抗血清制備及抗體效價測定

1、NDV 抗血清制備及抗體效價測定論文摘要.4【實驗過程】4Part. NDV 抗血清制備4一、實驗原理4二、實驗儀器、材料和試劑51. 儀器52. 材料53. 試劑5三、方法和步驟5（一）NDV 兔抗血清制備51. 家兔捉拿方法52. 家兔固定方法53. 初次免疫64. 二次免疫65. 終末免疫66. 試血77. 頸動脈放血78. 血清分離79. 抗血清保存7（二）NDV 鼠抗血清制備81. 小白鼠的捉拿和固定82. 初次免疫83. 二次免疫94. 終末免疫95. 試血96放血107血清分離108抗血清保存10Part . 瓊脂雙擴散實驗檢測抗體效價11一、基本原理11二、實驗儀器、材料和試劑

2、111. 儀器112. 材料113. 試劑11三、方法和步驟111. 滅活雞新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取112. 1%瓊脂糖配制113. 倒平板114. 打孔115. 稀釋抗血清126. 加樣127. 孵育128. 結(jié)果觀察12Part . 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定 NDV 抗血清效價13一、基本原理13二、實驗儀器、材料和試劑131. 儀器132. 材料133. 試劑13三、方法和步驟131. 雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活抗原提取132、抗原包被133. 封閉144. 洗板145. 稀釋抗血清146. 加抗血清147. 洗板148. 加酶標(biāo)二抗149. 洗板1410.

3、顯色1411. 終止1412. 讀數(shù)1413. 結(jié)果判定15Part . 免疫印跡實驗鑒定抗體的特異性15一、基本原理15二、實驗儀器、材料和試劑151. 儀器152. 材料153. 試劑15（1）SDS-PAGE 相關(guān)試劑：15（2）Western blotting 相關(guān)試劑：16三、方法和步驟161. SDS-PAGE162. 轉(zhuǎn)膜173. 免疫檢測17（1）膜的封閉17（2）洗膜17（3）加入一抗17（4）洗膜18（5）與二級抗體作用：18（6）洗膜18（7）Odessey 近紅外成像儀掃描成像18【實驗結(jié)果及分析】18 NDV 抗血清制備及抗體效價測定摘要：抗血清，新城疫病毒（Newc

4、astle disease virus，NDV）又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞瘟病毒或禽肺腦炎病毒。在病毒分類學(xué)中的位置屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒屬（Paramyxovirus）中的一個種。該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強毒株可使雞群全群毀滅。以新城疫病毒滅活疫苗（Ulster 2C 株）滅活油劑苗多種途徑免疫兔和小白鼠，制備新城疫病毒抗血清。也叫免疫血清，是指含有免疫蛋白的血清?？贵w效價指抗體的物理狀態(tài)及其在體內(nèi)滯留時間，以其與抗原反應(yīng)的多少來表示其免疫效果。此次實驗主要是進行家兔與小鼠的新城疫病毒抗血清的制備過程，并通過酶免疫吸附試驗、兔疫

5、印跡實驗對其進行抗體效價檢測。關(guān)鍵字：NDV 抗血清 抗體效價 免疫【實驗過程】本次實驗一共分為四個大步驟：Part. NDV 抗血清制備Part . 瓊脂雙擴散實驗檢測抗體效價Part . 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定 NDV 抗血清效價Part . 免疫印跡實驗鑒定抗體的特異性Part. NDV 抗血清制備一、實驗原理將具有免疫原性的物質(zhì)注入健康動物體內(nèi)后，抗原可刺激機體相應(yīng) B 細胞增殖、分化形成漿細胞并分泌特異性抗體。待動物血清中存在大量抗體時，采集動物血液，分離析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗體）。由于抗原性物質(zhì)通常具有多個抗原決定簇，可以刺激機體產(chǎn)生多種抗體形成細胞克隆，合成和分

