蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表達(dá)及活性鑒定【大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文設(shè)計精選】

1、臨床醫(yī)學(xué)論文蛋白酪氨酸磷酸酯酶4a2基因的克隆表達(dá)及活性鑒定作者:程超，郭愛林，巫國勇，吳偉康 羅紅鶴，鐘佛添【摘要】 【目的】獲取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4a2 (ptp4a2)基因并高效表 達(dá)純化，對于產(chǎn)物的體外活性進(jìn)行測定。【方法】用rt-pcr技術(shù)，從肝癌細(xì)胞 系hepg2的總rna中，獲得編碼ptp4a2基因功能片段的dna。測序后，通過酶 切亞克隆至表迖載體pgex4t2，構(gòu)建重組表迖載體，并導(dǎo)入大腸桿菌e.coli bl21中，iptg誘導(dǎo)表達(dá)重組的gst融合蛋白。對重組融合蛋白過谷胱廿肽瓊脂 糖柱進(jìn)行純化，western印記進(jìn)行鑒定，質(zhì)譜檢測蛋白分子量。通過其對底物磷 酸多肽的去磷

2、酸化反應(yīng)，鑒定其活性?！窘Y(jié)果】獲得編碼肝癌細(xì)胞ptp4a2 (全 長氨基酸)的基因序列，測序結(jié)果與已發(fā)表的基因序列相一致。重組gst融合蛋 白經(jīng)western分析，在相對分子質(zhì)量mr二45 000處，有特異的蛋白條帶。重組蛋 口經(jīng)谷胱廿肽瓊脂糖柱進(jìn)行純化后，得到了高純度的融合蛋口，質(zhì)譜檢測其分子 量為45 470.6。底物多肽去磷酸化反應(yīng)表明純化產(chǎn)物具有較強(qiáng)活性?！窘Y(jié)論】成 功克隆人ptp4a2基因，并在e.coli bl21中高效表達(dá)，親和層析后獲得高純度 gst融合蛋白，質(zhì)譜檢測分子量與預(yù)期結(jié)果一致，純化產(chǎn)物具有蛋白磷酸酯酶活 性?！娟P(guān)鍵詞】蛋白酪氨酸磷酸酯酶；基因克??；表達(dá)；純化；質(zhì)譜j

3、 sun yat-sen univ(med sci), 2007, 28(2):137-141酪氨酸蛋白磷酸酯酶對細(xì)胞生長、分化、代謝、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞骨架等有重要的調(diào)節(jié)功 能。它特異性地催化蛋白質(zhì)酪氨酸殘基上脫磷酸反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸 殘基的磷酸化程度1。酪氨酸蛋白磷酸酯酶除催化結(jié)構(gòu)域外，還包括亞細(xì)胞定 位結(jié)構(gòu)域及底物識別和調(diào)控結(jié)構(gòu)域2。酪氨酸蛋白磷酸酯酶4a2 (protein tyrosine phosphatase type 1va2，ptp4a2)，又名肝細(xì)胞再生磷酸酯嗨 2(phosphatase of regenerating liver 2, prl-2)，是一類新發(fā)

4、現(xiàn)的小分子酪 氨酸蛋白磷酸酯酶，包括ptp4a1，ptp4a2 ，ptp4a3。它們參與了細(xì)胞生長的調(diào) 控3，增殖4，細(xì)胞的浸潤和腫瘤的轉(zhuǎn)移5。ptp4a2與腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化 密切相關(guān)，很有可能是一種癌基因6。為了進(jìn)一步硏究ptp4a2的功能，制備相 應(yīng)抗體及尋找抗腫瘤藥物，我們嘗試克降并表達(dá)ptp4a2基因，對于表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 了純化和活性鑒定。1 材料和方法1.1材料和試劑肝癌細(xì)胞系hepg2本教硏室保存寡聚核昔酸引物由上海生工公司合成；rna 提取試劑trizol購自美國gibco公司;pgex4t-2質(zhì)粒購自瑞典pharmacia公司； pgem t easy載體、rt-pcr試劑盒及

5、t vector試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶、連 接酶及taqdna聚合酶均為美國promeca公司產(chǎn)品；dna酶和高純質(zhì)粒提取試劑 盒為徳國qiagen公司產(chǎn)品；iptg , dtt , dte，胱胺、谷胱甘肽瓊脂糖及還原 性谷胱甘肽，色譜級乙睛，色譜級去離子水，三氟乙酸，芥子酸均為sigma公 司產(chǎn)品;去磷酸化底物多肽r-r-l-1-e-d-a-e-py-a-a-r-g，美國ub1公司產(chǎn)品， 抗gst抗體及western試劑盒購自美國neb公司，蛋白marker購自珠海百奧生 物技術(shù)有限公司。其余一般化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。表面增強(qiáng)激光解吸電離質(zhì) 譜儀(seldi-tof-ms) pbsii及

