植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)

1、植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)摘要：本文簡(jiǎn)要介紹植物組織培養(yǎng)的基本原理和方法，綜述植物脫除病毒的熱處理、莖尖 培養(yǎng)和抗病毒藥劑3種方法的原理、發(fā)展史和技術(shù)方法，并介紹了幾種常用的病毒檢測(cè)方法。 同時(shí)還對(duì)植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)的應(yīng)用前景作了預(yù)測(cè)分析。關(guān)鍵詞：莖尖培養(yǎng)；組織培養(yǎng)；快繁脫毒技術(shù)；病毒檢測(cè)；應(yīng)用前景 正文：1植物組織培養(yǎng)研究概況1.1研究簡(jiǎn)史自從1943年懷特（white）提出植物細(xì)胞“全能性” （totipotency）學(xué)說及 諸多后學(xué)者（steward, 1958, guha和marteshwari, 1964）相繼證實(shí)后，引發(fā)植 物組織和細(xì)胞培養(yǎng)快繁技術(shù)的快速發(fā)展。我國(guó)的專家學(xué)者在20世

2、紀(jì)70年代后也 在此領(lǐng)域做了大量的研究和開發(fā)工作，創(chuàng)造了很多新方法、新技術(shù)，提出不少新 成果，開拓了植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的新局面。目前采用組織培養(yǎng)脫病毒快繁及 離體快繁生產(chǎn)株苗的技術(shù)已發(fā)展相當(dāng)成熟2。脫毒株苗具有無雜菌、適應(yīng)能力 較強(qiáng)、繁育較快、質(zhì)量?jī)?yōu)、抗性好、分藥性強(qiáng)、繁殖系數(shù)高、大批量生產(chǎn)、周年 供應(yīng)、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，已得到有關(guān)專家的鑒定及高度評(píng)價(jià)和種植試驗(yàn)區(qū)、種植 產(chǎn)區(qū)果農(nóng)的認(rèn)可。例如脫毒馬鈴薯、脫毒紅薯、脫毒生姜、脫毒大蒜、脫毒草莓、 脫毒苗木、脫毒花卉等，已成為現(xiàn)代農(nóng)民致富的新寵。1.2植物組織培養(yǎng)利脫毒快繁的定義植物組織培養(yǎng)（plant tissue culture）是指在無菌的條

3、件下，將離體的植物（根、 莖、葉、花、果實(shí)、種子等）、組織（形成層、花藥組織、胚乳、皮層等）、細(xì)胞 （體細(xì)胞和生殖細(xì)胞）以及原生質(zhì)體，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)?培養(yǎng)條件，使其長(zhǎng)成完整的植株。由于培養(yǎng)物是脫離植物母體，在玻璃瓶屮進(jìn)行 培養(yǎng)，所以也叫做離體培養(yǎng)。其完整過程是：脫分化再分化生長(zhǎng)外植體愈傷組 織生長(zhǎng)點(diǎn)或根莖葉完整植株發(fā)生胚狀體在有些情況下，再分化也可不經(jīng)愈傷組 織階段，而直接發(fā)生于脫分化的細(xì)胞。植物組織培養(yǎng)脫毒快繁是人工在無菌條件 下利用植物體的一部分，在人工控制的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件下繁殖植物，脫除病毒得 到無毒苗株，繼而在大田快速繁殖的技術(shù)。脫毒及離體快繁，這是目前植物組織

4、培養(yǎng)應(yīng)用最多、最廣泛和是有效的一個(gè)方面。主要是進(jìn)行莖尖培養(yǎng)脫除病毒。對(duì) 于脫毒苗、新育成、新引進(jìn)、稀缺良種、優(yōu)良單株、瀕危植物和基因工程植株等 可通過離體快速繁殖，同時(shí)可不受地區(qū)和氣候的影響，比傳統(tǒng)的繁殖方法快數(shù)萬 倍。植物組織培養(yǎng)已發(fā)展成為一門富有生命力的學(xué)科。追究植物組織培養(yǎng)脫毒快 繁技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史，在11世紀(jì)就岀現(xiàn)的熱處理脫毒法，最早解決一些作物的病 毒病害問題。20世紀(jì)50年代發(fā)展的植物組織培養(yǎng)技術(shù)為脫毒提供了一條有效途徑?，F(xiàn)在 植物的脫毒技術(shù)有多種，其中應(yīng)用最廣泛的有3種：熱處理法、莖尖培養(yǎng)脫毒法、 抗病毒藥劑法，將不同的方法相結(jié)合起來應(yīng)用效果更好，它們的脫毒原理各不相 同。2脫毒技