6、泌各種抗原決定簇的抗體，免疫血清中實際上是含有多種抗體的混合物，所以這種免疫法獲得的免疫血清又稱為多克隆抗體（Polyclonal antibody，PcAb）。多克隆抗體的制備是一個復(fù)雜的過程，為了獲得特異性強，效價高的抗血清，除了抗原的因素外，還需注意動物品系的選擇、抗原注射的濃度、劑量、次數(shù)、間隔時間及注射途徑等。對于免疫原性較弱的可溶性抗原(如蛋白質(zhì)類抗原)要加入佐劑，以增強免疫性。本實驗介紹新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制備過程。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞瘟病毒或禽肺腦炎病毒

7、。在病毒分類學(xué)中的位置屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒屬（Paramyxovirus）中的一個種。該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強毒株可使雞群全群毀滅。以新城疫病毒滅活疫苗（Ulster 2C 株）滅活油劑苗多種途徑免疫兔和小白鼠，制備新城疫病毒抗血清。二、實驗儀器、材料和試劑1. 儀器5mL 無菌凍存管，2.5mL 和 1mL 注射器，塑料靜脈插管，碘酒，75酒精棉球，剪刀，止血鉗，250mL 無菌三角瓶，50mL 無菌尖底離心管，家兔固定槽，家兔解剖臺，棉線，5mL吸頭和移液器，溫箱，離心機。2. 材料家兔：1-2kg 清潔級雄性或未孕雌

8、免；小鼠：SPF 級 6-8 周齡昆明鼠。3. 試劑雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司），0.01M PBS（ pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.2，加雙蒸水至 1000 mL），麻醉劑：普魯卡因溶液，硫柳汞。三、方法和步驟（一）NDV 兔抗血清制備1. 家兔捉拿方法動物的捉拿和固定是進行動物實驗的基本操作之一，正確的抓取固定動物是為了不損害動物健康，不影響觀察指標(biāo)，并防止被動物咬傷，保證實驗順利進行。家兔習(xí)性溫順，除腳爪銳利應(yīng)避免被其抓傷外，

9、較易捕捉。拿時切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。正確的方法是用右手抓住其頸背部皮毛，輕提動物，再以左手托住其臀部，使兔的體重主要落在左手掌心（如圖 1）。圖 1. 家兔的捉拿方法2. 家兔固定方法家兔的固定，依不同的實驗需要，常用兔固定箱或兔手術(shù)臺固定。兔固定箱通常由木頭、鐵皮或者樹脂材料制成，便于拆卸清洗消毒，一般用于固定兔子狐貍貉子等。使用時時可將家兔置于兔固定箱內(nèi)，在不需要幫手的情況下單人即可對兔子等動物打耳號，灌藥、耳緣靜脈注射、取血、或觀察耳部血管的變化等，常用于生理、藥理和免疫等作動物整體實驗時限制實驗物的活動。（如圖2）圖 2. 家兔固定箱固定方法在需要觀察血壓、呼吸和進行

10、頸、胸、腹部手術(shù)時，應(yīng)將家兔以仰臥位固定于兔手術(shù)臺上。固定方法是：先以四條 1cm 寬的布帶作成活的圈套，分別套在家兔的四肢腕或踝關(guān)節(jié)上方，抽緊布帶的長頭，將兔仰臥位放在兔手術(shù)臺上，再將頭部用兔頭固定器固定，然后將兩前肢放平直，把兩前肢的系帶從背部交叉穿過，使對側(cè)的布帶壓住本側(cè)的前肢，將四肢分別系在兔手術(shù)臺的木柱上。（如圖3）圖 3. 家兔手術(shù)臺固定方法3. 初次免疫在家兔足掌、腋窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等部位，選擇 610 處免疫接種點，采用皮下、皮內(nèi)或肌肉注射，每點注射上述雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗 0.10.2mL。如果使用沒有加佐劑的滅活新城疫病毒 Ulst

11、er 2C 株，也可以采用耳緣靜脈注射的方法進行免疫。（如圖4）圖 4. 家兔耳緣靜脈注射方法4. 二次免疫第一次免疫后間隔2周再以雞新城疫病毒Ulster 2C株滅活疫苗采用與初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等部位，選擇 610 處免疫接種點，采用皮下、皮內(nèi)或肌肉注射加強免疫。5. 終末免疫第二次免疫后間隔 2 周再按上述二次免疫方法進行第三次免疫。6. 試血終末免疫免疫 7 天后經(jīng)兔耳緣靜脈采血 2mL，分離血清，用瓊脂雙向擴散實驗測定抗體效價達 1:16 以上（稀釋抗體）以上時，即可放血，如效價不高，則加強免疫 l 次后，再行檢測。7. 頸動脈放血 將免