6、金質(zhì)芯片，美國ciphergen公司制造。1.2 rna的抽提棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，流干。加入適量trizol裂解細(xì)胞，在冰上放置5 min ；將裂解產(chǎn)物分裝到1.5ml的eppendof管中，再加入200 ul的氯仿,混勻、 冰上放置5 min ； 1 200 x g離心15 min ?吸上清液于另一離心管中，加入等體 積的異丙醇，冰上放置15 min ° 1 200 x g離心15 min，沉淀rna去上清，體 積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀，室溫風(fēng)干，加depc處理雙蒸水溶解。10 g/l瓊脂糖 凝膠檢測質(zhì)量，隨后用紫外分光光度計測定rna的濃度和純度，置于70 °c冰箱

7、中備用。13 ptp4a2基因的擴(kuò)增以提取的rna為模板進(jìn)行rt-pcr ,擴(kuò)增ptp4a2全長的c dna編碼片段，引 物序列如下-5 '端引物:ggat ccatgaaccgtccagccc，3 '端引物:ctcgagctactgaac acagcaatgcc。48 °c 50 min 反轉(zhuǎn)錄。首先于 94 °c變性 5 min ；然后 92 °c， 30 s ； 56 °c，30 s ； 72 °c，60s共循環(huán)30次；最后1次循環(huán)完成后于72 °c 延伸5 min °1.4 rt-pcr產(chǎn)物的克隆與鑒

8、定回收rt-pcr產(chǎn)物,與質(zhì)粒pgem t easy進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)dh5 a , 挑取白色菌落進(jìn)行甌切鑒定，所獲陽性克隆命名為pgem ptp4a2,送至上海生工 公司進(jìn)行測序。經(jīng)bamh i , xho i雙嗨切后與經(jīng)同樣嗨切的pgex-4t-2進(jìn)行連 接反應(yīng)，挑選的陽性克隆命名為pgex ptp4a2。1.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)工程菌在含氨節(jié)青霉素(100 m g /l)的lb培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按10 %的 接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)接，250 r/min，37 °c搖菌至a600=1.0，加入異丙基硫代半乳糖 昔(iptg)至終濃度為0.5 mmol/l，37 °c繼續(xù)通

9、氣培養(yǎng)45 h。取1.5 ml 菌液,10 000 xg離心30 s收集菌體，菌體加入h20 60 “l(fā)，劇烈振蕩混勻， 再加入 4x 樣品緩沖液 2 0 “l(fā)，100 °c，5min ； 10 oooxg 離心 5 min ； 120 g/l sds-page電泳檢測，預(yù)計相對分子質(zhì)量mi= 45 000處有明顯的蛋白表達(dá)。大 規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，誘導(dǎo)表達(dá)日的蛋白，收集菌體，超聲破菌。離心后將上清和沉淀 分別制樣，進(jìn)行sds-page。可溶的目的蛋白直接應(yīng)用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析 柱進(jìn)行親和層析純化以包涵體形式存在的表達(dá)產(chǎn)物。n 十二烷基肌氨酸鈉將沉淀 蛋白質(zhì)變性過夜，經(jīng)緩慢透析去除n十

10、二烷基肌氨酸鈉，令蛋白復(fù)性后，用谷 胱甘肽瓊脂糖親和層析柱對目的蛋白進(jìn)行親和層析純化?？筭st抗體及western 試劑盒購自美國neb公司。16 表達(dá)產(chǎn)物的親和層析將10 ml glutathione sepharose 4b加入柱子中，用10倍體積的pbs洗 去保護(hù)液至柱體平衡，柱體平衡后，分別加入15 ml的表達(dá)液(調(diào)節(jié)流量為0.15 ml/ mm過柱,uv280 nm、uv215 nm監(jiān)測洗脫、吸附情況)，使蛋白質(zhì)充分吸附。pbs洗滌層析柱至重新平衡，將pbs更換為超純水洗柱至將口的蛋白洗出。1.7 表達(dá)產(chǎn)物的western印記鑒定將gst-prl-2融合蛋白、表達(dá)空載體純化的gst蛋

11、白變性后，經(jīng)150 g/l sds-page分離蛋白質(zhì)，并電轉(zhuǎn)移至pvdf膜上。依次滴加兔抗gst抗體及hrp標(biāo) 記的羊抗兔抗體，最后以ecl試劑盒顯影。1.8 回收蛋白的seldi質(zhì)譜鑒定將基質(zhì)芥子酸溶解于色譜級水：乙膳=1 : 1且含體積分?jǐn)?shù)0.5%三氟乙酸 的溶液，制成飽和溶液。親和層析回收的蛋白質(zhì)100 ?滋1冷凍干燥后，溶解于 20 ?滋l體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的色譜級水中。取2 ul基質(zhì)和2 ul樣品充分 混合，加2 ul混合液于芯片靶上，自然干燥后，推入離子源待測。儀器參數(shù)設(shè) 置如下：激光強(qiáng)度200，檢測器靈敏度10，質(zhì)量聚焦45 000，分子量檢測范圍 40 00050 00