5、術(shù)及其原理2.1熱處理法2.1.1概述熱處理法是利用病毒和寄主植物對(duì)高溫的忍耐性的差異，使植物的生長(zhǎng)速度 超過病毒的擴(kuò)散速度，得到一小部分不含病毒的植物分生組織，然后進(jìn)行無毒個(gè) 體培育。熱處理法屮，最主要的影響因素是溫度和時(shí)間。熱處理可通過熱水浸泡 或濕熱空氣進(jìn)行。熱水浸泡對(duì)休眠芽效果較好，濕熱空氣對(duì)活躍生長(zhǎng)的莖尖效果 較好，既能消除病毒又能使寄主植物有較高的存活機(jī)會(huì)。熱空氣處理比較容易進(jìn) 行，把吒盛生長(zhǎng)的植物移入到1個(gè)熱療室中，在3540°c下處理一段時(shí)間即可，處理時(shí)間的長(zhǎng)短，可由兒分鐘到數(shù)月不等4。 熱處理的方法有恒溫處理和變溫處理，處理的材料可以是植株，也可以是接穗。 2.1.

6、2原理熱處理脫毒是根據(jù)病毒與寄生細(xì)胞對(duì)高溫的忍耐程度不同，選擇適當(dāng)?shù)臏囟?和處理時(shí)間，植物組織中的很多病毒被部分地或完全地鈍化而可控制其的活動(dòng)， 但很少傷害甚至不傷害寄主組織，從而讓植物細(xì)胞加快生長(zhǎng)，使生長(zhǎng)點(diǎn)附近不帶 病毒，從而達(dá)到脫毒的目的。2.1.3簡(jiǎn)史用熱處理脫除馬鈴薯卷葉病毒（plrv）是世界上脫除已知病毒最早的例子。 早在1889年，印度尼四亞爪哇人就把繁殖用的甘蔗切斷放在50°c左右的熱水中 浸泡30min來防止枯萎?。ìF(xiàn)已知是病毒?。┑陌l(fā)生?，F(xiàn)在世界許多國(guó)家在種植 前仍使用這種方法處理甘蔗。但是后來人們發(fā)現(xiàn)熱水對(duì)植物的傷害大，bake （1972）研究表明在熱水處理中，

7、由于植物組織經(jīng)過淋洗，在水中長(zhǎng)期浸泡常常 會(huì)窒息死亡，并且這種處理也會(huì)打破或延長(zhǎng)植物的休眠期。所以現(xiàn)在更常用的方 法是將病毒感染的植物用3538°c熱空氣處理1428（1或者更長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行 脫毒4。此法尤其適合處理生理干旱的材料和處于休眠狀態(tài)的果樹。熱處理脫 毒法已應(yīng)用多年，被世界多個(gè)國(guó)家利用。該項(xiàng)技術(shù)要求的設(shè)備條件比較簡(jiǎn)單，脫 毒操作也比較容易。主要缺點(diǎn)是脫毒時(shí)間長(zhǎng)，脫毒不完全，例如tmv這類桿狀 病毒就不能用這種方法脫除，因而該方法有一定的局限性。2.2莖尖培養(yǎng)脫毒法2.2.1概述莖尖培養(yǎng)脫毒就是采取莖尖分生組織離體培養(yǎng)的方法獲取無病毒試管苗，其 方法是在解剖鏡下，用鋒利的解剖刀進(jìn)

8、行迅速準(zhǔn)確地莖尖剝離，因?yàn)榍o尖分生組 織基本不帶病毒，利用植物莖尖分生組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，再結(jié)合病毒檢測(cè)，就可 以獲得無病毒的植株。莖尖培養(yǎng)中最主要的影響因素就是切取莖尖的大小，一般 要求莖尖長(zhǎng)度小于1mm。技術(shù)上通常切取莖尖越小，脫毒效果越好，但是莖尖 培養(yǎng)成活率變低。曹為玉等研究發(fā)現(xiàn)葡萄莖尖長(zhǎng)度與存活率成正相關(guān)，與脫毒率 成反相關(guān)。當(dāng)切取莖尖長(zhǎng)度為0.20.3mm時(shí)，存活率為21%38%,脫毒 率為91.4%97%；當(dāng)切取0.5mm以上時(shí)，存活率為75%83%,脫毒率僅 為70.6%76.5%。莖尖培養(yǎng)脫毒法脫毒率高，脫毒速度快，能在較短的時(shí) 間內(nèi)得到較多的原種繁殖材料，但這種方法存在的缺點(diǎn)