12、疫家兔仰面固定于家兔手術(shù)臺上，頭部放低，暴露頸部。沿氣管鈍性分離皮下組織，暴露氣管前的胸鎖乳突?。环蛛x胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，在肌束下面靠近氣管兩側(cè)，可見淡紅色搏動的頸動脈。（如圖5）圖 5. 兔頸部血管神經(jīng)分布圖將雙側(cè)動脈仔細分離，于每側(cè)動脈分別套入兩根棉線，一根在遠心端，一根在近心端，（圖 6）。圖 6. 兔頸部動脈血管先將一側(cè)動脈遠心端絲線結(jié)扎緊，然后在近心端用止血鉗夾?。ㄖ寡Q頭部用細塑料管包裹，避免損傷動脈）。用小的尖頭眼科剪在兩側(cè)絲線中間的動脈壁上剪開一個小口，以便插入塑料靜脈插管（或大號鋼針頭），再用近心端棉線固定靜脈插管，避免其從動脈內(nèi)滑出；輕輕松開止血鉗，血液很

13、快沿導(dǎo)管流入三角瓶，直至血流緩慢點滴而出時，以同法在對側(cè)動脈內(nèi)插管放血，并將動物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80-100mL。 8. 血清分離將血液置室溫中凝固約 1hr，然后置 4過夜，使血塊收縮；用 5mL 無菌移液管吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至 50 mL 無菌尖底離心管中。然后將血塊自容器壁分離，將血清全部傾入另一 50 mL 無菌尖底離心管，在 4下 2,500g 離心 10 分鐘，取上清液即血清部分與前述血清混合，將混合血清 41,500g 離心 10 分鐘，棄沉淀收集血清。9. 抗血清保存 （1）4保存：將抗血清除菌后，加入 0.0l硫柳汞或 0.1疊氮鈉，液體狀態(tài)保存

14、于普通冰箱，可以存放 3 個月到半年，效價高時，一年之內(nèi)不會影響使用。 （2）低溫保存：將抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20或-40，一般保存 5 年抗體效價不會有明顯下降?？贵w切忌反復(fù)凍融，反復(fù)凍融會使抗體效價顯著降低。 （二）NDV 鼠抗血清制備1. 小白鼠的捉拿和固定小白鼠較大白鼠溫和，雖也要提防被其咬傷手指，但毋需戴手套捕捉?？上扔糜沂肿プ∈笪蔡崞穑糜谑蠡\或?qū)嶒炁_上，用左手的拇指和食指抓住小鼠兩耳后頸背部皮膚，將鼠體置于左手心中，拉直后肢，以無名指及小指按住鼠尾部即可。有經(jīng)驗者可直接用左手小指鉤起鼠尾，迅速以拇指利食指、中指捏住其耳后項背部皮膚亦可。如操作時間較長，也可固定于小白

15、鼠固定板上。（如圖7）圖 7. 小白鼠的捉拿和固定2. 初次免疫分別在昆明鼠背部采用肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)注射雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗0.2mL，或者腹腔注射雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗 0.2mL。（1）腹腔注射法：小鼠固定后，使腹部朝上，頸部拉直，右手持注射器（56 號針頭），從恥骨聯(lián)合上一側(cè)向頭端以 30 度角刺入腹腔（應(yīng)避開膀胱）?？上却倘肫は?23mm，再刺入腹腔，以防藥液外漏。針頭刺入部位不宜太高太深，以免刺破內(nèi)臟。注射量一般為 0.10.25mL/10g 鼠重。圖 8. 小鼠腹腔注射法（2）皮下注射法：一般兩人合作。一人左手抓住小鼠頭部皮膚，右手拉住