12、0 信號累加次數(shù)40次。19 純化產(chǎn)物的體外活性測定采用磷酸酶消化法鑒定gst-ptp4a2蛋白的活性。將純化的gst融合蛋白制 成磷酸酶消化反應(yīng)液（0.5 g/l融合蛋白，25 nunol/l咪哩鹽酸，ph 7.0，1 ml/l 二疏基乙醇）。取50 ?滋1磷酸酶消化反應(yīng)液，加入磷酸化底物多肽至終濃度0.2 mmol/l，30 °c反應(yīng)60 min '加入200 ?滋mol/l軌酸鈉終止反應(yīng)。取2 ul反應(yīng)液seldi質(zhì)譜檢測底物多肽去磷酸化情況。21ptp4a2基因的擴(kuò)增及序列測定rt-pcr擴(kuò)增ptp4a2編碼區(qū)的全長cdna序列，得到504 bp的片段（圖1）。挑取含

13、插入片段的陽性克隆pgem ptp4a2，用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測 序結(jié)果表明所擴(kuò)增的ptp4a2與genebank公布的序列相符。22表達(dá)載體的構(gòu)建pgem ptp4a2經(jīng)bamh i、xho i雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的pgex-4t-2進(jìn)行連 接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選的克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，10 g/l瓊脂糖電泳 顯示約4 900 bp大小片段的載體片斷和約500 bp的目的基因（圖1 ）。陽性克 隆命名為pgex ptp4a2。23重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與純化將pgex ptp4a2轉(zhuǎn)化入e.coli bl21 iptg誘導(dǎo)，sdspage電泳表明工程 菌表達(dá)了相應(yīng)分子質(zhì)量

14、的谷光甘肽s轉(zhuǎn)移酯（glutathion s transferase,gst） 與ptp4a2的融合蛋白，即gst-ptp4a2 （圖2 ）。對菌體總蛋白上清和沉淀蛋白 分別進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)gst融合蛋白主要位于不溶的包涵體中，對包涵體蛋 白用n十二烷基肌氨酸鈉變性處理過夜，經(jīng)緩慢透析除去n十二烷基肌氨酸 鈉，蛋白復(fù)性后，經(jīng)過谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化，得到血心45000的口 的蛋白（圖2）。2.4 western日j記鑒定表達(dá)蛋白由于表達(dá)蛋白為融合蛋白，含gst蛋白序列，故可應(yīng)用抗gst抗體檢測蛋白 表達(dá)。western blot檢測可見空載體組僅有g(shù)st表達(dá)條帶，誘導(dǎo)前組隱約可見 含gs

15、t蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)后組可見融合蛋白和gst蛋白表達(dá)條帶，純化后組可見 明顯的融合蛋白表達(dá)條帶和明顯減弱的gst表達(dá)條帶（圖3）。上述結(jié)果表明 gst-prl-2融合蛋白在大腸桿菌中得到成功表達(dá)，經(jīng)親和層析后獲得純度較高的 融合蛋白。2.5 質(zhì)譜鑒定回收蛋白將融合蛋白在芥子酸中進(jìn)行selditofms分析，在40 000 50 000之間 只山現(xiàn)1個明顯的譜峰淇核質(zhì)比為45 470.6，與融合蛋白的理論分子量45419.8 相當(dāng)，表明該純化蛋白即為gst與ptp4a2的融合蛋白（圖4）。2.6 融合蛋白活性檢測去磷酸化底物多肽r-r-l-1-e-d-a-e-py-a-a-r-g是酪氨酸蛋白磷酸酯酶

16、的 通用底物，其血為1 599.8 當(dāng)被酪氨酸蛋白磷酸酯酌水解后，失去磷酸基， mt二1 519.7。將與gstptp4a2作用的反應(yīng)液應(yīng)用質(zhì)譜檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液中 出現(xiàn)mr為1 599.8和1 5197的兩個多肽峰，表明gst-ptp4a2在體外具有酪氨 酸蛋白磷酸酯酶活性（圖5）。3 討論在過去的兒年中，一類新的酪氨酸蛋白磷酸酯酶ptp4a被鑒定，它們包括三 個成員：ptp4a1 , ptp4a2 , ptp4a3。盡管ptp4a在活化位點(diǎn)具有酪氨酸蛋白磷 酸酯酶的特征性基序：i/v（hcxagxxr）s/t，它們的氨基酸序列與以前發(fā)現(xiàn)的酪氨 酸蛋白磷酸酯嗨明顯不同。它們的分子量僅有22

