1PCR技術(shù)及臨床應(yīng)用、新冠病毒核酸檢測(cè)原理

1、.1PCRPCR技術(shù)及臨床應(yīng)用、新冠病毒技術(shù)及臨床應(yīng)用、新冠病毒核酸檢測(cè)原理核酸檢測(cè)原理 授課人：劉翔宇授課人：劉翔宇.2目目 錄錄核酸基本知識(shí)核酸基本知識(shí)PCRPCR的發(fā)展史的發(fā)展史PCRPCR技術(shù)簡(jiǎn)介技術(shù)簡(jiǎn)介實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)熒光熒光PCRPCR技術(shù)技術(shù)實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)熒光熒光PCRPCR的臨床應(yīng)用的臨床應(yīng)用新冠病毒核酸檢測(cè)原理新冠病毒核酸檢測(cè)原理.3一、核酸基本知識(shí)一、核酸基本知識(shí) 核酸：生物貯存遺傳信息物質(zhì)的大分子，是生命的直接標(biāo)核酸：生物貯存遺傳信息物質(zhì)的大分子，是生命的直接標(biāo)志志 核酸的分類：脫氧核糖核酸（核酸的分類：脫氧核糖核酸（DNADNA），核糖核酸（），核糖核酸（RNARNA）。）。DNAD

2、NA和和RNARNA的區(qū)別在于：的區(qū)別在于：DNADNA所含的戊糖為脫氧核糖，而所含的戊糖為脫氧核糖，而RNARNA所含的戊糖為核糖；在堿基成分中，所含的戊糖為核糖；在堿基成分中，DNADNA含胸腺嘧啶含胸腺嘧啶T T，而，而RNARNA含脲嘧啶含脲嘧啶U U。 核苷酸：是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位，核酸水解首先得到的是核苷酸：是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位，核酸水解首先得到的是單核苷酸，后者可進(jìn)一步水解為核苷和磷酸，核苷可進(jìn)一單核苷酸，后者可進(jìn)一步水解為核苷和磷酸，核苷可進(jìn)一步水解為戊糖（核糖和脫氧核糖），和含氮堿基（嘌呤堿步水解為戊糖（核糖和脫氧核糖），和含氮堿基（嘌呤堿和嘧啶堿）。和嘧啶堿）。 .4核酸的

3、基本結(jié)構(gòu)核酸的基本結(jié)構(gòu).5遺傳信息傳遞的中心法則遺傳信息傳遞的中心法則.6DNADNA的復(fù)制：能在酶的作用下解鏈，根據(jù)堿基互補(bǔ)的復(fù)制：能在酶的作用下解鏈，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則進(jìn)行半保留復(fù)制。配對(duì)的原則進(jìn)行半保留復(fù)制。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction,PCRReaction,PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNADNA片片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊殊DNADNA復(fù)制，復(fù)制，PCRPCR的最大特點(diǎn)是能將微量的的最大特點(diǎn)是能將微量

4、的DNADNA大幅大幅增加。增加。.7二、二、PCRPCR的發(fā)展史的發(fā)展史19531953年，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了年，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了DNADNA雙螺旋的結(jié)構(gòu)，雙螺旋的結(jié)構(gòu)，開啟了分子生物學(xué)時(shí)代，極大地推動(dòng)了核酸生物開啟了分子生物學(xué)時(shí)代，極大地推動(dòng)了核酸生物化學(xué)化學(xué), ,分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)等各類生命科學(xué)的分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)等各類生命科學(xué)的迅速發(fā)展。迅速發(fā)展。 19851985年美國(guó)年美國(guó)PE-CetusPE-Cetus公司人類遺傳研究室的公司人類遺傳研究室的Mullis Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。19881988年初，年初

5、，KeohanogKeohanog改用改用T4 DNAT4 DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行PCRPCR，其擴(kuò)增的其擴(kuò)增的DNADNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種期望的一種DNADNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。酶。 .819881988年年Saiki Saiki 等從溫泉中分離的一等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌株水生嗜熱桿菌(thermus (thermus aquaticus) aquaticus) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱DNADNA聚合酶，此酶的發(fā)現(xiàn)使聚合酶，此酶的發(fā)現(xiàn)使PCRPCR廣泛的被廣泛的被應(yīng)

6、用。應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR技術(shù)于技術(shù)于19961996年由年由美國(guó)美國(guó)Applied BiosystemsApplied Biosystems公司推出，公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCRPCR從定性到從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)定量的飛躍，而且與常規(guī)PCRPCR相比，相比，它具有特異性更強(qiáng)、它具有特異性更強(qiáng)、PCRPCR污染少、自污染少、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。泛應(yīng)用。.9第一代：手動(dòng)第一代：手動(dòng)/ /機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增增用三個(gè)恒溫水浴箱，分別將三個(gè)水浴溫度恒定在用三個(gè)恒溫水浴箱，分別