16、鼠尾；另一人左手提高背部皮膚，右手持住注射器（針頭號同上），將針頭刺入提起的皮下。若一人操作，左手小指和手掌夾住鼠尾，拇指和食指提起背部皮膚，右手持注射器給藥。一般用量為0.050.25mL/10g 鼠重。圖 9. 小鼠皮下注射法（3）肌肉注射法：兩人合作時，一人抓鼠方法同上，另一人左手拉直一側(cè)后肢，右手持注射器，注射部位多選后腿上部外側(cè)（針頭號同上）。如一人操作，抓鼠方法類似腹腔注射，只是藥液注射在肌肉內(nèi)，每腿的注射量不宜超過 0.1mL。（4）尾靜脈注射法：將小鼠置于待置的固定筒內(nèi)，使鼠尾外露，并用酒精或二甲苯棉球涂擦，或插入 4050溫水中浸泡片刻，使尾部血管擴張。左手拉尾，選擇擴張最明

17、顯的血管；右手持注射器（45 號針頭），將針頭刺入血管，緩慢給藥。如推注有阻力而且局部變白，說明針頭不在血管內(nèi)，應(yīng)重新插入。穿刺時宜從近為尖部 1/3 處靜脈開始，以便重復(fù)向上移位注射。一般用藥量為 0.10.2ml/10g，不宜超過 0.5ml/10g。圖 10. 鼠尾皮下注射法3. 二次免疫第一次免疫后間隔 2 周分別在昆明鼠背部采用肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)注射雞新城疫病毒Ulster 2C 株滅活疫苗 0.2mL，或者腹腔注射雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗 0.2mL。4. 終末免疫第二次免疫后間隔 2 周分別在昆明鼠背部采用肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)注射雞新城疫病毒Ulster 2C 株滅

18、活疫苗 0.2mL，或者腹腔注射雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗 0.2mL。5. 試血末次注射 7 天后鼠眼球采血 0.2mL，分離血清，用瓊脂雙向擴散實驗測定抗體效價達1:16 以上（稀釋抗體），即可放血，如效價不高，繼續(xù)加大劑量，加強 l-2 次后，常可使效價增高。鼠眼球采血可采用以下兩種方法：（1）眼眶后靜脈叢采血：用 710cm 長的玻璃取血管，其一端內(nèi)徑為 11.5 mm，另一端逐漸擴大，細端長約 1cm 即可，將其尖端折斷，使其鋒利。將取血管浸入 1%肝素或其它抗凝劑溶液處理，干燥后使用。采血時，右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠頭朝下將鼠旋轉(zhuǎn)離心甩動 1min，左手拇指和食

19、指抓住鼠兩耳之間的皮膚使鼠固定，并用中指配合，輕輕壓迫頸部兩側(cè)，阻礙靜脈回流，使眼球充分外突，提示眼眶后靜脈叢充血。取用肝素過的醫(yī)用毛細采血管，右手拇指、食指和中指握住毛細管，將其尖端插入內(nèi)眼角與眼球之間，輕輕向眼底方向刺入約 23mm，手指旋轉(zhuǎn)捻動毛細管以刺破靜脈叢，鼠血順毛細管流入 1.5mL 無菌離心管中，收集鼠血。采血結(jié)束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法短期內(nèi)可重復(fù)采血。小鼠一次可采血 0.20.3 ml，大鼠一次可采 0.50.1ml（圖 11）。圖 11. 鼠眼眶后靜脈叢采血法 （2）眶動脈和眶靜脈取血法：右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠頭朝下將鼠旋轉(zhuǎn)離心甩動1min，用鑷子

20、拔去一側(cè)鼠眼球，用左手固定動物，壓迫眼球，盡量使眼球突出，右手用無鉤彎鑷子或彎止血鉗迅速摘除眼球，立即將鼠倒置，頭朝下，眼眶內(nèi)很快流出血液，將鼠血滴入 1.5mL 無菌離心管中，收集鼠血。注意不要讓小鼠流血過多，以免死亡。一般只適用于一次采血。大部動物采血后可以存活，可采另一側(cè)眼球取血。此法既能采取較大量的血液，又可避免斷頭取血法中因組織液的混入導(dǎo)致溶血的現(xiàn)象，現(xiàn)常取代斷頭取血法。先使動物眼球突出充血后，以彎頭眼科鑷迅速鉗取眼球，并將鼠倒置，頭向下，眼眶內(nèi)很快流出血液，讓血液滴入盛器，直至不流為止。此法由于取血過程中動物未死，心臟不斷在跳動，因此取血量比斷頭法多，一般可取鼠體重 45的血液量，

