Red-ET同源重組技術(shù)在載體構(gòu)建中的應(yīng)用

1、    red/et同源重組技術(shù)在載體構(gòu)建中的應(yīng)用    郭善軍張曉林陳章寶曾吉摘 要 red/et同源重組技術(shù)是以原有的重組技術(shù)為基礎(chǔ)，利用rac噬菌體et系統(tǒng)或者 噬菌體的red系統(tǒng)進(jìn)行外源基因重組的重組方法。該方法使同源重組過(guò)程變得更方便快捷。本文對(duì)red/et同源重組技術(shù)的原理，改進(jìn)和載體構(gòu)建方面的應(yīng)用做了綜述。關(guān)鍵詞 red/et同源重組 噬菌體 載體構(gòu)建：q392 ：a2001年人類(lèi)基因組測(cè)序完成，基因中所含有的大量的功能信息越來(lái)越受到人們的關(guān)注。為了解這些復(fù)雜的人類(lèi)密碼的含義，對(duì)單個(gè)基因功能的研究也顯得越來(lái)越重要。然而，對(duì)于真核生物基因片段

2、而言，其序列中除了包含具有功能、能表達(dá)的外顯子之外，還含有很多調(diào)控序列等內(nèi)含子，如此一個(gè)基因片段則可能大至幾十或上百kb。雖然現(xiàn)今有相應(yīng)的載體，如bac（人工染色體）和pac（p1人工染色體）能裝載如此大量的基因信息，但是要找到這些基因片段的限制性?xún)?nèi)切位點(diǎn)，并在體外對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)距離的片段擴(kuò)增的難度比較大。red/et重組技術(shù)是以傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)為基礎(chǔ)，但是，相對(duì)于普通的同源重組技術(shù)而言，它具有簡(jiǎn)單、快速、高效等特點(diǎn)，而且整個(gè)重組過(guò)程不需要經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增階段，這樣可以避免外界環(huán)境引起的不必要的突變。1傳統(tǒng)同源重組自然發(fā)生的同源重組是兩個(gè)dna分子之間進(jìn)行片段交換，從而使序列重排。同源重組分析最早開(kāi)

3、始于1956年。在大腸桿菌中，a john clark發(fā)現(xiàn)了兩種與同源重組有關(guān)的酶，raca和recbcd。在同源重組發(fā)生的時(shí)候，reca結(jié)合dna單鏈或雙鏈，對(duì)雙鏈dna進(jìn)攻，把原來(lái)配對(duì)的互補(bǔ)鏈分開(kāi)，并嘗試自身與被入侵dna鏈配對(duì)。當(dāng)配對(duì)成功后，reca蛋白脫落?；蛘咴趓ecbcd的引導(dǎo)下，使目標(biāo)dna解旋，以便使外源dna分子插入并在reca的幫助下進(jìn)行重組。當(dāng)兩條鏈發(fā)生重組時(shí)，會(huì)產(chǎn)生holliday中間體，該中間體在重組完成時(shí)由ruvab和recg蛋白進(jìn)行拆分。至此，形成兩條含有異源序列的雙鏈dna。在質(zhì)?；蚴删w轉(zhuǎn)入大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)同源區(qū)段小于75bp時(shí)會(huì)使重組率顯著降低。但是實(shí)際

4、上，在reca重組系統(tǒng)中，要求同源臂的長(zhǎng)度在1kb左右，且反應(yīng)條件要求比較苛刻。2 red/et同源重組技術(shù)red/et同源重組系統(tǒng)，其實(shí)是red同源重組系統(tǒng)和et同源重組系統(tǒng)的總稱(chēng)，其中et系統(tǒng)于1998年由stewart等在大腸桿菌中誘導(dǎo)的rac噬菌體中發(fā)現(xiàn)，隨后又在 噬菌體中發(fā)現(xiàn)了red系統(tǒng)。在這兩個(gè)系統(tǒng)中，整個(gè)重組過(guò)程由dna重組酶參與而不需要限制性?xún)?nèi)切酶，且對(duì)同源臂長(zhǎng)度的要求低，僅需35-50bp的同源序列，而傳統(tǒng)的reca同源重組則需要大約1kb的同源序列。并且該系統(tǒng)介導(dǎo)的整個(gè)同源重組過(guò)程都是在細(xì)內(nèi)進(jìn)行，避免了因胞外反應(yīng)引起的不必要突變。2.1 et同源重組系統(tǒng)該系統(tǒng)于1998年由