7、將三個(gè)水浴溫度恒定在三個(gè)溫度：三個(gè)溫度：PCRPCR的高溫變性溫度（如的高溫變性溫度（如9494）低溫復(fù)）低溫復(fù)性溫度（如性溫度（如5858），適溫延伸溫度（如），適溫延伸溫度（如7272）。）。再用一個(gè)裝有再用一個(gè)裝有PCRPCR標(biāo)本試管的提籃，用手工在不同標(biāo)本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴。溫度的水浴箱中依次水浴。這種方法的特點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)人員勞動(dòng)強(qiáng)度大，容易這種方法的特點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)人員勞動(dòng)強(qiáng)度大，容易因疲勞引起差錯(cuò)；而優(yōu)點(diǎn)是因疲勞引起差錯(cuò)；而優(yōu)點(diǎn)是: :設(shè)備簡(jiǎn)單，投資少，設(shè)備簡(jiǎn)單，投資少，與自動(dòng)化基因擴(kuò)增儀相比，它無須升降溫過程，與自動(dòng)化基因擴(kuò)增儀相比，它無須升降溫過程，實(shí)驗(yàn)時(shí)

8、間短，試驗(yàn)更接近理想實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，試驗(yàn)更接近理想PCRPCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件。.10第二代：自動(dòng)化控制型第二代：自動(dòng)化控制型PCRPCR 使用廣泛及具有代表性，采用瓊脂糖電使用廣泛及具有代表性，采用瓊脂糖電泳的方式對(duì)泳的方式對(duì)PCRPCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，但存在著操產(chǎn)物進(jìn)行分析，但存在著操作繁瑣、只適用于定性研究、交叉污染風(fēng)作繁瑣、只適用于定性研究、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)大等不足。且無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，險(xiǎn)大等不足。且無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。.11第三代第三代PCRPCR：實(shí)時(shí)熒光定量：實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR為了避免上述傳統(tǒng)為了避免上述傳統(tǒng)PCRPCR的缺陷

9、，并對(duì)基因的的缺陷，并對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，19921992年誕生了所年誕生了所謂謂“第三代第三代PCRPCR的熒光定量實(shí)時(shí)的熒光定量實(shí)時(shí)PCRPCR。 所謂所謂real-time Q-PCRreal-time Q-PCR技術(shù)，是指在技術(shù)，是指在PCRPCR反反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)累應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCRPCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。.12第四代第四代PCRPCR：數(shù)字：數(shù)字PCRPCR 由于定量由于定量PCRPCR的分析最

10、終結(jié)果依賴于的分析最終結(jié)果依賴于CtCt值，在這個(gè)意義上所謂的值，在這個(gè)意義上所謂的“定量定量”也只是相對(duì)的。而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細(xì)微的條件下，也只是相對(duì)的。而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細(xì)微的條件下，其檢測(cè)的靈敏度、精確度都受到了限制。在這種背景下，其檢測(cè)的靈敏度、精確度都受到了限制。在這種背景下，“數(shù)字?jǐn)?shù)字 PCRPCR應(yīng)運(yùn)而生。應(yīng)運(yùn)而生。 數(shù)字?jǐn)?shù)字PCRPCR是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于實(shí)時(shí)熒光定量是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR，數(shù)，數(shù)字字PCRPCR可讓你能夠直接數(shù)出可讓你能夠直接數(shù)出DNADNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。分子的

11、個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。 因此特別適用于依靠因此特別適用于依靠CtCt值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測(cè)序結(jié)變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、果驗(yàn)證、miRNAmiRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。.13三、三、PCRPCR技術(shù)簡(jiǎn)介技術(shù)簡(jiǎn)介 高溫可以使雙鏈高溫可以使雙鏈DNADNA解鏈成為單鏈，解鏈成為單鏈，這一過程稱為變性。這一過程稱為變性。變性后的變性后的DNADNA通過降溫可以重新接通過降溫可以重新接合為雙鏈，這一

12、過程稱為復(fù)性。合為雙鏈，這一過程稱為復(fù)性。PCRPCR技術(shù)的基本原理類似于技術(shù)的基本原理類似于DNADNA的天的天然復(fù)制過程，它的特異性取決于與然復(fù)制過程，它的特異性取決于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。.14利用溫度的升降來控制利用溫度的升降來控制DNADNA的變性的變性和復(fù)性。和復(fù)性。設(shè)計(jì)引物作為啟動(dòng)序列，加入設(shè)計(jì)引物作為啟動(dòng)序列，加入DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP（三磷酸脫氧核甘酸）（三磷酸脫氧核甘酸）等原料完成特定基因的體外復(fù)制。等原料完成特定基因的體外復(fù)制。周而復(fù)始的升降溫度進(jìn)行擴(kuò)增，每周而復(fù)始的升降溫度進(jìn)行擴(kuò)增，每一循環(huán)可以使靶序列增加一

13、倍。一循環(huán)可以使靶序列增加一倍。 .15PCRPCR擴(kuò)增步驟擴(kuò)增步驟DNADNA變性（變性（90-9690-96）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈單鏈DNADNA。 退火（退火（25-6525-65）：系統(tǒng)溫度降）：系統(tǒng)溫度降低，引物與低，引物與DNADNA模板結(jié)合，形成局模板結(jié)合，形成局部雙鏈。部雙鏈。延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的酶的作用下，以作用下，以dNTPdNTP（三磷酸脫氧核甘（三磷酸脫氧核甘酸）為原料，從引物的酸）為原料，從引物的55端端33端端延伸，合成與模板互補(bǔ)的延伸，合成與模板互補(bǔ)的DN

