分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)a -淀粉酶一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饪莶菅挎邨U菌發(fā)酵的根本過程二、實(shí)驗(yàn)原理a-淀粉酶是一類用途十分廣泛的酶，糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡 織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)都經(jīng)常使用。 a-淀粉酶(EC.3.2.1.1 )作用淀粉時(shí)可從分子 內(nèi)部切開 a-1,4- 糖苷鍵而生成糊精和復(fù)原糖，產(chǎn)物的末端殘基碳原子構(gòu)型為 a- 構(gòu)型，故稱a-淀粉酶。a-淀粉酶的分子量范圍是15600-139300，通常為45000-60000，可分為耐 熱、耐酸、耐堿和耐鹽酶。a-淀粉酶可由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，也可從植物和動(dòng)物細(xì) 胞中提取，目前工業(yè)上都以微生物發(fā)酵法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn) a-淀粉酶。三、實(shí)驗(yàn)材料和方法1

2、、 菌種枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis )2、種子培養(yǎng)基牛肉膏 1；蛋白胨 2；Nacl 1 ；3、發(fā)酵培養(yǎng)基可溶性淀粉 10；(NH4) 2SO4 2.6；KH2PO4 5.7；K2HPO41.7；pH 4、儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)、搖床、培養(yǎng)箱、紫外可見分光光度計(jì)等。四、實(shí)驗(yàn)步驟一 種子培養(yǎng)將冰箱中保存的斜面菌種在30C恒溫培養(yǎng)箱中活化3h，取一環(huán)接種至搖瓶 中，30T下置于搖床中培養(yǎng)16-18h，即得新鮮種子液。二 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)500mL 搖瓶中裝有 50mL 已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，用無(wú)菌的移液管吸取 5mL 種子液接入搖瓶，在搖床中與 30 C和200r/min條件下培養(yǎng)4

3、8h。結(jié)束時(shí)將培養(yǎng) 液離心，收集上清液放入冰箱中冷藏保存，集中測(cè)定 a-淀粉酶的酶活大小。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)發(fā)酵結(jié)束時(shí)的細(xì)胞生物量和 pH 值。此次實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行測(cè)量。硫酸銨沉淀法別離純化(透析)a- 淀粉酶一、目的和要求1、了解保有蛋白質(zhì)活性的濃縮方法。2、掌握硫酸銨沉淀法濃縮a-淀粉酶的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)高濃度鹽存在時(shí)，蛋白質(zhì)往往凝聚并析出沉淀。這一技術(shù)稱為“鹽析。 不同的蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽中形成沉淀，所以鹽析常用于蛋白質(zhì)的別離純化。 幾種因素如pH、溫度、蛋白質(zhì)純度在測(cè)定各種蛋白質(zhì)的鹽析點(diǎn)時(shí)起著重要作用。選擇硫酸銨是因?yàn)樗哂幸恍﹥?yōu)良性質(zhì)，如鹽析的有效性、pH 范圍廣、溶解度高、溶解散熱少和

4、經(jīng)濟(jì)適用。硫酸銨濃度常以百分濃度表示。以 X%表示所要配制的溶液濃度，Xo%表示開始的溶液濃度，所需要的硫酸銨克數(shù)按以下公式計(jì)算：g=515 (X-Xo) / (100-0.27X ) (0C時(shí) 1L溶液，用量見附錄 3)大多數(shù)蛋白質(zhì)在 55% 硫酸銨中沉淀，獲得最大量蛋白質(zhì)沉淀是 85% 硫酸銨 溶液，以不含硫酸銨的 100mL 蛋白質(zhì)溶液為起始溶液，按以下操作步驟進(jìn)行鹽 析。三、步驟操作( 1) 將盛有蛋白質(zhì)溶液的燒杯放在另一裝有冰水的大燒杯內(nèi)，并置于磁力攪拌器上攪拌； 2 邊攪拌，邊徐徐參加 28.4g 硫酸銨至飽和，該步驟應(yīng)該在 5-10min 內(nèi)完成； 3 繼續(xù)攪拌 10-30min

5、 ；410000xg 離心 10min 或 3000xg 離心 30min ； 5 棄去上清液，將沉淀懸浮于 1-2 倍沉淀物體積的緩沖液中，殘留的不溶性物質(zhì)可能是變性蛋白，通過離心除去； 6 硫酸銨能夠通過透析、超濾或脫鹽柱除去；7得到純化后的a-淀粉酶，溶于20mL緩沖溶液；8紫外分光光度計(jì)測(cè)定a-淀粉酶的濃度；9測(cè)定a-淀粉酶的活性，與原酶液的活性進(jìn)行比擬。透析實(shí)驗(yàn)一 透析的原理透析是指溶質(zhì)從半透膜的一側(cè)透過膜至另一側(cè)的過程，任何天然的如腹膜或人造的 半透膜， 只要該膜含有使一定大小的溶質(zhì)通過的孔徑，那么這些溶質(zhì)就可以通過彌散和 對(duì)流從膜的一側(cè)移動(dòng)到膜的另一側(cè)。人體內(nèi)的毒物包括代謝產(chǎn)物，