9、是植物的存活率低。為了 克服這一缺點(diǎn)，現(xiàn)在經(jīng)常是將莖尖培養(yǎng)與熱處理相結(jié)合來使用。莖尖培養(yǎng)與熱處 理相結(jié)合之所以能夠提高脫毒效果，是由于熱處理可使植物生長(zhǎng)本身所具有的頂 端免疫區(qū)得以擴(kuò)大，有利于切取較大的莖尖(在1mm左右)，從而能夠提高培養(yǎng) 或嫁接的成活率。如大櫻桃置于45°c的恒溫培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)35d,再切取0.2 0.4mm的莖尖培養(yǎng)，平均脫毒率為98%o2.2.2原理莖尖培養(yǎng)脫毒的原理是植物體內(nèi)病毒靠維管束系統(tǒng)移動(dòng)，分生組織中沒有維 管束存在，病毒只靠胞間連絲移動(dòng)，速度很慢，難以追上生長(zhǎng)活躍的分生組織， 所以旺盛生長(zhǎng)的根尖、莖尖一般都無病毒或很少有病毒分布。2.2.3簡(jiǎn)史whi

10、te于1943年首先發(fā)現(xiàn)在感染煙草花葉病毒的煙草生長(zhǎng)點(diǎn)附近病毒的濃 度很低，甚至沒有病毒。這一發(fā)現(xiàn)為莖尖培養(yǎng)脫除病毒提供了理論依據(jù)。懷特 (white, 1934)在體外培養(yǎng)感染了 tmv病毒的馬鈴薯根，并用枯斑寄主法測(cè) 定了根不同部位的病毒含量，發(fā)現(xiàn)根尖部位的病毒含量比其他部位少，甚至不存 在病毒。morel等1952年首先從感染了花葉病毒和斑萎病毒的大麗花植株上切 取莖尖，通過組織培養(yǎng)獲得了無病毒的大麗花，證明了前人假設(shè)的正確性。此后, 人們采用莖尖培養(yǎng)技術(shù)相繼獲得了多種植物的無病毒植株?，F(xiàn)在莖尖培養(yǎng)脫毒法 已經(jīng)成為植物無毒苗生產(chǎn)屮應(yīng)用最廣泛的一種方法。據(jù)研究，植物體內(nèi)某一部分 組織器官不

11、帶病毒的原因是：分生組織的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，病毒在植物體內(nèi)繁殖 的速度相對(duì)較慢，而且病毒的傳播是靠篩管組織進(jìn)行轉(zhuǎn)移或通過細(xì)胞間連絲傳遞 給其他細(xì)胞，因此病毒的傳遞擴(kuò)散也受到一定限制，這樣便造成植物體的部分組 織細(xì)胞沒有病毒。根據(jù)這個(gè)原理，可以利用莖尖培養(yǎng)來培育無病毒苗木。2.3抗病毒藥劑法2.3.1概述抗病毒藥劑法，這是一種新的脫毒方法，運(yùn)用一些抗病藥劑的作用影響病毒 rna的復(fù)制形成，干擾病毒的正常生長(zhǎng)，從而達(dá)到除去病毒的目的。常用的抗 病毒化學(xué)藥物有三氮呼核昔(病毒卩坐)，5二氫尿卩密旋(dht)和雙乙酰二氫亠 氮尿卩密唳(da-dht)o這些藥物常常通過直接注射到帶病毒的植株上，或者加 到