14、ADNA鏈。鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNADNA的含量既增加一倍。的含量既增加一倍。 .16PCRPCR擴(kuò)增示意圖擴(kuò)增示意圖.173030次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824.18常用的技術(shù)常用的技術(shù)定性定性l電泳檢測(cè)、放射自顯影電泳檢測(cè)、放射自顯影l(fā)特異性差、易污染、只能定性特異性差、易污染、只能定性l特異性較好，極易污染、定量不特異性較好，極易污染、定量不準(zhǔn)確準(zhǔn)確終點(diǎn)法熒光終點(diǎn)

15、法熒光l特異性很好，不易污染，定量線特異性很好，不易污染，定量線性范圍小，重復(fù)性不好性范圍小，重復(fù)性不好實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)熒光l特異性很好，不易污染，線性寬特異性很好，不易污染，線性寬重復(fù)性較好重復(fù)性較好.19四、實(shí)時(shí)四、實(shí)時(shí)熒光熒光PCRPCR技術(shù)技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR：在：在PCRPCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCRPCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。定量分析的方法。 定量定量PCRPCR儀是在普通儀是在普通PCRPCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光

16、激發(fā)裝置和熒光檢儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測(cè)裝置，測(cè)裝置，PCRPCR擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，最終結(jié)果不需進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，最終結(jié)果不需進(jìn)行電泳檢測(cè)，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。所以有效地避免了樣品間的交叉污染。.20熒光熒光PCRPCR的原理的原理.21實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)熒光熒光PCRPCR常用的三個(gè)概念常用的三個(gè)概念擴(kuò)增曲線：反映擴(kuò)增曲線：反映PCRPCR循環(huán)次數(shù)和熒光循環(huán)次數(shù)和熒光強(qiáng)度的曲線，定量強(qiáng)度的曲線，定量PCRPCR儀每次儀每次PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增都會(huì)自動(dòng)記錄熒光強(qiáng)度的變化都會(huì)自動(dòng)記錄熒光強(qiáng)度的變化熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)

17、定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，儀器可自指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，儀器可自動(dòng)計(jì)算，手動(dòng)設(shè)置的原則要大于樣本動(dòng)計(jì)算，手動(dòng)設(shè)置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.990.99。CtCt值：值： PCR PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。.22實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)熒光熒光PCRPCR擴(kuò)增

18、曲線示意圖擴(kuò)增曲線示意圖.23手工調(diào)整熒光閾值示意圖手工調(diào)整熒光閾值示意圖 .24CtCt值的意義值的意義CtCt值與重復(fù)性值與重復(fù)性同一樣本在相同條件下同時(shí)進(jìn)行同一樣本在相同條件下同時(shí)進(jìn)行9696次次擴(kuò)增擴(kuò)增CtCt值與濃度值與濃度不同濃度的模板達(dá)到熒光域值時(shí)不同濃度的模板達(dá)到熒光域值時(shí)的的CtCt值不同值不同.25PCRPCR擴(kuò)增的理論模式擴(kuò)增的理論模式Y(jié)n=XYn=X* *(1+E)(1+E)n n ，0E10E1，E E為擴(kuò)增效率為擴(kuò)增效率,X,X為為原始模板數(shù)原始模板數(shù),Y,Y為為PCRPCR產(chǎn)物的分子數(shù)量產(chǎn)物的分子數(shù)量,n,n為周為周期數(shù)。期數(shù)。模板模板DNADNA量越多，熒光達(dá)到

19、域值的循環(huán)數(shù)越量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即少，即CtCt值越小。值越小。LogLog濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品品CtCt值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。.26標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 梯度稀釋后，標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線間距相等，標(biāo)準(zhǔn)曲線上的間距也相等，梯度稀釋后，標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線間距相等，標(biāo)準(zhǔn)曲線上的間距也相等，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的很成功，假如間距參差不齊，說明梯度稀釋時(shí)操作說明標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的很成功，假如間距參差不齊，說明梯度稀釋時(shí)操作誤差太大，建議重新做標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋，重新做標(biāo)準(zhǔn)曲線，直到擴(kuò)增誤差太大，建議重新做標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋，重新做標(biāo)準(zhǔn)曲線，直到擴(kuò)增曲線之間的間距相等為止。因?yàn)檫@一步直接影響著樣品中目的基因曲線之間的間距相等為止。因?yàn)檫@一步直接影響著樣品中目的基因原始模板量的準(zhǔn)確性。原始模板量的準(zhǔn)確性。.27實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR技術(shù)的特點(diǎn)技術(shù)的特點(diǎn)靈敏度高靈敏度高特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)快速簡(jiǎn)便快速簡(jiǎn)便應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣.28五、實(shí)時(shí)熒光五、實(shí)時(shí)熒光PCR