6、藥物，外源性毒物，只要其原子量或分子量大小適宜，就 能夠通過透析去除體外。 其根本原理是彌散和對(duì)流。彌散就是半透膜兩側(cè)液體各自所含 溶質(zhì)濃度梯度及它所形成的不同滲透濃度， 溶質(zhì)從濃度高的一側(cè)通過半透膜向濃度低的 一側(cè)移動(dòng)。 對(duì)流也稱超濾， 是指溶質(zhì)和溶劑因透析膜兩側(cè)的靜水壓和滲透壓梯度的不同 而跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。二 透析袋的使用方法一 透析袋前處理方法如下：1. 把透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度 10-20cm 的小段。2. 在大體積的 2 W/V 碳酸氫鈉和 10mmol/L EDTAph8.0 中將透析袋煮沸 10 分3. 用蒸餾水徹底清洗透析袋。4. 放在 10mmol/L EDTAph8.0 中將之

7、煮沸 10 分鐘。5. 冷卻后，存放于四度，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。從此時(shí)起取用透析袋時(shí) 必須戴手套。二 透析除鹽1. 蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀別離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的方法是透析，即將 蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)常用的是玻璃紙，用緩沖溶液進(jìn)行透析，并不斷的更 換緩沖溶液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行。2. 0.02 mol/LPH7.4PBS 溶解蛋白質(zhì)沉淀至 10ml 裝入透析袋。3. 4 °C 下，對(duì) PBS 充分透析、換液 3 次，至萘氏試劑測(cè)透析外液無(wú)黃色，即無(wú) NH4+ 為止。4. 取透析袋內(nèi)樣品少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后， 以 751 型紫外分光光度計(jì)測(cè)

8、定蛋白質(zhì)含量。方法如下：蛋白質(zhì)含量 mg/ml =1.4 5XOD280nm-0.74XOD260nm樣品稀釋度。四、儀器 1 燒杯 2 磁力攪拌器和攪拌子 3 離心機(jī)和轉(zhuǎn)頭五、試劑 1 硫酸銨 2 用于懸浮沉淀物的緩沖液六、考前須知1 攪拌必須是有規(guī)那么的和溫和的。 攪拌太快將引起蛋白質(zhì)變性， 其變性特征 是起泡。用磁力攪拌器不明顯產(chǎn)熱，這一點(diǎn)也很重要。2大多數(shù)蛋白質(zhì)在鹽溶解后的前 20min沉淀，一些蛋白質(zhì)要經(jīng)數(shù)小時(shí)才能 完全沉淀。3 為了平衡硫酸銨溶解時(shí)產(chǎn)生的輕微酸化作用，沉淀反響至少在50mmol/L 緩沖液中進(jìn)行。4緩沖液應(yīng)該含有螯合劑如EDTA以除去硫酸銨中微量的重金屬離子，因?yàn)?

9、這些離子對(duì)目的蛋白質(zhì)是有害的。5 為確保獲得最大量沉淀，使用蛋白質(zhì)初始濃度至少為1mg/mL。6硫酸銨沉淀反響通常是貯存和穩(wěn)定蛋白質(zhì)的良好方法。7少數(shù)蛋白質(zhì)在硫酸銨濃度低于 24%時(shí)就產(chǎn)生沉淀，而大多數(shù)要在 80%以 上才能沉淀。在純化的初始階段，常利用蛋白質(zhì)在硫酸銨中溶解度的差異 別離蛋白質(zhì)。硫酸銨沉淀可除去 RNA和DNA。8在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)其溶解度降低，在此條件下，靜電的相互作用可導(dǎo)致蛋 白質(zhì)凝集和沉淀，在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，低濃度的硫酸銨就能沉淀蛋白質(zhì)。9在蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中，采用硫酸銨沉淀十分有效。七. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析酶活力測(cè)定中吸光度的1-9組測(cè)量結(jié)果硫酸銨沉淀法測(cè)酶活OD660平均值空

10、白10.4240.4180.4300.424空白20.4740.4670.4730.471空白30.4900.4970.5050.49710.4760.4800.4880.48120.4900.5010.4950.49530.4560.4460.4490.45040.4850.4910.4860.48750.4270.4360.4400.43460.4770.4730.4660.47270.4630.4700.4760.47080.4500.4500.4450.44890.4750.4810.4780.478酶濃度1-9組測(cè)定結(jié)果編號(hào)濃度mg/mlA28010.360.54420.360.48

