5株，分出根、莖、葉三部分，經(jīng)清水沖洗后用WinRHIZO 根系分析軟件進行根總表面積、根系總長度分析，然后置于 105 殺青30 min，80 烘干至恒重，稱量各器官的干物質(zhì)量，隨后用不銹鋼電磨粉碎，過0.25 mm篩后測定各器官15N豐度和器官全氮量。全氮用凱氏定氮法測定，15N豐度在中國農(nóng)業(yè)

17、科學院原子能利用研究所用MAT-251質(zhì)譜儀測定。2.5 數(shù)據(jù)處理Ndff =（植物樣品中15N豐度%自然豐度%）/（肥料中15N豐度%自然豐度%）×100%氮肥利用率=Ndff×器官全氮量（g）/施肥量（g）×100%用Microsoft Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)單因素試驗統(tǒng)計分析方法進行顯著性和相關(guān)性分析，多重比較采用LSD法。3 結(jié)果與分析3.1 不同供磷水平下平邑甜茶的生物量由表1可知，不同供磷處理，平邑甜茶各器官生物量均呈現(xiàn)出葉>根>莖的趨勢，在磷虧缺處理時生物量最低，其根、莖、葉生物量分別為0.17g、0.12

18、g、0.28g；且在1.0-3.0mmol·L-1磷水平時，平邑甜茶根、莖、葉生物量以及總生物量均隨著磷濃度增加顯著增大，至3.0mmol·L-1處理時最大（根、莖、葉生物量分別為0.93g、0.60g、1.47g），之后隨著磷濃度的遞增，呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢，在6.0-16.0mmol·L-1磷水平下，其生物量基本維持在一個比較穩(wěn)定的水平。表1 不同供磷水平下平邑甜茶的各器官生物量Table 1 Biomass of Malus hupehensis Rehd. seedlings on different phosphorus levelH2PO4-mmol&

19、#183;L-1根生物量（g）Biomass of root（g）莖生物量（g）Biomass of stem（g）葉生物量（g）Biomass of leaf（g）總生物量（g）Total biomass（g）00.17±0.02g0.12±0.03f0.28±0.02h0.57±0.03g1.00.64±0.01de0.32±0.02d0.71±0.02g1.66±0.02f2.00.90±0.03ab0.55±0.04b1.17±0.02c2.63±0.06b3.00.

20、93±0.04a0.60±0.03a1.47±0.01a3.00±0.02a4.00.88±0.01b0.52±0.02b1.28±0.02b2.68±0.01b6.00.66±0.02d0.34±0.01d0.85±0.03ef1.86±0.04d8.00.74±0.04c0.42±0.02c0.99±0.03d2.15±0.04c12.00.56±0.03f0.25±0.01e0.83±0.05f1.6

21、4±0.08f16.00.59±0.03ef0.26±0.02e0.89±0.03e1.74±0.05e注（Note）：同一列小寫字母表示差異達0.05顯著水平Values followed by a lowercase within the same column are significantly different at the 0.05 level.3.2 平邑甜茶NO3-吸收特性對供磷水平的響應3.2.1 不同供磷水平下NO3-的吸收速率平邑甜茶幼苗根系對NO3-的吸收受供磷水平影響較大，不同磷水平下其吸收能力差異顯著。非損傷掃描離子

22、選擇電極測試表明，當磷濃度在3.0-6.0 mmol·L-1時，平邑甜茶對NO3-有吸收作用，在3.0 mmol·L-1時有強烈吸收，此時吸收平均速率約為39.66 pmol·cm-2·s-1。過低或過高的磷濃度下，平邑甜茶幼苗對NO3-有外排作用，在16.0 mmol·L-1時有明顯外排（吸收速率-91.01pmol·cm-2·s-1）。正值表示NO3-外排，負值表示NO3-吸收 values which are positive indicate the efflux of NO3-, while the negativ

23、e values indicate the absorption of NO3-.圖1 不同供磷水平下平邑甜茶幼苗根系NO3-的吸收速率Fig.1 The NO3- absorption rate of Malus hupehensis Rehd. seedlings on different phosphorus level圖2 3mmol·L-1H2PO4-處理下平邑甜茶根系對NO3-的吸收速率Fig.2 The NO3- absorption rate of Malus hupehensis Rehd. seedlings on 3mmol·L-1 H2PO4-3.2

24、.2 不同供磷水平下平邑甜茶的根系形態(tài)指標平邑甜茶幼苗根系總長度、根系總表面積及根尖個數(shù)受供磷水平的影響較為顯著，其中在低磷水平（0-1.0mmol·L-1）時，其根系長度、根系總表面積較小，且根尖數(shù)較少；隨著供磷水平的增加，在2.0-4.0mmol·L-1時，平邑甜茶根系生長迅速，其根系長度、表面積及根尖數(shù)量均有顯著增加，且達到最高水平；隨后，在6.0-16.0mmol·L-1時，由于過量供磷抑制了根系的生長，使平邑甜茶幼苗根系長度、表面積均有大幅降低，根尖數(shù)量驟降。3.2.3 不同供磷水平下平邑甜茶各器官Ndff值如表3所示，不同供磷水平下平邑甜茶幼苗根、莖、