21、是一種較好的取血方法。（3）剪尾采血：需血量少時可用此方法。將動物固定，顯露尾部，將尾塵剪去約 5mm，從尾根部向尾端部按摩，血即從斷端流出。若用二甲苯棉球涂擦尾部或事先將鼠尾浸在 45水中數(shù)分鐘，使尾部血管充盈，可采到較多的血，但注意二甲苯可致溶血。也可用鋒利刀片割破尾動脈或尾靜脈，讓血液自行流出，采血后，消毒，止血。如將動物麻醉取血量可更多些。三根尾勢脈可交替切割，并自尾尖向尾根方向切割，小鼠每次采血約 0.1ml。6放血小鼠也可以采取眶動脈和眶靜脈取血法放血，此外還可用如下方法： （1）斷頭取血：當(dāng)需要較大量的血液，而又不需繼續(xù)保存動物生命時采用此法。左手捉持動物，使其頭略向下傾，右手持

22、剪刀猛力剪掉鼠頭，讓血液滴入盛器。小鼠可采血 0.81.0ml，大鼠可采用 58ml。（2）心臟取血：動物仰臥固定在固定板上，剪去心前區(qū)部位的被毛，用碘酒酒精消毒皮膚。在左側(cè)第 34 肋間，用左手食指摸到心搏處，右手取連有 45 號針頭的注射器，選擇心搏最強處穿刺，當(dāng)針刺入心臟時，血液由于心臟跳動的力量自動進人注射器。此法要求實驗者掌握以下要點：要迅速而直接插入心臟，否則，心臟將從針尖處滑脫；如第一次沒刺準(zhǔn)，將針頭抽出重刺，不要在心臟周圍亂探，以免損傷心、肺；要緩慢而穩(wěn)定的抽吸，否則，太多的真空反而使心臟塌陷。若不需保留動物生命時，也可麻*醉后切開動物胸部，將注射器直接刺人心臟抽吸血液。7血清

23、分離血清分離方法與（一）8 相同。8抗血清保存抗血清保存方法與（一）9 相同。Part . 瓊脂雙擴散實驗檢測抗體效價一、基本原理抗原、抗體在凝膠中擴散，并進行沉淀反應(yīng)，稱為免疫擴散實驗（immuno diffusion）。將抗原與其相應(yīng)抗體加入含有一定電解質(zhì)的瓊脂凝膠平板中鄰近孔內(nèi)，抗原和抗體從小孔向四周自由擴散，當(dāng)擴散到兩者濃度比例合適的部位時，出現(xiàn)白色的免疫復(fù)合物沉淀線，即雙向瓊脂擴散試驗。沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原抗體的特異性及相互間濃度比例，而且與其分子大小及擴散速度相關(guān)。如果反應(yīng)材料中有兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則兩孔間出現(xiàn)多條沉淀線。此方法最早由 Ouchterlony 提出

24、，因此又稱為 Ouchterlony 技術(shù)。本次實驗將以 WF83 株酚水抗原檢測兔抗 APP 抗血清效價，其中酚水抗原以 APP 的莢膜和脂多糖抗原為主，本方法也是 APP 血清學(xué)分型的常用方法。二、實驗儀器、材料和試劑1. 儀器11cm 平皿，200L 微量可調(diào)移液器和吸頭，打孔器，針頭，1.5mL eppendorf 管，50 mL離心管，離心管架，溫箱，微波爐，離心機。2. 材料雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司），上述用雞新城疫病毒Ulster 2C 株滅活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制備的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。3. 試劑0.01M P

25、BS（ pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.2，加雙蒸水至 1000 mL），瓊脂糖，雞新城疫病毒抗血清，氯仿。三、方法和步驟1. 滅活雞新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取取雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司）1mL，加氯仿 500µL，漩渦振蕩器上充分混合均勻，高速臺式離心機 12000rpm 離心 15min，收集上清備用。2. 1%瓊脂糖配制稱取瓊脂糖粉 0.3 克，放入三角瓶，加入無菌生理鹽水 30mL，微波爐中小功率加熱