5、stewart等在大腸桿菌中誘導(dǎo)的rac噬菌體中發(fā)現(xiàn)，其所需的單側(cè)同源臂長(zhǎng)度僅為35-50 bp，該噬菌體通過(guò)表達(dá)蛋白rece和rect來(lái)介導(dǎo)重組反應(yīng)。其中rece蛋白有5-3外切酶活性，能夠從5-3端依次切下雙鏈dna上的堿基，使dna分子形成3粘性末端。rect是一種單鏈結(jié)合蛋白，保護(hù)單鏈核苷酸不被降解，能在退火時(shí)指導(dǎo)單鏈入侵。在et系統(tǒng)中，帶有同源臂的外援dna分子可以直接通過(guò)同源臂找到同源區(qū)域，然后進(jìn)行dna的互換。2.2 red同源重組系統(tǒng)red重組系統(tǒng)也是由stewart的實(shí)驗(yàn)小組在 噬菌體中發(fā)現(xiàn)，它是由red 和red 兩種蛋白組成的同源重組系統(tǒng)。red 由三個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成，中

6、間的空隙能消化dna分子，與et系統(tǒng)中的rece蛋白相似，它具有5-3端核酸外切酶活性，能形成3粘性末端。red 也是一種單鏈結(jié)合蛋白，作用相似于et系統(tǒng)中的rect蛋白。3 重組原理及操作3.1 red/et同源重組的原理根據(jù)red/et中red 及rece、red 及rect的功能，推測(cè)了該同源重組系統(tǒng)的作用機(jī)理。當(dāng)帶有同源臂的外源dna分子進(jìn)入到大腸桿菌中時(shí)，red 或rece發(fā)揮其5-3端核酸外切酶功能，由5端開(kāi)始降解dna序列，產(chǎn)生的3粘性末端，這時(shí)外源dna具備了與受體dna發(fā)生重組的條件。產(chǎn)生的粘性末端被rect或者red 結(jié)合35bp的單鏈核苷酸序列，同時(shí)防止被細(xì)胞內(nèi)存在的核酸

7、內(nèi)切酶降解。在dna退火時(shí)，含有粘性末端的3單鏈進(jìn)攻雙鏈dna片段，重組。發(fā)生重組的兩條dna鏈經(jīng)過(guò)剪切和dna聚合酶的修復(fù)作用后，重組dna形成，外源dna成功導(dǎo)入受體dna中。但是在大腸桿菌中有一種recbcd蛋白，它具有極強(qiáng)的核酸外切酶活性，能將外源線性dna降解掉，從而降低重組的成功率。所以在recbcd蛋白缺失的大腸桿菌中red/et同源重組的方法才能最大可能的發(fā)揮作用。為了能提高外源dna在大腸桿菌中的重組率，首先應(yīng)該抑制recbcd在大腸桿菌中的表達(dá)量，為此將 噬菌體gam蛋白的基因?qū)氲街亟M系統(tǒng)中。gam蛋白能與recbcd形成recbcd-gam符合體，抑制recbcd的核酸

8、外切酶活性。3.2操作方式該重組技術(shù)在的操作方式主要有兩種。（1）建立含有將 基因的et系統(tǒng)或red系統(tǒng)的質(zhì)粒，在實(shí)施重組時(shí)將三者共同導(dǎo)入受體分子中，共同表達(dá)。（2）直接在受體菌中篩選出能進(jìn)行red/et重組的菌株。前者的重組成功率更高，但是當(dāng)受體分子不容易接受外源dna時(shí)，后一種方式就顯得更加便捷。4系統(tǒng)優(yōu)化最初red/rt系統(tǒng)采用的是pdab-et 依托型質(zhì)粒載體，在該載體中，rece、rect以及 基因分放在pbad、em7和tn-5啟動(dòng)子下共表達(dá)。在之后構(gòu)建的pdab-etg和pdab-gba載體中，rece/rect/red 和red /red /red 被放在pbad啟動(dòng)子后面共表