25、葉的Ndff變化顯著。其中，當H2PO4-濃度為0-1.0mmol·L-1時，平邑甜茶各器官Ndff均處于較低水平，且莖Ndff%>根Ndff%>葉Ndff%；此時生長介質(zhì)中磷濃度較低，平邑甜茶根系生長較弱，根部的吸收能力有限，加之根部需氮較少，促使氮素向地上部轉(zhuǎn)運。但H2PO4-濃度為2.0-4.0mmol·L-1時，各器官Ndff較之前明顯增加，且根Ndff%>莖Ndff%>葉Ndff%；供磷顯著促進了根系生長，使根部吸氮能力明顯增強，同時根部為了維持其較大的生長量，需要更多的氮素供應，因此向地上部轉(zhuǎn)移的氮素相對較少。隨著供磷水平的繼續(xù)增加，當H

26、2PO4-濃度為6.0-16.0mmol·L-1時，平邑甜茶各器官Ndff值并未持續(xù)增加，而是維持在一個略低于最大值的相對較高的水平，此時供磷對根部生長的促進作用逐漸不明顯，根系的生長受到抑制，因而使根系對氮素的吸收能力減弱。表2 不同供磷水平下平邑甜茶的根系形態(tài)指標Table 2 Root architecture parameters of Malus hupehensis Rehd. seedlings on different phosphorus levelH2PO4-mmol·L-1Concentration 根系長度（cm）Length（cm）根系總表面積（c

27、m2）Surface area（cm2）根尖數(shù)（個）Quantity of tips0368.63±8.74d 63.73±2.67g2390.33±144.46e 1.0512.41±9.31c64.10±2.47g3073.67±291.75e2.01074.41±130.92a182.83±7.51a7243.33±472.23ab3.0998.68±18.10a154.25±4.48c7879.33±759.36a4.01061.85±37.89a173.1

28、3±3.80b6920.67±890.22abc6.0776.17±14.36b 120.70±1.42ef4798.33±504.80d8.0849.25±26.49b131.40±4.21d6116.00±202.72c12.0807.01±5.47b125.34±3.27de 6319.67±592.11bc 16.0838.48±6.93b115.67±7.17f4305.33±685.83d注（Note）：同一列小寫字母表示差異達0.05顯著水平

29、Values followed by a lowercase within the same column are significantly different at the 0.05 level.表3 不同供磷水平下平邑甜茶的各器官Ndff值Table 3 Ndff value of Malus hupehensis Rehd. seedlings on different phosphorus levelH2PO4-濃度mmol·L-1Concentration 根Ndff%Ndff%of root莖Ndff%Ndff% of stem葉Ndff%Ndff% of leaf03

30、.19±0.04i 4.09±0.07g 3.37±0.05g 1.04.99±0.08f5.17±0.01d5.00±0.02a2.06.54±0.07b6.24±0.02a4.57±0.03c3.06.92±0.01a6.30±0.02a4.68±0.06b4.05.95±0.01c5.88±0.02b4.99±0.08a6.04.56±0.02h4.71±0.03f4.21±0.04d8.05.55±

31、0.04d5.35±0.09c3.77±0.07f12.05.25±0.07e5.24±0.03d4.04±0.01e16.04.70±0.02g4.82±0.05e3.81±0.00f注（Note）：同一列小寫字母表示差異達0.05顯著水平Values followed by a lowercase within the same column are significantly different at the 0.05 level.3.3 平邑甜茶NO3-利用特性對供磷水平的響應3.3.1 不同供磷水平下平邑

32、甜茶葉片NO3-積累量及硝酸還原酶（NR）活性由表4可知，不同供磷處理平邑甜茶幼苗葉片NO3-積累各不相同，除16.0mmol·L-1處理較低外，其余磷水平處理NO3-積累量均維持在300-500g·g-1，其中，4.0mmol·L-1處理NO3-積累量相對較低，為311.79g·g-1。葉片硝酸還原酶活性數(shù)據(jù)表明，磷虧缺時葉片NR較低，但1.0-3.0mmol·L-1處理時，葉片NR活性明顯升高，均維持在30g·g-1·h-1以上，此時由根部運送來的NO3-能夠在硝酸還原酶的作用下迅速還原成NO2-，進而參與葉片的氮代謝過

33、程；而4.0-16.0mmol·L-1處理時，硝酸還原酶活性較低，氮代謝水平較弱，平邑甜茶幼苗對氮素的利用水平較低。表4 不同供磷水平下平邑甜茶葉片NO3-積累量及硝酸還原酶（NR）活性Table 4 The accumulation of NO3- and the Nitrate Reductase activity in leaves of Malus hupehensis Rehd. seedlings on different phosphorus levelH2PO4-mmol·L-1Concentration 葉片NO3-積累量（g·g-1）The a