26、，使瓊脂完全溶化。3. 倒平板取無菌 9cm 玻璃培養(yǎng)皿 1 個，平放于實驗臺（臺面要水平），將融化的 1%瓊脂溶液趁熱倒培養(yǎng)皿中（約加 25mL），使瓊脂厚度達 4mm，在室溫下放置使瓊脂冷卻凝固。4. 打孔先取一張一張紙，畫上將要打孔的圖樣，通常雙向瓊脂擴散實驗打孔有雙孔、線性排列3 孔、三角形排列 3 孔、正三角形排列 4 孔、十字形排列 5 孔、梅花形排列 7 孔瓊脂糖等模式（圖）。將圖樣放在瓊脂糖平板下方，將打孔器在正對圖樣為空的正上方垂直于瓊脂糖平板上輕輕按下再用注射器針頭挑取孔中瓊脂糖，即形成加樣微孔。注意在用注射器針頭挑取孔中瓊脂糖時不要碰傷了孔周圍的瓊脂。待微孔全部打好后，將

27、平板經(jīng)過酒精燈外火焰加熱封底（溫度不宜過高，防止瓊脂融化過多，孔塌陷）。為了測定 NDV 免疫血清的效價，本實驗采用梅花狀排列的小孔，孔徑為 8mm，空間距為 5-8mm。打好孔后用記號筆在瓊脂平板的底面將孔編號。圖 12.瓊脂雙擴散實驗打孔圖樣5. 稀釋抗血清取 1.5mL 無菌尖底 12支離心管排列于離心管架上并做好標(biāo)記，在每管各加生理鹽水100µL，吸取 100µL 免疫血清加入第 1 管，并充分混勻后吸出 100µL 加入第 2 管，經(jīng)充分混勻后吸出 100µL 加入第 3 管中，如此依次 2×稀釋至第 10 管，混勻后吸出 100&#

28、181;L 棄去。此時 110 管血清稀釋度為 1:21:64。圖 13 稀釋抗血清6. 加樣在每組呈梅花狀排列的小孔的中央孔加入一滴滅活雞新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原（30µL），周圍各孔依次加入未免疫動物血清、不同稀釋度抗血清各 30µL。加樣時注意不要使液體溢出孔外。圖 13.瓊脂雙擴散實驗加樣圖7. 孵育蓋上平板蓋放入濕盒，置 37溫箱孵育 2448h。8. 結(jié)果觀察將平板從濕盒中取出，在散射光的背景下（平板后方約 15cm 處用手或深色物擋?。┯^察，或在凝膠成像系統(tǒng)上用白光光源觀察，看抗原孔與不同稀釋度的抗血清孔之間是否有白色沉淀線，有沉淀線為陽性，否則

29、為陰性。圖 14. 瓊脂雙擴散沉淀線Part . 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定 NDV 抗血清效價一、基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay, 簡稱 ELISA）是酶免疫技術(shù)的一種，是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化反應(yīng)的高效性相結(jié)合而建立的一種技術(shù)，其基本原理是：將酶分子與抗體（或抗原）結(jié)合，當(dāng)酶標(biāo)記抗體（或抗原）與固相載體上的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合時，即可在底物溶液的參與下，產(chǎn)生肉眼可見的顏色反應(yīng)，顏色的深淺與抗原或抗體的量呈比例關(guān)系，用酶標(biāo)儀測定其吸光值進行定量分析。ELISA 技術(shù)具有特異、敏感、結(jié)果判斷客觀、簡便和安全等優(yōu)點，在生物學(xué)及相關(guān)

30、學(xué)科中應(yīng)用廣泛。本次實驗以 APP 分泌到細胞外的天然毒素 ApxIIA 為檢測抗原，包被酶標(biāo)板，通過間接ELISA 方法檢測抗血清中針對毒素的抗體。二、實驗儀器、材料和試劑1. 儀器96 孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，200µL 和 10µL 微量移液器和吸頭，10mL 無菌小燒杯，溫箱，酶標(biāo)儀，洗板機。2. 材料雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司），上述用雞新城疫病毒Ulster 2C 株滅活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制備的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。3. 試劑包被液：0.01M 碳酸鹽緩沖液（1.59 g NaCO3，2.93 g Na