11、330.280.37840.290.41050.160.23960.140.21070.160.24480.300.44290.210.284所以本組(7)的酶活力測(cè)定結(jié)果為0.11U，酶濃度為0.16 mg/ml常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價(jià)格廉價(jià)。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的能力很強(qiáng),其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。對(duì)酶沒有破壞作用pH 的控制：應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個(gè)方面考慮，在酶等電點(diǎn)時(shí)其溶解度最 小易沉淀，但有些酶再等電點(diǎn)時(shí)穩(wěn)定性較差， 因此要選擇最正確 pH 值.一般要求在 酶最穩(wěn)定的 pH 值的前提下再考慮最適宜酶沉淀的 pH 值。在操作中一旦確定最 佳 pH 值后，在添加硫

12、酸銨之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的 pH 值，要盡量防止溶液 pH 值的波動(dòng)以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時(shí)要注意攪拌，并注意硫酸銨 的參加速度，一般是由少到多，緩慢參加，硫酸銨盡可能磨成細(xì)粉。 溫度的控制： 有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好， 可在常溫下進(jìn)行鹽析操作， 而 對(duì)于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下操作。有機(jī)溶劑沉淀法別離純化a-淀粉酶一、 目的和要求1、了解保有蛋白質(zhì)活性的濃縮方法。2、掌握有機(jī)溶劑沉淀法濃縮 a- 淀粉酶的方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理將有機(jī)溶劑例如丙酮和乙醇參加蛋白質(zhì)溶液時(shí)，和高濃度鹽類似產(chǎn)生沉淀，這是因?yàn)樗鼈兡軌蚪档偷鞍踪|(zhì)的溶解度。在溫度為 10 C左右時(shí)蛋白質(zhì)在有機(jī)溶 劑中容易變

13、性，所以在沉淀時(shí)必須特別注意冷卻溶液和離心轉(zhuǎn)頭(0-4 C為佳)。有機(jī)溶劑的濃度按體積百分?jǐn)?shù)計(jì)算， 累加體積并不精確。 例如用簡(jiǎn)便的方法將100mL水溶液要配置成50%(v/v)乙醇溶液，就是向100mL水溶液加100mL 乙醇溶液。盡管最后總體積是192mL。大多數(shù)蛋白質(zhì)的分子量大于15kD，一般 用 50% 有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀。三、儀器(1)燒杯( 2)磁力攪拌器和攪拌子( 3)離心機(jī)和轉(zhuǎn)頭四、試劑(1)無(wú)水乙醇( 2)再懸浮沉淀的緩沖液五、 操作步驟(1) 在4 C下，向50mL蛋白質(zhì)溶液中緩緩參加 50mL丙酮或乙醇(冷卻至 -20 C),在冰水浴上持續(xù)溫和的攪拌；(2) 在冰水上持續(xù)攪

14、拌10-15min ;(3) 低溫離心 10000xg 10min ；(4) 除去上清液；(5) 用沉淀的2倍體積的冷緩沖液再使沉淀懸浮。實(shí)際上變性蛋白質(zhì)難于溶解，可用過濾或離心的方法除去；(6) 得到純化后的a-淀粉酶，溶于20mL緩沖溶液。(7) 紫外分光光度計(jì)測(cè)定a-淀粉酶的濃度，與原酶液的濃度進(jìn)行比擬。(8) 測(cè)定a-淀粉酶的活性，與原酶液的活性進(jìn)行比擬。六、考前須知(1) 酸性蛋白質(zhì)在二價(jià)陽(yáng)離子例如 Mg2+存在下，以復(fù)合物的形式較易被沉淀。(2) 大分子的蛋白質(zhì)及親水的蛋白質(zhì)往往在較低濃度的有機(jī)溶劑中就能析出。(3) 在溶液pH值接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度降低

15、。 七實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶活力測(cè)定中吸光度的1-9組測(cè)量結(jié)果有機(jī)溶劑沉淀酶活OD660平均值空白11.0121.0241.0211.019空白21.0831.0821.0831.083沉淀0.4490.4600.4580.45610.4130.4150.4130.41420.3150.3140.3200.31630.4660.4660.4670.46640.4840.4850.4840.48450.2610.2600.2570.25960.4900.4920.4880.49070.5160.5250.5160.51980.4330.4380.4340.43590.4960.4920.4950.494酶濃度1-9組測(cè)定結(jié)果編號(hào)濃度mg/mlA28010.120.17320.060.130.030.0640.210.3650.110.19660.