34、ccumulation of NO3-硝酸還原酶活性（g·g-1·h-1）Nitrate Reductase activity0402.73±10.90ab 13.98±0.92c 1.0466.28±7.76a34.06±1.33a2.0375.79±10.23bc34.76±0.95a3.0407.04±18.39ab35.46±0.82a4.0311.79±11.07cd16.38±0.54b6.0431.52±130.34ab7.83±0.91d8

35、.0415.38±8.25ab16.87±0.43b12.0411.13±6.01ab18.48±0.73b16.0275.07±13.08d11.97±3.05c注（Note）：同一列小寫字母表示差異達0.05顯著水平Values followed by a lowercase within the same column are significantly different at the 0.05 level.3.3.2 不同供磷水平下平邑甜茶幼苗對NO3-的利用率平邑甜茶幼苗對硝態(tài)氮的利用效率受供磷水平的影響顯著，其中磷虧缺處

36、理時，其氮肥利用率極低，僅為7.22%，而后隨著供磷水平的增加，平邑甜茶幼苗的氮肥利用率顯著增加，在4.0mmol·L-1磷水平時其氮肥利用率達到最大值（42.24%），但持續(xù)過量供磷反而使平邑甜茶幼苗的氮肥利用率驟然降低，在6.0-16.0mmol·L-1處理時，其氮肥利用率基本維持在20-30%的水平。圖3 不同供磷水平下平邑甜茶幼苗對NO3-的利用效率Fig.3 The NO3- utilization rate of Malus hupehensis Rehd. seedlings on different phosphorus level4 討論根尖是整個根部氮素

37、吸收和分泌最活躍的部位，距離根尖越遠的部位，根組織的年齡越大，老的組織會產(chǎn)生一個纖維層，阻礙氮素的吸收16。另外，根系成熟區(qū)生有大量根毛，大大增加了根系的吸收表面積，在氮素吸收中也發(fā)揮重要的作用17。在本試驗中，低磷水平下平邑甜茶幼苗根系生長較弱，根系表面積和根長較小，根尖數(shù)較少，因而植株對氮素的吸收能力較弱；隨著供磷水平的增加，充足的養(yǎng)分能夠滿足根系生長的需要，其根系生長迅速，根系長度、表面積及根尖數(shù)量均有顯著增加，此時植株吸氮水平隨之上升；然而過量供磷抑制了平邑甜茶根系的生長，其根尖數(shù)量驟降，根系對氮素的吸收能力也隨之減弱。對根系生長具有抑制作用的信號來自葉片NO3-的含量，其可以調(diào)節(jié)地上

38、部和地下部之間的物質(zhì)分配，當植物體內(nèi)氮素積累到一定程度時，植物根系生長往往受到抑制18-20，過量供磷時平邑甜茶葉片有較高的氮素積累，更加抑制了根系的生長。硝態(tài)氮進入植物細胞后，可以作為一種信號分子誘導硝酸還原酶的產(chǎn)生21，硝酸還原酶是硝酸鹽同化過程中的限速酶，可直接調(diào)節(jié)NO3-的還原，從而調(diào)節(jié)氮代謝11。磷是NADPH的組成成分，而NADP+/NADPH作為硝酸還原酶的電子載體，將電子從FAD逐步轉(zhuǎn)移到NO3-，使其還原為NO2-10。同時磷是ATP的重要組分，而ATP是細胞生命活動不可或缺的能量供應22。本研究認為，磷虧缺處理時由于缺乏充足的電子載體和能量的供應，使平邑甜茶葉片硝酸還原酶活

39、性較低，根系吸收的氮素不能夠在短時間內(nèi)完成同化，因此此時平邑甜茶的氮肥利用率較低；充足供磷能夠保證ATP和電子載體的活性和數(shù)量，葉片硝酸還原酶活性明顯高于低磷處理，NO3-的同化作用加速，因而此時植株氮肥利用率也較高；而過量供磷時，葉片硝酸還原酶活性也明顯降低，導致平邑甜茶幼苗的氮肥利用率偏低，但有關(guān)過量供磷對硝酸還原酶活性的影響未見報道。同時，本研究運用非損傷微測技術(shù)，活體測定了不同供磷水平下平邑甜茶根系對NO3-的吸收速率，在磷虧缺和磷過量時NO3-均呈現(xiàn)強烈的外排趨勢，此時平邑甜茶幼苗對氮素的吸收受到嚴重抑制，而適量供磷處理平邑甜茶幼苗對NO3-的吸收速率較大，能夠促進根系對氮素的吸收，

40、為探討氮素吸收機理提供了可靠依據(jù)。5 結(jié)論本研究證明了氮、磷相互作用對平邑甜茶幼苗生長的影響，不同供磷水平通過影響根系的生長和擴散從而影響氮素的吸收。磷虧缺時，由于根系生長受限，其氮素吸收和利用受到限制，適當充足的供磷刺激了幼苗根系生長，從而促進平邑甜茶對氮素的獲取，然而過量供磷促進了葉片氮素的積累，過量的NO3-作為信號抑制了平邑甜茶根系的生長，使氮素吸收受到抑制。References1 Moll R H,et al . Analysis and interpretation of factors which contribute to efficiency of nitrogen util

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