9、達(dá)，該啟動(dòng)子受l-阿拉伯糖誘導(dǎo)調(diào)控。但是在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題。 （1）在發(fā)生重組后該載體不容易從宿主細(xì)胞中去除，影響后續(xù)的研究工作。為此，研究人員開(kāi)發(fā)了溫控性質(zhì)粒。其原理是將red /red 與 基因放在含有pl啟動(dòng)子和ci857基因的載體上，然后導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)。在溫度為30時(shí)，ci857基因啟動(dòng)pl啟動(dòng)子，使red系統(tǒng)不表達(dá)。當(dāng)溫度為42時(shí)，ci857基因的作用被抑制，red系統(tǒng)得以重新表達(dá)。（2）由于工程用大腸桿菌一般都缺乏reca蛋白，在這樣的情況下重組的發(fā)生率會(huì)降低。在最初的目的中使reca缺失，其目的是讓真?zhèn)€表達(dá)系統(tǒng)中外源dna復(fù)制更穩(wěn)定。但是為了避免reca缺失對(duì)重

10、組率的影響又從新引入了reca蛋白。（3） 基因在表達(dá)的過(guò)程中不易控制，它的過(guò)度表達(dá)會(huì)影響recbcd的活性，進(jìn)而影響質(zhì)粒表達(dá)的穩(wěn)定性（gam蛋白與recbcd蛋白結(jié)合只是抑制了recbcd對(duì)核酸的降解能力，但仍然能對(duì)同源重組起促進(jìn)作用）。為了解決這樣的問(wèn)題，研究者將 基因和red/et系統(tǒng)共表達(dá)，從而對(duì) 基因進(jìn)行調(diào)控。此外，有研究發(fā)現(xiàn)， 基因上的5端的非翻譯區(qū)域?qū)χ亟M效率有很大的影響。將含有5端的非翻譯區(qū)突變的基因與red 和red 連接，可以很大程度的提高重組效率。5在載體構(gòu)建中的應(yīng)用2006年osterrieder等運(yùn)用red/et系統(tǒng)和反篩選系統(tǒng)（i-scei蛋白）設(shè)計(jì)出了兩步重組方法

11、。首先設(shè)計(jì)一個(gè)含有i-scei同源臂的基因片段，通過(guò)red/et系統(tǒng)轉(zhuǎn)入載體之中。構(gòu)建好的重組載體通過(guò)誘導(dǎo)i-scei蛋白的表達(dá)，使雙鏈產(chǎn)生切口。切口處可作為同源臂，進(jìn)行下一次的異源重組。這種兩步重組系統(tǒng)大大地提高了重組的精確性。在對(duì)致病菌基因的研究中，朱善元等對(duì)禽致病大腸桿菌的ibea基因進(jìn)行缺失，用缺失該基因的大腸桿菌粘附與侵襲人微血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果顯示，缺失ibea基因的大腸桿菌與微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力顯著下降，侵襲率也顯著下降。murphy等還通過(guò)該技術(shù)對(duì)致病大腸桿菌的有毒基因進(jìn)行敲除，以為免疫制劑的進(jìn)一步研究提供理論方法。蘭德松等，利用red/et同源重組技術(shù)，通過(guò)兩步重組法構(gòu)建了禽流感a/goose/guangdong/3/96（h5n1）毒株的血凝素（ha）基因的重組火雞皰疹病毒。他們的研究為新型禽流感重載活性疫苗的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。6展望red/et同源重組技術(shù)的使用，為外源基基因的重組表達(dá)提供了一種快捷、簡(jiǎn)單的方法。在抗生素的開(kāi)發(fā)中，使抗生素異源表達(dá)，提高產(chǎn)量也是研究中的重點(diǎn)。該技術(shù)除