17、 000左右，在竣基端具有一個 法尼基化的基序caax。在體外它們均可被法尼基轉(zhuǎn)移嗨催化，在竣基端半胱氨 酸殘基上加上法尼基。在體內(nèi)ptp4a2可以被異戊烯化4。ptp4a2與ptp4a1和 ptp4a3氨基酸同源性分別為87%和75%。在正常組織中ptp4a2僅在骨骼肌中 表達(dá)4，但是，其在肝癌，前列腺癌，肺癌和乳腺癌以及淋巴瘤中均有異常高 表達(dá)7,8，其可以通過抑制細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21的活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。g 前發(fā)現(xiàn) ptp4a2 的作用蛋白為 geranyl geranyl transferase ii (ggth )，通過 調(diào)節(jié)ggtii的磷酸化影響ggtii的功能9。對于ptp4a

18、2的深入硏究對于闡明細(xì) 胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控以及開發(fā)新的抗腫瘤藥物均具有重要意義。我們成功地表達(dá)了 gst-ptp4a2融合蛋白，它位于包涵體中，工程菌經(jīng)超聲 破菌，離心后用n十二烷基肌氨酸鈉對包涵體蛋白變性。n十二烷基肌氨酸鈉 是一種溫和的陰離子去垢劑，可溶解許多包涵蛋白。當(dāng)用透析或?qū)游鰧⑺鼜牡?白質(zhì)中去除時，即可使蛋白質(zhì)復(fù)性。n十二烷基肌氨酸鈉處理變性的 gst-ptp4a2包涵體蛋白，經(jīng)緩慢透析降低n 十二烷基肌氨酸鈉濃度后，蛋白得 到很好的復(fù)性，過谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化后，得到45 000的目的蛋白。 實驗證明該方法是一種有效地純化包涵體蛋白的方法。表面增強(qiáng)/基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時

19、間質(zhì)譜(seldi tof)是近年發(fā)展起 來的一種“軟電離”質(zhì)譜技術(shù)，具有樣品不易裂解、分子離子峰強(qiáng)、靈敏度高等 特點(diǎn)。該技術(shù)整合了芯片和質(zhì)譜技術(shù)，將蛋白質(zhì)樣品的制備、生化反應(yīng)和檢測分 析等過程集成在芯片上進(jìn)行，具有操作簡單，快速，樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)10。我 們應(yīng)用該技術(shù)檢測純化后-的融合蛋白，僅用1 h時便獲得了結(jié)呆，檢測結(jié)果與理 論計算結(jié)果僅僅相差不到01%，表明質(zhì)譜技術(shù)是一種高精確度的質(zhì)量檢測技術(shù)， 在生物檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。磷酸酯酶活性的檢測始終是一個難題，過去的檢測方法主要通過檢測游離磷 酸根的方法檢測其水解活性。該方法靈敏度和特異性較低，很少有人使用。對于 磷酸化蛋白的檢測是質(zhì)

20、譜的一個重要應(yīng)用領(lǐng)域。我們將質(zhì)譜應(yīng)用于磷酸酯酶活性 的定性檢測。去磷酸化的底物多肽由于失去一個磷酸根，因此在相對分子量上比 原先減小80，這種差別應(yīng)用質(zhì)譜很容易檢測山來。同時我們采用咪畔鹽酸緩沖 液作為溶劑，不加任何金屬鹽離子，使之更適合于質(zhì)譜檢測。檢測結(jié)果表明純化 的gst-ptp4a2蛋白在體外具有酪氨酸蛋白磷酸酯酶活性。質(zhì)譜法檢測磷酸酯酶 活性具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，口前我們正在嘗試將之應(yīng)用于酪氨酸蛋白磷酸酯酶活 性的定量硏究，使之獲得更廣泛的應(yīng)用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】ostman a, hellberg c, bobmer f d. protein-tyrosine phosphatases an

21、d canccrj. rev cancer, 2006,6(4):307-320.zhang z y functional studies of protein tyrosine phosphatases with chemical approaches j. biochim biophys acta. 2005,1754(1-2):100-107.sallee j l, w1ttchen e s, burr1dge k regulation of cell adhesion by protein-tyrosine phosphatases: ii. cel 1-cel 1 adhesionj

22、.j biolchem,2006,281(24):16189-16192.zeng q, hong w, tan y h, et al. mouse prl-2 and prl-3, two potentially prenylated protein tyrosine phosphatases homologous to prl1j biochem biophys res commun, 1998, 244(2): 421-427.saha s, bardelli a, buckhau p, et al. phosphatase associated with metastasis of colorectal cancerj. science, 2001, 294(5545):1343-1346.zeng q, dong j