31、HCO3，加去離子水至 1000 mL），洗滌液：0.01M PBST（pH7.2，含 0.05 Tween-20 的 PBS），封閉液：含 1牛血清白蛋白（BSA）的 PBST，酶標(biāo)二抗：辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG，使用時用PBST以1:5000稀釋，顯色液：四甲基聯(lián)苯胺（3,3,5, 5-Tetramethylbenzidine,TMB）顯色液，終止液：2M H2SO4 或 1 SDS。三、方法和步驟1. 雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活抗原提取 取雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗（南京梅里亞動物保健公司）1

32、mL，加氯仿 500µL，漩渦振蕩器上充分混合均勻，高速臺式離心機 12000rpm 離心 15min，收集上清備用。2、抗原包被 取上述離心上清 100µL 加入用 900µL 包被液（碳酸鹽緩沖液）稀釋，在 96 孔酶標(biāo)板各孔中加入稀釋的滅活雞新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原 100µL，在濕盒中于 37溫箱孵育 2h，或 4包被過夜。3. 封閉取出 96 孔酶標(biāo)板，甩干各孔中包被液，將 96 孔酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上叩干，每孔加入封閉液（含 1%BSA 的 PBST）100µL，37孵育 1h。4. 洗板取出 96 孔酶標(biāo)板，甩去封閉

33、液，每孔添加 PBST 200µL，浸泡 1min，甩干后再重復(fù)洗滌操作 2 次，將 96 孔酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上叩干或拍干。5. 稀釋抗血清取 1.5mL 無菌尖底離心管 9 支排列于離心管架上并做好標(biāo)記，在第 1 管中加入洗滌液297µL，其余各管各洗滌液 150µL，吸取 3µL 免疫血清加入第 1 管，并充分混勻后吸出 150µL加入第 2 管，經(jīng)充分混勻后吸出 150µL 加入第 3 管中，如此依次 2×稀釋至第 9 管，此時 19 管血清稀釋度為 1:1001:25600。 圖 15稀釋抗血清6. 加抗血清在 1

34、2 孔酶標(biāo)板條第 1-9 孔依次加入 1:1001:25600 各稀釋度抗血清各 100µL，第 10、11 孔每孔加入 100µL 1:100 稀釋的未免疫動物血清作為陰性對照，第 12 加 PBST 作為空白對照，將酶標(biāo)板平放在 37培養(yǎng)箱溫浴 1hr。圖16 加抗血清7. 洗板操作同步驟 4，需重復(fù) 4 次。8. 加酶標(biāo)二抗在酶標(biāo)板各孔加入 1:5000 稀釋的 HRP 標(biāo)記羊抗兔 IgG 100µL，將酶標(biāo)板平放在 37孵育 1hr。9. 洗板操作同步驟 5，需重復(fù)至少 5 次。10. 顯色在酶標(biāo)板各孔加入 TMB 顯色液 100µL，將酶標(biāo)板置

35、室溫避光靜置 10min。11. 終止在酶標(biāo)板各孔加入 50µL 2M H2SO4，終止反應(yīng)。12. 讀數(shù)在 405nm 波長下以 12 孔為空白孔調(diào)零，測定光密度值。13. 結(jié)果判定P/N檢測孔 OD 值/陰性孔 OD 值，P/N>2.1 為陽性，P/N<1.5 為陰性，介于其間為可疑。效價判定：以出現(xiàn)陽性孔的最高稀釋度作為待檢血清效價。Part . 免疫印跡實驗鑒定抗體的特異性一、基本原理免疫印跡（Western blotting）最早是由 Towbin 等于 1979 年將 Southern blotting 技術(shù)擴展到蛋白質(zhì)領(lǐng)域，并與特異靈敏的免疫分析技術(shù)相結(jié)合而