12、植株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上。這種方法一般要與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合應(yīng)用。經(jīng)過抗病毒藥 劑處理的嫩莖，切取莖尖，再進(jìn)行組織培養(yǎng)，就會(huì)提高脫毒率和成活率。采用病毒抑制劑與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒方法，可以較容易的脫 除多種病毒，而且這種方法對(duì)取材要求不嚴(yán)，接種莖尖可大于1mm,易于分化 出苗，提高存活率。2.3.2原理抗病毒藥劑法的作用原理是抗病毒藥劑在三磷酸狀態(tài)下會(huì)阻止病毒rna帽 子結(jié)構(gòu)形成而達(dá)到除去病毒的效果。2.3.3簡(jiǎn)史羅曉芳等于1996年曾在培養(yǎng)基屮加入病毒卩坐,脫除了 2種蘋果潛隱病毒1。 除了以上3種脫毒方法以外，花藥培養(yǎng)法、莖尖嫁接脫毒、愈傷組織培養(yǎng)法、胚 珠培養(yǎng)法也可用于植物組織培養(yǎng)快繁脫毒。3脫

13、毒效果的檢測(cè)方法經(jīng)過脫毒處理的植株是否還存在病毒，必須經(jīng)過病毒學(xué)檢測(cè)才能確定?？煽?的病毒檢測(cè)方法與建立有效的脫毒方法同等重要。傳統(tǒng)上一直沿用的檢測(cè)方法是 目測(cè)法，但是這種方法無法剔除潛隱性病毒。后來出現(xiàn)的指示植物法，擴(kuò)大了檢 測(cè)范圍。近年來隨著生物科學(xué)的快速發(fā)展，免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等許多 先進(jìn)的理化技術(shù)的應(yīng)用，促進(jìn)了病毒檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)與發(fā)展。下面簡(jiǎn)要介紹幾種 檢測(cè)脫毒苗的方法。3.1植株直接測(cè)定法直接觀察植株莖葉有無某種病毒引起的可見癥狀，是最簡(jiǎn)單的測(cè)定方法。不 過，由于某些寄主植物感染病毒后需要較長(zhǎng)的時(shí)間才出現(xiàn)癥狀，有的并不能使寄 主植物出現(xiàn)可見的癥狀，因而無法快速檢驗(yàn)。3.2指示

14、植物法此法最早是美國(guó)的病毒學(xué)家holmes 1929年發(fā)現(xiàn)的。利用病毒在其他植物上 出現(xiàn)癥狀的特征，作為鑒別種類的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)原始寄主的癥狀不明顯時(shí)，就可用指 示植物法，這是因?yàn)橹甘局参锉仍技闹鞲菀妆憩F(xiàn)癥狀。具體做法是將病葉研 磨,把汁液接種到寄主植物上，對(duì)于木木植物，是將原始寄主嫁接到指示植物上。 指示植物法簡(jiǎn)便易行，成本低，但它靈敏性差，所需時(shí)間長(zhǎng)，難以區(qū)分病毒種類。 3.3血清學(xué)方法抗血清鑒定法要進(jìn)行抗原的制備(包括病毒的繁殖，病葉研磨和粗汁液澄清 等)，抗血清的采收、分離等。血清可分裝到小玻璃瓶屮，貯存在15-25°c 的冰凍條件下。測(cè)定時(shí)，把稀釋的抗血清與未知的病毒植物在小

15、試管內(nèi)混合，這 一反應(yīng)導(dǎo)致形成可見的沉淀，然后根據(jù)沉淀反應(yīng)來鑒定病毒。此法靈皺度高，獲 得檢測(cè)結(jié)果迅速，是目前檢測(cè)病毒的一種最好方法。此外，pcr微量板雜交法5、 蛋白質(zhì)電泳法、嫁接檢測(cè)法、電子顯微鏡檢定法、病毒癥狀學(xué)診斷法等也可以 用來檢測(cè)植物病毒。4植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)應(yīng)用前景的簡(jiǎn)述植物組織培養(yǎng)技術(shù)在作物上主要用于育種和良種繁殖，其次用于無性繁殖作 物的脫毒和快繁以及種質(zhì)的保存等，可見植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)對(duì)于農(nóng)作物 苗木的生產(chǎn)具有極其重要的地位。一些農(nóng)作物或是花卉植物等因長(zhǎng)期的栽培和種 植，植物體內(nèi)被侵染攜帶病毒、種性退化現(xiàn)在能利用組織培養(yǎng)及快繁脫毒方法開 發(fā)出的植物脫毒新品種有馬鈴薯、甘薯、生姜、大蒜、草莓