36、發(fā)展的技術(shù)。它的基本原理是將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合起來，其主要的操作分為三個過程：1）將抗原物質(zhì)經(jīng) SDS-PAGE 凝膠電泳分離；2）將分離的組分從 PAGE 凝膠上轉(zhuǎn)移到固相基質(zhì)上，如硝酸纖維素膜等，此過程稱為印記，以利于隨后的檢測反應(yīng)的進行；3）對轉(zhuǎn)移后的組分分別進行免疫檢測，與抗血清一起孵育，使一級抗體與待檢測的抗原決定簇結(jié)合，再與經(jīng)熒光素、酶或核素標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)，顯示出蛋白組分區(qū)帶，并可對其進行定量。圖 17. 免疫印跡實驗流程圖二、實驗儀器、材料和試劑1. 儀器電泳儀，垂直電泳槽，電轉(zhuǎn)膜儀，水平搖床，無菌培養(yǎng)皿，凝膠成像系統(tǒng)或相機2. 材料雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅

37、活疫苗（南京梅里亞動物保健公司），上述用雞新城疫病毒Ulster 2C 株滅活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制備的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。3. 試劑（1）SDS-PAGE 相關(guān)試劑：5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液：75.5g Tris 堿，470g 甘氨酸，250mL 10% SDS，加去離子水溶解定容至 5000mL；：1.5mol/L（pH8.8）：Tris 堿 181.7g 溶于去離子水中，用 HCl 調(diào) pH 值至 8.8，定容至 1000mL；1.0mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH6.8）：Tris 堿 121.1g 溶于去離子水中，用 HCl 調(diào) pH

38、 值至 6.8，定容至 1000mL；10%過硫酸銨：1g 過硫酸銨溶于 10mL 去離子水中，4保存；2×SDS 凝膠加樣緩沖液：10mL 1.0mol/L Tris-HCl （pH6.8），3.1g 二硫蘇糖醇（DTT），4g SDS，0.2g 溴酚藍，20mL 甘油，定容至 100mL；30%聚丙烯酰胺母液：將 145g 丙烯酰胺和 5g N,N-亞甲雙丙烯酰胺溶于 300mL 去離子水中，加熱至 37溶解，定容至 500mL，4避光保存?zhèn)溆?；考馬斯亮藍染色液：450mL 甲醇，450mL 去離子水，100mL 冰乙酸，2.5g 考馬斯亮藍 R250，溶解后定容至 1000mL

39、；脫色緩沖液：450mL 甲醇，450mL 去離子水，100mL 冰乙酸，定容至 1000mL；其它：預(yù)染蛋白質(zhì) Marker，正丁醇（2）Western blotting 相關(guān)試劑：轉(zhuǎn)膜緩沖液：2.9g 甘氨酸，5.8g Tris 堿，0.37g SDS，200mL 甲醇，定容至 1000mL；洗滌液：含 0.5 Tween 20 的 TBS。TBS（pH8.0）：稱取 1.21g Tris 堿，8.77g NaCl，充分溶解，調(diào) pH 至 8.0 后，定容至 1000mL；封閉液：含 10 脫脂奶的 PBST 溶液；一級抗體：雞新城疫病毒 Ulster 2C 株滅活疫苗免疫家兔制備的抗血清

40、，使用前用PBST 以 1:100 稀釋；二級抗體：IRDye800 標(biāo)記的羊抗兔 IgG，使用前用 PBST 以 1:15000 稀釋；終止液：滅菌去離子水三、方法和步驟1. SDS-PAGE（1）夾好灌制聚丙烯酰胺凝膠的玻璃板；（2）配制 12%的 SDS 丙烯酰胺分離膠 10mL，在燒杯中依次加入： 滅菌去離子水 3.3mL30%丙烯酰胺溶液 8mL 4mL1.5mol/L Tris（pH8.8） 2.5mL10% SDS 0.1mL10%過硫酸銨 0.1mLTEMED 0.004mL搖勻后用移液器加入到兩塊玻璃板的間隙中；（3）在分離膠上加入正丁醇 0.3mL，置 37約 30min；（4）待分離膠聚合后，傾出覆蓋層的正丁醇液體，用去離子水淋洗凝膠表面 23 次，用濾紙片吸凈殘留液體；（5）配制 5%濃縮膠 3mL，在燒杯中依次加入：滅菌去離子水 2.1mL30%丙烯酰胺溶液 8mL 0.5mL1.0mol/L Tris（pH6.8） 0.38mL10% SDS 0.03 L10%過碭酸銨 0.03m